Determinazione della funzione ciliare e dell'impermeabilità della membrana dell'epitelio pseudostratificato delle vie aeree polmonari
21 febbraio 2025
La coltura dell'interfaccia aria-liquido è comunemente usata per sviluppare epitelio pseudostratificato delle vie aeree differenziando le cellule epiteliali bronchiali umane normali primarie che imitano il lato apicale delle vie aeree polmonari. Qui, descriviamo un semplice protocollo per determinarne la qualità monitorando le sue proprietà biofisiche, come la funzione ciliare e l'integrità della membrana.
La nostra ricerca mira a misurare due proprietà biofisiche critiche dell'epitelio pseudostratificato delle vie aeree, che possono essere ottenute differenziando cellule epiteliali bronchiali umane normali in un'interfaccia aria-liquido. Abbiamo identificato diverse caratteristiche di diversi virus respiratori utilizzando l'epitelio pseudostratificato delle vie aeree. Ad esempio, l'infiammazione citoscheletrica guidata dal virus respiratorio sinciziale, che è un meccanismo non canonico della bronchiolite.
Abbiamo anche identificato che l'iperplasia delle cellule caliciformi aumenta la replicazione di SARS-CoV-2 nell'epitelio delle vie aeree della broncopneumopatia cronica ostruttiva. Ci siamo concentrati sul chiarimento del meccanismo della modulazione della segnalazione citoscheletrica guidata dal virus respiratorio sinciziale per identificare nuovi bersagli terapeutici per combattere l'infezione da RSV e la bronchiolite indotta da virus. Per iniziare, assumere la normale sospensione di cellule epiteliali bronchiali umane, o NHBE.
Con una pipetta P200, aggiungere 50.000 cellule risospese in 200 microlitri di terreno epiteliale completo delle vie aeree, o AEC, sul lato apicale dell'inserto. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari di anidride carbonica umidificato dall'85% al 95%. Una volta che le cellule sono confluenti, trasferire gli inserti in un pozzetto vuoto utilizzando una pinza sterile.
Utilizzando una pipetta P1000, aspirare tutto il terreno AEC basale. Quindi, aggiungere 500 microlitri di terreno di differenziazione ALI completo fresco integrato con il 2% di penicillina-streptomicina e l'1% di amfotericina B nel pozzetto basale. Utilizzando una pinza sterile, trasferire gli inserti nel pozzetto basale con l'aggiunta del terreno ALI completo.
Con una pipetta P200, aspirare delicatamente il terreno AEC apicale dal pozzetto e incubarlo. Dopo 48 ore, trasferire gli inserti in un pozzetto vuoto con una pinza sterile. Utilizzando una pipetta P1000, aspirare il vecchio terreno e aggiungere 500 microlitri di terreno ALI completo fresco.
Riposizionare gli inserti nel pozzetto con terreno fresco utilizzando una pinza sterile. Il giorno 26, utilizzando una pipetta P200, aggiungere 100 microlitri di DPBS sul lato apicale degli inserti. Incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari umidificato per 30 minuti.
Quindi, aspirare il DPBS utilizzando una pipetta P200. Per iniziare, accendi il microscopio, il computer collegato e la camera dell'ambiente. Aprire lo sportello della camera e posizionare la piastra contenente gli inserti con le cellule NBHE sul tavolino del microscopio.
Una volta che la piastra è sul tavolino, chiudere la camera. Quindi, utilizzare la manopola di comando del tavolino del microscopio per spostare la piastra e portare gli inserti in vista. Sullo schermo del computer, fare clic sull'icona del sistema SAVA per aprire il programma SAVA.
Nell'interfaccia del software, fare clic su Configura esperimento. Nella scheda successiva, fai clic su Crea esperimento. Quindi, nella nuova scheda, inserisci la directory in cui verranno archiviati i dati nel campo Inserisci nome directory esperimento e fornisci i dettagli nel campo Inserisci descrizione esperimento, quindi fai clic su OK. Ora, fai clic sull'esperimento che è stato creato e viene mostrato nella directory nella sezione Esperimenti.
Successivamente, fai clic su Modifica e fornisci i dettagli del campione nel campo Descrizione del campione. Fai clic su Aggiungi, quindi fai clic su Esci per uscire dalla scheda. Nell'interfaccia principale del software, seleziona l'esperimento creato dal menu a discesa nello slot Esperimento.
Quindi, fai clic su Registra video per monitorare la frequenza del battito ciliare sullo schermo del computer. Lo schermo mostrerà il movimento ciliare focalizzato. Per ogni inserto, registra sei diversi campi casuali per 2,1 secondi a 120 fotogrammi al secondo.
Fare clic su Salva video per monitorare i dati sulla frequenza del battito ciliare. Per analizzare i dati, fare clic su Analizza video nell'interfaccia del software. E nella scheda successiva, fai clic su OK. Quindi vai alla scheda seguente e fai clic su Analizza tutto.
Scarica il foglio di calcolo generato per ogni esperimento nella cartella SAVA Data Acquisition del computer. Prendi la frequenza media gaussiana per la presentazione dei dati. La frequenza del battito ciliare ha raggiunto almeno tre hertz sia per l'epitelio delle vie aeree di adulti sani che di quelli con BPCO, mostrando una funzione ciliare comparabile.
Per iniziare, accendere l'ohmmetro a volt EVOM2 utilizzando l'interruttore di alimentazione. Collegare la resistenza di prova all'EVOM2 nello slot di ingresso. Monitorare la lettura sullo schermo EVOM2.
