Name: Rilevamento di rotture del DNA nelle cellule umane in divisione mediante saggio della cometa neutra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Scopri come rilevare rotture del DNA in cellule umane in divisione mediante saggio della cometa neutra. Questo metodo valuta i danni durante la replicazione e il ruolo del remodelatore cromatinico SNF2L.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo i membri del laboratorio di Dungrawala per il loro contributo e feedback. Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione NIH R35GM137800 alla MH.

Questo protocollo (Figura 1) utilizza principalmente linee cellulari tumorali U2OS aderenti, ma è adattabile a un'ampia varietà di cellule aderenti e in sospensione coltivate in coltura tissutale. Le soluzioni e i tamponi utilizzati in questo studio sono descritti in dettaglio nella Tabella 1. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Preparazione dei materiali
<ol><li>Prima del giorno dell'esperimento, mettere il flacone fornito con agarosio a basso punto di fusione (1% di agarosio a basso punto di fusione in PBS) in un bagno di acqua calda per 5-10 minuti per assicurarsi che l'agarosio si sia completamente sciolto. NOTA: Non riscaldare la bottiglia nel microonde.</li>
	<li>Una volta fuso, aliquotare rapidamente 100 μL di agarosio in provette da centrifuga da 1,5 mL secondo necessità e conservare le provette a 4 °C. L'agarosio solidificato può essere conservato a 4 °C per un massimo di 1 anno.</li>
	<li>Il giorno dell'esperimento, rimuovere il numero richiesto di provette da centrifuga dalla conservazione a 4 °C. Sciogliere l'agarosio ponendo i tubi in un blocco termico o in un bagno d'acqua a 42 °C. NOTA: Posizionare le provette a 42 °C prima di prelevare le cellule per assicurarsi che l'agarosio sia completamente fuso per la risospensione (passaggio 3.7).</li>
	<li>Preparare il tampone di lisi fresco e il tampone TAE il giorno dell'esperimento e conservarli rispettivamente a temperatura ambiente e a 4 °C fino al momento dell'uso. Inoltre, aliquotare 1x PBS in provetta conica da 15 mL e metterlo in frigorifero per utilizzarlo nella fase di risospensione (passaggio 3.5).</li>
	<li>Contrassegnare le identificazioni dei campioni sull'estremità smerigliata dei vetrini a 2 pozzetti e conservarli a temperatura ambiente fino al momento dell'uso.</li>
</ol>2. Preparazione dei campioni
<ol><li>Prima del giorno dell'esperimento, seminare le cellule in una piastra a 6 pozzetti e coltivare per una notte a 37 °C con il 5% di CO2. Per le cellule U2OS, sono state seminate circa 2-3 x 105 cellule per ogni campione. NOTA: Potrebbe essere necessario regolare i numeri di cella a seconda del tipo di cella utilizzato per le analisi.</li>
	<li>Il giorno dell'esperimento, trattare le cellule con le condizioni previste dal disegno sperimentale. Come controllo positivo per dimostrare l'induzione della rottura dipendente dalla replicazione, trattare le cellule con 1 μM di CPT per 1 ora. CPT è un inibitore della topoisomerasi-1 che induce rotture a doppio filamento in modo dipendente dalla replicazione14.</li>
</ol>3. Risospensione e lisi cellulare
<ol><li>Aspirare i terreni di coltura cellulare e risciacquare due volte con 1x PBS.</li>
	<li>Aggiungere 300 μL di tripsina a ciascun pozzetto. Incubare la piastra in un incubatore di coltura tissutale per 2-3 minuti. NOTA: L'incubazione prolungata nella tripsina può generare risultati spuri durante le analisi delle comete.</li>
	<li>Aggiungere 700 μl di terreno di coltura cellulare in ciascun pozzetto. Risospendere delicatamente e trasferire i campioni in provette da centrifuga da 1,5 mL. NOTA: Si consiglia di contare le cellule in questa fase per ottenere la densità appropriata delle celle nella fase 3.6 per ridurre la frequenza delle code sovrapposte durante l'analisi.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione in cella a 2400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspirare il terreno e risospendere le cellule in 1 mL di PBS freddo.</li>
	<li>Ripetere due volte i passaggi 3.4 e 3.5 e risospendere le cellule in 1x PBS freddo a una densità cellulare di 2 x 105 cellule per ml. NOTA: Si raccomanda di valutare la vitalità cellulare in questa fase per garantire la presenza di un numero adeguato di cellule vitali. Si raccomanda una vitalità di almeno il 90%.</li>
	<li>Risospendere 10 μl della sospensione cellulare in 100 μl di aliquota di agarosio fuso e, utilizzando lo stesso puntale della pipetta, mescolare delicatamente e distribuire uniformemente la miscela in un pozzetto del vetrino. Ripetere questo passaggio per tutti i campioni in base alle esigenze. NOTA: Evitare di rimuovere tutte le aliquote dal bagnomaria a 42 °C in una sola volta per evitare che l'agarosio si solidifichi. Questo passaggio deve essere eseguito preferibilmente a bagnomaria e ogni campione viene risospeso e distribuito in modo scaglionato. Evitare di introdurre bolle durante la diffusione dell'agarosio sul vetrino poiché le sacche d'aria influenzeranno la migrazione delle code di cometa durante l'elettroforesi (passaggio 4.5) e introdurranno crepe nella fase di essiccazione (passaggio 5.3)</li>
	<li>Conservare i vetrini a 4 °C al buio per 15-20 minuti per assicurarsi che l'agarosio si sia completamente solidificato (Figura 2A).</li>
	<li>Posizionare i vetrini nei barattoli Coplin e immergerli nel tampone di lisi per 1 ora a temperatura ambiente.</li>
	<li>Sciacquare una volta i vetrini con tampone TAE freddo e immergerli in tampone TAE freddo per 30 minuti a 4 °C.</li>
</ol>4. Elettroforesi
