Determinazione della funzione ciliare e dell'impermeabilità della membrana dell'epitelio pseudostratificato delle vie aeree polmonari

La nostra ricerca mira a misurare due proprietà biofisiche critiche dell'epitelio pseudostratificato delle vie aeree, che possono essere ottenute differenziando cellule epiteliali bronchiali umane normali in un'interfaccia aria-liquido. Abbiamo identificato diverse caratteristiche di diversi virus respiratori utilizzando l'epitelio pseudostratificato delle vie aeree. Ad esempio, l'infiammazione citoscheletrica guidata dal virus respiratorio sinciziale, che è un meccanismo non canonico della bronchiolite.

Abbiamo anche identificato che l'iperplasia delle cellule caliciformi aumenta la replicazione di SARS-CoV-2 nell'epitelio delle vie aeree della broncopneumopatia cronica ostruttiva. Ci siamo concentrati sul chiarimento del meccanismo della modulazione della segnalazione citoscheletrica guidata dal virus respiratorio sinciziale per identificare nuovi bersagli terapeutici per combattere l'infezione da RSV e la bronchiolite indotta da virus. Per iniziare, assumere la normale sospensione di cellule epiteliali bronchiali umane, o NHBE.

Con una pipetta P200, aggiungere 50.000 cellule risospese in 200 microlitri di terreno epiteliale completo delle vie aeree, o AEC, sul lato apicale dell'inserto. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari di anidride carbonica umidificato dall'85% al 95%. Una volta che le cellule sono confluenti, trasferire gli inserti in un pozzetto vuoto utilizzando una pinza sterile.

Utilizzando una pipetta P1000, aspirare tutto il terreno AEC basale. Quindi, aggiungere 500 microlitri di terreno di differenziazione ALI completo fresco integrato con il 2% di penicillina-streptomicina e l'1% di amfotericina B nel pozzetto basale. Utilizzando una pinza sterile, trasferire gli inserti nel pozzetto basale con l'aggiunta del terreno ALI completo.

Con una pipetta P200, aspirare delicatamente il terreno AEC apicale dal pozzetto e incubarlo. Dopo 48 ore, trasferire gli inserti in un pozzetto vuoto con una pinza sterile. Utilizzando una pipetta P1000, aspirare il vecchio terreno e aggiungere 500 microlitri di terreno ALI completo fresco.

Riposizionare gli inserti nel pozzetto con terreno fresco utilizzando una pinza sterile. Il giorno 26, utilizzando una pipetta P200, aggiungere 100 microlitri di DPBS sul lato apicale degli inserti. Incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari umidificato per 30 minuti.

Quindi, aspirare il DPBS utilizzando una pipetta P200. Per iniziare, accendi il microscopio, il computer collegato e la camera dell'ambiente. Aprire lo sportello della camera e posizionare la piastra contenente gli inserti con le cellule NBHE sul tavolino del microscopio.

Una volta che la piastra è sul tavolino, chiudere la camera. Quindi, utilizzare la manopola di comando del tavolino del microscopio per spostare la piastra e portare gli inserti in vista. Sullo schermo del computer, fare clic sull'icona del sistema SAVA per aprire il programma SAVA.

Nell'interfaccia del software, fare clic su Configura esperimento. Nella scheda successiva, fai clic su Crea esperimento. Quindi, nella nuova scheda, inserisci la directory in cui verranno archiviati i dati nel campo Inserisci nome directory esperimento e fornisci i dettagli nel campo Inserisci descrizione esperimento, quindi fai clic su OK. Ora, fai clic sull'esperimento che è stato creato e viene mostrato nella directory nella sezione Esperimenti.

Successivamente, fai clic su Modifica e fornisci i dettagli del campione nel campo Descrizione del campione. Fai clic su Aggiungi, quindi fai clic su Esci per uscire dalla scheda. Nell'interfaccia principale del software, seleziona l'esperimento creato dal menu a discesa nello slot Esperimento.

Quindi, fai clic su Registra video per monitorare la frequenza del battito ciliare sullo schermo del computer. Lo schermo mostrerà il movimento ciliare focalizzato. Per ogni inserto, registra sei diversi campi casuali per 2,1 secondi a 120 fotogrammi al secondo.

Fare clic su Salva video per monitorare i dati sulla frequenza del battito ciliare. Per analizzare i dati, fare clic su Analizza video nell'interfaccia del software. E nella scheda successiva, fai clic su OK. Quindi vai alla scheda seguente e fai clic su Analizza tutto.

Scarica il foglio di calcolo generato per ogni esperimento nella cartella SAVA Data Acquisition del computer. Prendi la frequenza media gaussiana per la presentazione dei dati. La frequenza del battito ciliare ha raggiunto almeno tre hertz sia per l'epitelio delle vie aeree di adulti sani che di quelli con BPCO, mostrando una funzione ciliare comparabile.

Per iniziare, accendere l'ohmmetro a volt EVOM2 utilizzando l'interruttore di alimentazione. Collegare la resistenza di prova all'EVOM2 nello slot di ingresso. Monitorare la lettura sullo schermo EVOM2.

Se la lettura è superiore o inferiore a 1.000, ruotare l'interruttore ADJ sull'EVOM2 utilizzando una pinza fino a quando non mostra una lettura uniforme di 1.000 per calibrare il dispositivo. Ora, prendi un inserto vuoto per la lettura del controllo sperimentale. Utilizzando una pipetta P200, aggiungere 100 microlitri di DPBS sul lato apicale dell'inserto vuoto.

Quindi, aggiungere 500 microlitri di DPBS sul lato basale con una pipetta P1000. Successivamente, scollegare la resistenza di prova e collegare l'elettrodo STX2 allo slot di ingresso sull'EVOM2. Quindi, pulire delicatamente l'elettrodo STX2 con etanolo al 70%.

Inserire l'elettrodo STX2 nell'inserto vuoto con DPBS, mantenendo la gamba dell'elettrodo più corta sulla parte apicale e la gamba dell'elettrodo più lunga sulla parte basale. Ora, registra la lettura stabile sullo schermo EVOM2. Successivamente, utilizzando una pipetta P200, aggiungere 100 microlitri di DPBS sul lato apicale dell'inserto.

Inserire l'elettrodo STX2 nell'inserto con l'epitelio differenziato delle vie aeree a 26 giorni, come mostrato in precedenza. Quindi, registrare la lettura stabile sullo schermo EVOM2. I valori di resistenza elettrica transepiteliale sono aumentati negli adulti con BPCO, indicando una maggiore impermeabilità della membrana nella BPCO.