Se la lettura è superiore o inferiore a 1.000, ruotare l'interruttore ADJ sull'EVOM2 utilizzando una pinza fino a quando non mostra una lettura uniforme di 1.000 per calibrare il dispositivo. Ora, prendi un inserto vuoto per la lettura del controllo sperimentale. Utilizzando una pipetta P200, aggiungere 100 microlitri di DPBS sul lato apicale dell'inserto vuoto.
Quindi, aggiungere 500 microlitri di DPBS sul lato basale con una pipetta P1000. Successivamente, scollegare la resistenza di prova e collegare l'elettrodo STX2 allo slot di ingresso sull'EVOM2. Quindi, pulire delicatamente l'elettrodo STX2 con etanolo al 70%.
Inserire l'elettrodo STX2 nell'inserto vuoto con DPBS, mantenendo la gamba dell'elettrodo più corta sulla parte apicale e la gamba dell'elettrodo più lunga sulla parte basale. Ora, registra la lettura stabile sullo schermo EVOM2. Successivamente, utilizzando una pipetta P200, aggiungere 100 microlitri di DPBS sul lato apicale dell'inserto.
Inserire l'elettrodo STX2 nell'inserto con l'epitelio differenziato delle vie aeree a 26 giorni, come mostrato in precedenza. Quindi, registrare la lettura stabile sullo schermo EVOM2. I valori di resistenza elettrica transepiteliale sono aumentati negli adulti con BPCO, indicando una maggiore impermeabilità della membrana nella BPCO.
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Panoramica
Questo studio si concentra sullo sviluppo di un epitelio delle vie aeree pseudostratificato utilizzando cellule epiteliali bronchiali umane normali differenziate in un'interfaccia aria-liquido (ALI). La ricerca evidenzia un metodo per valutare la qualità di questo modello epiteliale monitorando le sue proprietà biofisiche, in particolare la funzione ciliare e l'integrità della membrana, che sono critiche per comprendere le infezioni virali respiratorie.
Componenti principali dello studio
Area di ricerca
- Epitelio delle vie aeree pseudostratificato
- Virus respiratori
- Bronchiolite e complicazioni della BPCO
Sfondo
- La cultura interfaccia aria-liquido imita le caratteristiche delle vie aeree polmonari.
- Il virus respiratorio sinciziale (RSV) mostra meccanismi infiammatori non canonici.
- L'iperplasia delle cellule calicifomi e il suo impatto sulla replicazione del SARS-CoV-2.
Metodi utilizzati
- Protocolli di differenziazione cellulare e tecniche di monitoraggio
- Cellule epiteliali bronchiali umane normali (NHBE)
- Videomicroscopia per valutare la frequenza dei battiti ciliari; resistenza elettrica transepiteliale per l'integrità della membrana
Principali risultati
- La frequenza dei battiti ciliari ha raggiunto tre hertz sia negli adulti sani che nei pazienti con BPCO, indicando una funzione ciliare comparabile.
- I valori di resistenza transepiteliale suggeriscono una maggiore impermeabilità della membrana nella BPCO.
- È stata identificata la modulazione del citoscheletro guidata da RSV e le sue implicazioni per il targeting terapeutico.
Conclusioni
- Lo studio stabilisce con successo un metodo affidabile per valutare le colture epiteliali delle vie aeree.
- I risultati forniscono informazioni essenziali sulla fisiopatologia delle infezioni virali respiratorie e le loro implicazioni in condizioni croniche come la BPCO.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of ciliary function and membrane impermeability in pseudostratified airway epithelium provides critical quality control for preclinical respiratory models. These biophysical readouts underpin predictive confidence in disease-relevant systems for respiratory virus research and therapeutic target validation. Reliable measurement of ciliary beat frequency and transepithelial resistance supports risk-adjusted advancement of airway models across discovery and translational pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of airway epithelial models for respiratory disease research.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying ciliary activity and barrier integrity.
- Facilitates identification of novel therapeutic targets through disease-relevant phenotyping.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible metrics for assay readiness in airway models.
- Delivers quantitative outputs (CBF, TEER) essential for compound screening workflows.
- Ensures biological system quality for reliable downstream evaluation of antiviral agents.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro airway models with disease-relevant endpoints for translational continuity.
- Enables comparative studies of healthy and diseased epithelium, supporting biomarker development.
- Reduces translational risk by validating model integrity prior to preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method anchors airway model qualification from early discovery through preclinical research, supporting both target validation and screening inflection points.
- Discovery Biology: Quantitative CBF and TEER measurements clarify functional status and biological relevance of airway models.
- Screening: Standardized outputs enable reproducible assay development and compound evaluation.
- Analytics: High-speed video and volt-ohm readouts provide objective, comparable data across conditions.
- Translational Research: Disease-relevant measurements support alignment with clinical endpoints and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: The protocol establishes a reusable platform for respiratory virus and airway disease research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in airway disease models.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible quality control metrics.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by ensuring model reliability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of respiratory research programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in airway epithelial cell culture and differentiation.
- Needs access to high-speed videomicroscopy and volt-ohm instrumentation.
- Demands cross-team standardization of measurement protocols and data analysis.
- Adaptation may be needed for different donor sources or disease models.
- Dependent on consistent cell quality and environmental control for reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:10
Establishing Air Liquid Interface (ALI) Culture to Develop Pseudostratified Airway Epithelium
3:07
Determination of Ciliary Beat Frequency of the Airway Epithelium Obtained from Differentiating Primary NHBE Cells
5:37
Quantification of Transepithelial Electrical Resistance of Air Liquid Interface‐Cultured Pseudostratified Airway Epithelium