<ol><li>Posizionare la camera elettroforetica su una superficie piana e livellare il sistema utilizzando le quattro manopole di livellamento sui bordi dell'apparato. Inserire gli impacchi freddi nella camera inferiore per mantenere la soluzione fredda durante l'elettroforesi.</li>
	<li>Versare circa ~850 mL di tampone TAE 1x freddo nell'apparato.</li>
	<li>Rimuovere i vetrini da 4 °C e posizionarli sul vassoio per elettroforesi con l'orientamento corretto per consentire la migrazione del DNA rotto. NOTA: Il vassoio contiene dieci vetrini a 2 pozzetti. Posizionare i vetrini al centro del vassoio se si lavora con un numero inferiore di campioni. Se si lavora con un numero dispari di diapositive, includere una diapositiva vuota in modo che ciascuna possa contenere 2 diapositive.</li>
	<li>Posizionare delicatamente il vassoio per vetrini in dotazione sopra il vassoio per coprire i vetrini. NOTA: Per il corretto funzionamento dell'apparecchio, il volume del tampone TAE non deve essere inferiore alla superficie inferiore del rivestimento e non deve superare la superficie superiore del rivestimento.</li>
	<li>Dopo aver collegato i cavi, impostare l'alimentazione a 21 V ed eseguire l'elettroforesi (1 V/cm) per 40 min. NOTA: Potrebbe essere necessario regolare il tempo di elettroforesi a seconda del tipo di cella utilizzata per le analisi. Code lunghe nei campioni non trattati indicano un'autonomia eccessiva. Al contrario, le code corte nei campioni di controllo positivo possono riflettere un tempo di esecuzione insufficiente.</li>
</ol>5. Colorazione
<ol><li>Dopo il completamento dell'elettroforesi, rimuovere i vetrini dall'apparecchio e immergerli in una soluzione di precipitazione del DNA per 30 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Scartare la soluzione di precipitazione del DNA e immergere i vetrini in una soluzione di etanolo al 70% per 30 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Scartare la soluzione di etanolo al 70%. Rimuovere i vetrini e asciugarli in un forno di ibridazione a 45 °C per 30 minuti al buio (Figura 2B). NOTA: I vetrini possono essere lasciati in un luogo buio e asciutto durante la notte per la fase di asciugatura.</li>
	<li>Incubare i pozzetti con 100 μl di 1x soluzione SYBR Green per 30 minuti a temperatura ambiente al buio.</li>
	<li>Decantare la soluzione SYBR Green inclinando i vetrini e rimuovendo l'eccesso tamponando delicatamente il bordo del pozzetto con un panno privo di lanugine.</li>
	<li>Mettere i vetrini in un cassetto e lasciare asciugare per 30 minuti.</li>
	<li>Procedere con l'imaging dei vetrini.</li>
</ol>6. Imaging e analisi
<ol><li>Configurare il microscopio per scopi di imaging. NOTA: Tutte le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio a epifluorescenza. È stato utilizzato un ingrandimento 10x con apertura numerica di 0,45 con un tempo di esposizione di 1/40 di secondo e un guadagno di +6 dB. La modalità di acquisizione monocromatica a 8 bit è stata utilizzata con binning 2 x 2 e correzione del bilanciamento del nero.</li>
	<li>Posizionare i vetrini sul tavolino del microscopio e iniziare l'imaging utilizzando il filtro FITC. NOTA: Utilizzare prima il campione non trattato per testare il tempo di esposizione. La maggior parte delle cellule non presenta code di cometa poiché il DNA è più compatto. Passare al pozzetto con cellule trattate con CPT e ottenere l'immagine utilizzando lo stesso tempo di esposizione. In questo campione si osserveranno code di comete con lunghezze maggiori a causa della migrazione delle estremità del DNA rotte.</li>
	<li>Acquisire immagini per almeno 100 comete per campione utilizzando lo stesso tempo di esposizione in tre repliche tecniche. NOTA: Le code delle comete alla fine dei vetrini coprioggetti tendono a migrare in modo non uniforme e ad agire come valori anomali nella distribuzione del campione. La maggior parte delle comete catturate per le analisi sono presenti vicino al centro del vetrino coprioggetti (Figura 3).</li>
	<li>Esporta le immagini e assegna un punteggio alle comete manualmente (utilizzando l'immagine J) o utilizzando il software di punteggio delle comete disponibile gratuitamente. Le comete che sono distinguibili individualmente e completamente contenute nel campo visivo vengono selezionate per il punteggio. Le comete sovrapposte o parzialmente visibili non sono prese in considerazione per ulteriori analisi (Figura 4). NOTA: Gli utenti possono segnare le comete sull'immagine J utilizzando il seguente plugin: https://cometbio.org/index.html. I dettagli per il punteggio delle comete utilizzando il software CometScore sono inclusi nella Figura 5.</li>
	<li>Tracciare i momenti di coda acquisiti dalle analisi come grafici a scatola e baffi che raffigurano valori percentili 10-90. Eseguire test di normalità per determinare se i test parametrici o non parametrici devono essere utilizzati per le analisi statistiche. NOTA: Nella maggior parte dei casi, i test non parametrici vengono applicati utilizzando il test di Mann-Whitney se si confrontano solo due campioni o il test di Kruskal-Wallis con i confronti multipli di Dunn se si confrontano tre o più campioni.</li>
</ol>

Indagine sull'entità delle rotture del DNA che si verificano durante la replicazione del DNA 

<ol><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+as+a+requirement+for+development+of+the+contact+effect+in+Chinese+hamster+v79+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation as a requirement for development of the contact effect in Chinese hamster v79 spheroids.</a> Radiat Res. 117 (1), 79-92 (1989).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+radiation-induced+DNA+damage+and+repair+in+tumor+and+normal+cells+measured+using+the+%26%2334%3Bcomet%26%2334%3B+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the &#34;comet&#34; assay.</a> Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).</li>
<li>Singh, N. P., Mccoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+A+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).</li>
<li>De Lapuente, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+and+its+applications+in+the+field+of+ecotoxicology%3A+A+mature+tool+that+continues+to+expand+its+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">The comet assay and its applications in the field of ecotoxicology: A mature tool that continues to expand its perspectives.</a> Front Genet. 6, 180(2015).</li>
<li>Azqueta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+comet+assay+in+human+biomonitoring%3A+An+hcomet+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+Rev+Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Application of the comet assay in human biomonitoring: An hcomet perspective.</a> Mutat Res Rev Mutat Res. 783, 108288(2020).</li>
<li>Speit, G., Hartmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+A+sensitive+genotoxicity+test+for+the+detection+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The comet assay: A sensitive genotoxicity test for the detection of DNA damage.</a> Methods Mol Biol. 291, 85-95 (2005).</li>
<li>Collins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+DNA+modifications+with+the+comet+assay%3A+A+compendium+of+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring DNA modifications with the comet assay: A compendium of protocols.</a> Nat Protoc. 18 (3), 929-989 (2023).</li>
<li>Rapp, A., Hausmann, M., Greulich, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet-fish+technique%3A+A+tool+for+detection+of+specific+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The comet-fish technique: A tool for detection of specific DNA damage and repair.</a> Methods Mol Biol. 291, 107-119 (2005).</li>
<li>Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+kinase+atr%3A+Ensuring+faithful+duplication+of+a+challenging+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The essential kinase atr: Ensuring faithful duplication of a challenging genome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (10), 622-636 (2017).</li>
<li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atr%3A+An+essential+regulator+of+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Atr: An essential regulator of genome integrity.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li>
<li>Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-coupled+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Replication-coupled DNA repair.</a> Mol Cell. 74 (5), 866-876 (2019).</li>
<li>Strumberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+topoisomerase+I+cleavage+complexes+on+the+leading+strand+of+ribosomal+DNA+into+5%27-phosphorylated+DNA+double-strand+breaks+by+replication+runoff%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Conversion of topoisomerase I cleavage complexes on the leading strand of ribosomal DNA into 5'-phosphorylated DNA double-strand breaks by replication runoff.</a> Mol Cell Biol. 20 (11), 3977-3987 (2000).</li>
<li>Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+I+inhibitors%3A+Camptothecins+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase I inhibitors: Camptothecins and beyond.</a> Nat Rev Cancer. 6 (10), 789-802 (2006).</li>
<li>Hsiang, Y. H., Hertzberg, R., Hecht, S., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Camptothecin+induces+protein-linked+DNA+breaks+via+mammalian+DNA+topoisomerase+i%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Camptothecin induces protein-linked DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase i.</a> J Biol Chem. 260 (27), 14873-14878 (1985).</li>
<li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+killing+of+brca2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly%28adp-ribose%29+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific killing of brca2-deficient tumours with inhibitors of poly(adp-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li>
<li>Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+underlying+mechanism+for+the+parp+and+BRCA+synthetic+lethality%3A+Clearing+up+the+misunderstandings%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The underlying mechanism for the parp and BRCA synthetic lethality: Clearing up the misunderstandings.</a> Mol Oncol. 5 (4), 387-393 (2011).</li>
<li>Mcglynn, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bromodeoxyuridine+comet+assay%3A+Detection+of+maturation+of+recently+replicated+DNA+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The bromodeoxyuridine comet assay: Detection of maturation of recently replicated DNA in individual cells.</a> Cancer Res. 59 (23), 5912-5916 (1999).</li>
<li>Morocz, M., Gali, H., Rasko, I., Downes, C. S., Haracska, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+human+rad18-dependent+DNA+post-replication+repair+by+alkaline+bromodeoxyuridine+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of human rad18-dependent DNA post-replication repair by alkaline bromodeoxyuridine comet assay.</a> PLoS One. 8 (8), e70391(2013).</li>
<li>Thakar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lagging+strand+gap+suppression+connects+BRCA-mediated+fork+protection+to+nucleosome+assembly+through+PCNA-dependent+CAF-1+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lagging strand gap suppression connects BRCA-mediated fork protection to nucleosome assembly through PCNA-dependent CAF-1 recycling.</a> Nat Commun. 13 (1), 5323(2022).</li>
<li>Vaitsiankova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parp+inhibition+impedes+the+maturation+of+nascent+DNA+strands+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Parp inhibition impedes the maturation of nascent DNA strands during DNA replication.</a> Nat Struct Mol Biol. 29 (4), 329-338 (2022).</li>
<li>Dungrawala, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radx+promotes+genome+stability+and+modulates+chemosensitivity+by+regulating+rad51+at+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Radx promotes genome stability and modulates chemosensitivity by regulating rad51 at replication forks.</a> Mol Cell. 67 (3), 374-386.e5 (2017).</li>
<li>Townsend, A., Lora, G., Engel, J., Tirado-Class, N., Dungrawala, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dcaf14+promotes+stalled+fork+stability+to+maintain+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dcaf14 promotes stalled fork stability to maintain genome integrity.</a> Cell Rep. 34 (4), 108669(2021).</li>
<li>Lemacon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mre11+and+exo1+nucleases+degrade+reversed+forks+and+elicit+mus81-dependent+fork+rescue+in+brca2-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mre11 and exo1 nucleases degrade reversed forks and elicit mus81-dependent fork rescue in brca2-deficient cells.</a> Nat Commun. 8 (1), 860(2017).</li>
<li>Leung, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atr+protects+ongoing+and+newly+assembled+DNA+replication+forks+through+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Atr protects ongoing and newly assembled DNA replication forks through distinct mechanisms.</a> Cell Rep. 42 (7), 112792(2023).</li>
<li>Bhowmick, R., Mehta, K. P. M., Lerdrup, M., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrator+facilitates+RNApii+removal+to+prevent+transcription-replication+collisions+and+genome+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrator facilitates RNApii removal to prevent transcription-replication collisions and genome instability.</a> Mol Cell. 83 (13), 2357-2366.e8 (2023).</li>
<li>Mosler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-loop+proximity+proteomics+identifies+a+role+of+ddx41+in+transcription-associated+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">R-loop proximity proteomics identifies a role of ddx41 in transcription-associated genomic instability.</a> Nat Commun. 12 (1), 7314(2021).</li>
<li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+rad51-mediated+pathways+for+restart+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different rad51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol Cell. 37 (4), 492-502 (2010).</li>
<li>Sestili, P., Cantoni, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotically+driven+radial+diffusion+of+single-stranded+DNA+fragments+on+an+agarose+bed+as+a+convenient+measure+of+DNA+strand+scission%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Osmotically driven radial diffusion of single-stranded DNA fragments on an agarose bed as a convenient measure of DNA strand scission.</a> Free Radic Biol Med. 26 (7-8), 1019-1026 (1999).</li>
<li>Sestili, P., Martinelli, C., Stocchi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fast+halo+assay%3A+An+improved+method+to+quantify+genomic+DNA+strand+breakage+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">The fast halo assay: An improved method to quantify genomic DNA strand breakage at the single-cell level.</a> Mutat Res. 607 (2), 205-214 (2006).</li>
<li>Gorczyca, W., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+strand+breaks+in+individual+apoptotic+cells+by+the+in+situ+terminal+deoxynucleotidyl+transferase+and+nick+translation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays.</a> Cancer Res. 53 (8), 1945-1951 (1993).</li>
<li>Hanada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure-specific+endonuclease+mus81+contributes+to+replication+restart+by+generating+double-strand+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The structure-specific endonuclease mus81 contributes to replication restart by generating double-strand DNA breaks.</a> Nat Struct Mol Biol. 14 (11), 1096-1104 (2007).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Questo protocollo delinea un saggio NC per valutare le rotture del DNA nelle cellule umane sottoposte a replicazione attiva. Il protocollo è relativamente semplice da eseguire e i ricercatori possono adattarlo facilmente a condizioni di pH elevato per le analisi alcaline8. Include due passaggi critici, come descritto nei passaggi 3.7 e 4.5. Nella fase 3.7, è essenziale diffondere uniformemente l'agarosio fuso con le cellule attraverso il pozzetto per evitare che le comete si sovrappongano durante l'analisi. Assicurarsi che gli aggregati cellulari siano disciolti prima di risospendere le cellule nell'agarosio. Prevenire il rilascio del puntale della pipetta durante la diffusione dell'agarosio aiuterà a ridurre al minimo l'introduzione di bolle. Le condizioni per l'elettroforesi sono cruciali per ottenere un'appropriata migrazione della coda di cometa per l'imaging e l'analisi. I ricercatori dovrebbero considerare la natura delle linee cellulari utilizzate per l'analisi, poiché l'entità della migrazione della coda e la percentuale di cellule che presentano code di cometa variano tra i tipi di cellule (Figura 9). Pertanto, si consiglia di determinare empiricamente il tempo di esecuzione dell'elettroforesi prima della sperimentazione.
Se non si osservano code di cometa nei campioni di controllo positivi (cellule trattate con CPT), l'efficacia del farmaco deve essere corroborata in parallelo utilizzando approcci alternativi, come l'immunocolorazione per il marcatore di danno al DNA γH2AX. Un'ampia migrazione della coda può precludere l'analisi dell'induzione della rottura. Ridurre al minimo il tempo di elettroforesi e valutare la morfologia cellulare prima dell'analisi può evitare di ottenere code di cometa troppo lunghe. Un'asciugatura insufficiente dei vetrini può causare immagini sfocate e nebbiose delle comete. Assicurarsi che l'agarosio sul vetrino della cometa sia uniformemente asciutto e appiattito prima di colorarlo con la soluzione 1x SYBR. Se l'intervallo di induzione del fold è ristretto, l'esecuzione di una curva dose-risposta con CPT può aiutare a determinare un intervallo di lavoro ottimale per scopi sperimentali. L'applicazione di questi suggerimenti per la risoluzione dei problemi aiuterà a massimizzare i risultati di questi test.
Questa metodologia di analisi è economica e altamente sensibile rispetto ad altre tecniche utilizzate per studiare l'induzione della rottura del DNA, come il saggio Halo29,30, il saggio TUNEL31 e l'elettroforesi su gel a campo pulsato32. Tuttavia, l'attuale tecnica di analisi presenta alcune limitazioni. Non fornisce un numero preciso di lesioni al DNA, ma offre una stima relativa dell'accumulo di rotture rispetto alle cellule non danneggiate. Inoltre, non è in grado di valutare l'induzione della rottura che si verifica in modo dipendente dal ciclo cellulare. Per escludere cambiamenti nell'induzione della rottura dovuti a differenze nella progressione del ciclo cellulare, le analisi del ciclo cellulare mediante citometria a flusso devono essere eseguite in parallelo.

Il saggio della cometa è un metodo di elettroforesi su gel utilizzato per rilevare le rotture del DNA a livello di singola cellula. Si basa sul principio che le rotture aperte del DNA migrano in condizioni elettroforetiche, mentre il DNA intatto rimane in gran parte statico. Il DNA rotto migra perché le rotture provocano il rilassamento del DNA superavvolto, causando il suo graduale trasferimento spaziale verso l'anodo nella camera elettroforetica, che si traduce in un aspetto simile a una cometa osservato dall'immunofluorescenza 1,2. L'entità del danno al DNA viene quindi misurata quantificando la quantità di DNA rotto che è migrato rispetto al DNA compatto.
I due metodi di analisi delle comete più comunemente usati sono il saggio della cometa alcalina (AC) e il saggio della cometa neutra (NC). Il saggio AC viene eseguito in condizioni di denaturazione utilizzando una soluzione ad alto pH alcalino, mentre il test NC viene eseguito in una soluzione a pH neutro. Sia i saggi NC che AC possono rilevare in modo affidabile le rotture del DNA che si verificano nel nucleo. Tuttavia, la versione alcalina è vantaggiosa anche per rilevare i siti alcalino-labili3. Entrambi i formati del test richiedono l'uso di condizioni di lisi per garantire che il DNA sia privo di proteine prima dell'elettroforesi.
Questo test è un metodo semplice per rilevare le rotture del DNA e offre diversi vantaggi unici per determinare il danno al DNA cellulare. Il metodo è relativamente facile da configurare e richiede reagenti che possono essere preparati in laboratorio o acquistati da fornitori commerciali. Essendo una tecnica di risoluzione a singola cellula, il saggio richiede pochissimo materiale di partenza. In particolare, il test NC è in grado di misurare le rotture con un'elevata sensibilità, in grado di rilevare tra le 50 e le 10.000 rotture per cellula4. La versatilità di questa tecnica è dimostrata dalla sua vasta gamma di applicazioni, tra cui l'ecotossicologia5, il biomonitoraggio umano6 e gli studi di genotossicità7. Il test può anche essere utilizzato in modo affidabile su vari tipi di cellule e adattato per saggi ad alto rendimento8 e per la valutazione delle rotture in specifiche regioni genomiche9. Pertanto, questo test funge da tecnica rapida e affidabile per studiare la formazione di rotture a livello di singola cellula.
Il processo di replicazione del DNA è costantemente sfidato da diversi fattori di stress endogeni ed esogeni10,11. Lo stallo dei replisomi a causa di tali lesioni può causare rotture del DNA e provocare una maggiore instabilità del genoma. Le rotture del DNA spesso si verificano anche come intermedi di replicazione per facilitare la riparazione del DNA12. Inoltre, diversi agenti chemioterapici inducono rotture del doppio filamento replication-dipendenti (DSB), come la camptotecina (CPT)13,14,15 e gli inibitori di PARP 16,17. Pertanto, questo test funge da potente metodologia per studiare la natura delle lesioni del DNA, valutare l'elaborazione delle forcelle di replicazione e indagare il potenziale terapeutico degli agenti dannosi per il DNA. Gli adattamenti del test che comportano la marcatura del DNA di nuova sintesi con BrdU sono stati utili per studiare i fenotipi di stress associati alla replicazione 18,19,20,21. In particolare, il saggio NC è un metodo affidabile per studiare l'induzione della rottura del DNA nel contesto della replicazione, come dimostrato in studi che coinvolgono la caratterizzazione delle proteine fork 22,23, l'analisi degli intermedi di replicazione24,25 e l'indagine dei conflitti di trascrizione-replicazione nel mantenimento del genoma26,27. In questo articolo, delineiamo un protocollo di analisi NC con l'obiettivo di quantificare le rotture del DNA durante la replicazione nelle cellule umane. Questo protocollo può essere facilmente implementato dai ricercatori interessati a valutare il danno associato allo stress di replicazione in un'ampia varietà di cellule umane in divisione.

<table><tbody><tr><td>1x DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Camptothecin</td><td>S1288</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Comet LMAgarose (LMA)</td><td>R& D systems</td><td>4250-050-02</td><td></td></tr><tr><td>CometAssay Electrophoresis System II</td><td>R& D systems</td><td>4250-050-ES</td><td>Include serbatoio per elettroforesi, coperchio di sicurezza, cavi, vassoi per vetrini da 2/20 pozzetti e sovrapposizione per vassoi per vetrini</td></tr><tr><td>Software CometScore</td><td>TriTek</td><td></td><td>open source</td></tr><tr><td>CometSlide</td><td>R& D systems</td><td>4250-050-03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM,</td><td>Gibco</td> ad alto <td>glucosio 11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>FisherSci</td><td>D128-4</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio per epifluorescenza</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino - Premium</td><td>Bio-Techne</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 10.0</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cellule</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>cellule hTERT-RPE-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>Idrossiurea</td><td>Millipore Sigma</td><td>H8627</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore PARP Olaparib</td><td>Selleckchem</td><td>S8096</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac</td><td>FisherSci</td><td>FB300Q</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale sterile con trattamento superficiale</td><td>FisherSci</td><td>FB012927</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (10.000x)</td><td>FisherSci</td><td>S7567</td><td></td></tr><tr><td>Cellule U2OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>UVP&nbsp; Incubatore di ibridazione HB-1000</td><td>FisherSci</td><td>UVP95003001</td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento di rotture del dna nelle cellule umane in divisione mediante saggio della cometa neutra

Detection of DNA Breaks in Dividing Human Cells by Neutral Comet Assay

La replicazione del DNA è costantemente messa alla prova da un'ampia varietà di fattori di stress endogeni ed esogeni che possono danneggiare il DNA. Tali lesioni riscontrate durante la duplicazione del genoma possono bloccare i replisomi e convertire le forcelle di replicazione in rotture a doppio filamento. Se non riparate, queste rotture tossiche del DNA possono innescare riarrangiamenti cromosomici, portando a una maggiore instabilità del genoma e a una maggiore probabilità di trasformazione cellulare. Inoltre, le cellule tumorali mostrano uno stress di replicazione persistente, rendendo il targeting delle vulnerabilità della forcella di replicazione nelle cellule tumorali una strategia attraente per la chemioterapia. Una tecnica altamente versatile e potente per studiare le rotture del DNA durante la replicazione è il saggio della cometa. Questa tecnica di elettroforesi su gel rileva in modo affidabile l'induzione e la riparazione di rotture del DNA a livello di singola cellula. In questo articolo, viene delineato un protocollo che consente ai ricercatori di misurare l'entità del danno al DNA nelle cellule umane che si dividono mitoticamente utilizzando agenti di stallo a forcella su più tipi di cellule. L'abbinamento di questo con il punteggio automatico delle comete facilita l'analisi rapida e migliora l'affidabilità nello studio dell'induzione delle rotture del DNA.

Analisi dell'induzione di rottura da parte di reagenti per stress di replicazione Le cellule U2OS sono state trattate con DMSO, 4 di mM idrossiurea (HU) o 100 nM di CPT per 4 ore e analizzate per l'accumulo di rottura mediante il test NC (Figura 6A). Mentre la CPT induce rotture durante la fase S bloccando la topoisomerasi-113, la deplezione dei pool nucleotidici indotta da HU blocca le forcelle di replicazione che vengono progressivamente convertite in DSB28. I dati indicano che l'esposizione a HU o CPT innesca l'interruzione dell'induzione nella fase S, che è rilevabile dal saggio NC.
Analisi dell'induzione della rottura confrontando la lisi a diverse temperature Le cellule U2OS non trattate sono state incubate in tampone di lisi a temperatura ambiente (RT) o 4 °C prima delle analisi di induzione della rottura (Figura 6B). I risultati indicano che la temperatura alla quale viene eseguita la lisi ha un impatto minimo sulla migrazione delle code nel saggio.
Analisi temporale delle rotture per idrossiurea (HU) Le cellule U2OS non sono state trattate o trattate con 4 mM di HU per 4 ore e 8 ore prima delle analisi di induzione della rottura mediante il test NC (Figura 7). I risultati indicano che lo stallo prolungato delle forcelle di replicazione con HU provoca il collasso delle forcelle di replicazione nei DSB.
Analisi dose-dipendente delle rotture da camptotecina Le cellule U2OS sono state trattate con dosi aumentate di CPT per 1 ora e raccolte per le analisi di rottura utilizzando il saggio NC (Figura 8). Mentre l'accumulo di rottura è minimo nelle cellule non trattate con CPT, il grado di induzione della rottura aumenta gradualmente con l'aumentare del dosaggio di CPT, dimostrando così l'utilità del test nello studio degli effetti dose-dipendenti sull'accumulo di rottura durante la replicazione del DNA.
Analisi comparativa delle rotture in più tipi di cellule I livelli basali di rotture del DNA sono stati valutati in tre tipi di cellule mitotiche divergenti: cellule epiteliali pigmentate retiniche immortalizzate hTERT (hTERT-RPE-1), cellule renali embrionali umane (HEK293T) che esprimono l'antigene T del virus delle scimmie 40 (SV40) e cellule di osteosarcoma osseo (U2OS) (Figura 9). Ogni linea cellulare ha dimostrato una migrazione differenziale dei momenti di coda in assenza di stress di replicazione aggiunto, che può essere dovuto a differenze nella distribuzione del ciclo cellulare, nell'organizzazione della cromatina o nel numero di forcelle di replicazione attive. Ogni tipo di cellula è stato anche esposto a 1 μM di CPT per 1 ora per convalidare un aumento delle rotture del DNA dipendenti dalla replicazione.
Analisi dell'induzione di rottura mediante saggio AC Le cellule U2OS sono state trattate con DMSO, 4 mM di HU, 1 μM di CPT o 10 μM di inibitore di PARP (PARPi) Olaparib e analizzate per l'induzione della rottura (Figura 10). Le cellule sono state trattate con DMSO, HU e PARPi per 2 ore, mentre il trattamento CPT è durato 1 ora. I risultati indicano che l'esposizione allo stress di replicazione provoca l'accumulo di rotture, che è osservabile dal saggio AC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig01.jpg"> Figura 1: Rappresentazione schematica del saggio NC. (A) Il numero richiesto di cellule viene seminato il giorno prima in una capsula a 6 pozzetti. (B) Dopo i trattamenti farmacologici, le cellule vengono tripsinizzate e raccolte in PBS freddo. (C) Le cellule vengono delicatamente risospese nell'agarosio fuso a un rapporto di 10:1 (10 μL di agarosio per 1 μL di sospensione cellulare) utilizzando un puntale di pipetta. (D) La sospensione cellulare viene trasferita su un pozzetto di vetrino utilizzando una punta di pipetta e distribuita uniformemente per coprire completamente la superficie del pozzetto con agarosio. (E) Dopo l'incubazione a 4 °C, i vetrini vengono immersi in un tampone di lisi, seguito da un tampone TAE 1x freddo. (F) I campioni sono sottoposti a elettroforesi utilizzando l'apparecchiatura appropriata. (G) I vetrini vengono quindi immersi nella soluzione di precipitazione del DNA, seguita da una soluzione di etanolo al 70%. (H) Dopo l'essiccazione, i pozzetti vengono colorati con 1x soluzione SYBR Green. (I) I vetrini sono ripresi utilizzando un microscopio a epifluorescenza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig02.jpg"> Figura 2: Vista laterale dell'agarosio sui pozzetti dei vetrini delle comete. (A) Dopo l'incubazione a 4 °C (passo 3.8), l'agarosio solidificato appare come una 'bolla' con una forma convessa. (B) Dopo l'essiccazione a 45 °C (fase 5.3), l'agarosio appare appiattito sul pozzetto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig03.jpg"> Figura 3: Imaging e analisi delle comete. (A) Le comete all'interno del cerchio interno del pozzo (evidenziate in blu) vengono selezionate per l'analisi. Le comete verso il bordo esterno del pozzo sono escluse a causa di momenti di coda atipicamente più lunghi, che le contrassegnano come valori anomali. (B) Almeno 100 comete rappresentative sono selezionate casualmente dalla regione di colore blu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig04.jpg"> Figura 4: Immagine rappresentativa delle comete ottenuta dal saggio NC. Il pannello di destra mostra un campo visivo rappresentativo per i nuclei colorati in verde SYBR, mentre il pannello di sinistra evidenzia la regione (contorno verde) utilizzata per il punteggio delle comete. I nuclei parzialmente visibili o impilati uno vicino all'altro (contorno rosso, pannello di destra) non sono inclusi nell'analisi. Le comete selezionate per il punteggio dovrebbero essere distinguibili individualmente, completamente contenute nel campo visivo e mostrare un'intensità di colorazione uniforme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig05.jpg"> Figura 5: Punteggio rappresentativo delle comete ottenuto dal saggio NC. (A) I singoli nuclei sono delineati utilizzando il software CometScore. (B) La vista a spettro completo (pannello di sinistra) è abilitata e la soglia (barra di taglio) è regolata per ottenere un'intensità del segnale ottimale con uno sfondo minimo. Il segnale "spettro completo" deve corrispondere all'immagine "a tonalità singola" (immagine in alto, pannello a destra) e non superare il contorno (immagine in basso, pannello a destra). (C) La linea gialla verticale nella scatola è allineata con il centro della testa della cometa, utilizzando la parte più larga della testa della cometa come riferimento per la coerenza. (D) Il punteggio per ogni cometa analizzata è riportato nell'angolo in alto a destra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig06.jpg"> Figura 6: Analisi dell'induzione della rottura mediante reagenti per lo stress di replicazione. (A) Le cellule U2OS sono state trattate con DMSO, 100 nM di camptotecina (CPT) o 4 mM di idrossiurea (HU) prima dell'analisi dell'induzione della rottura. Il grafico rappresentativo mostra un aumento dell'accumulo di rotture nelle cellule trattate con CPT o HU. (B) Le cellule U2OS non trattate sono state seminate su vetrini cometari e incubate per lisi (fase 3.9) a temperatura ambiente (RT) o 4 °C per confrontare l'effetto della temperatura di lisi. I momenti di coda delle analisi sono tracciati come grafici a scatola e baffi che rappresentano valori percentili 10-90, con valori mediani rappresentati da linee orizzontali all'interno delle caselle. I valori p sono stati calcolati utilizzando il test di Kruskal-Wallis con i confronti multipli di Dunn (valore p di 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig07.jpg"> Figura 7: Analisi temporale delle rotture indotte dall'idrossiurea. Le cellule U2OS non sono state trattate o trattate con 4 mM HU per 4 ore o 8 ore prima dell'analisi di induzione della rottura. Il grafico rappresentativo mostra un aumento graduale dell'accumulo di rotture nelle cellule trattate con HU. I momenti di coda delle analisi sono tracciati come grafici a scatola e baffi che rappresentano valori percentili 10-90, con valori mediani rappresentati da linee orizzontali all'interno delle caselle. I valori p sono stati calcolati utilizzando il test di Kruskal-Wallis con i confronti multipli di Dunn (valore p di 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig08.jpg"> Figura 8: Analisi dose-dipendente delle rotture indotte dalla camptotecina. Le cellule U2OS sono state trattate con DMSO o con concentrazioni crescenti di CPT (25 nM, 100 nM, 500 nM e 1 μM) per 1 ora prima dell'analisi di rottura. I momenti di coda delle analisi sono tracciati come grafici a scatola e baffi che rappresentano valori percentili 10-90, con valori mediani rappresentati da linee orizzontali all'interno delle caselle. Il grafico rappresentativo mostra un aumento dose-dipendente delle pause indotte dalla CPT. I valori p sono stati calcolati utilizzando il test di Kruskal-Wallis con i confronti multipli di Dunn (valore p di cutoff di 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig08large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig09.jpg"> Figura 9: Analisi comparativa delle rotture in più tipi di cellule. Le cellule hTERT-RPE-1, HEK293T e U2OS sono state trattate con DMSO o 1 μM CPT per 1 ora. Il grafico rappresentativo mostra l'entità relativa del danno al DNA nei tre tipi di cellule in presenza o assenza di CPT. I momenti di coda delle analisi sono tracciati come grafici a scatola e baffi che raffigurano valori percentili 10-90, con valori mediani rappresentati da linee orizzontali all'interno delle caselle. I valori p sono stati calcolati utilizzando il test di Kruskal-Wallis con i confronti multipli di Dunn (valore p di 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig09large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig10.jpg"> Figura 10: Analisi dell'induzione della rottura mediante il saggio AC. Le cellule U2OS sono state trattate con DMSO, 4 mM HU, 1 μM CPT o 10 μM di inibitore di PARP Olaparib prima dell'analisi di induzione della rottura. Le cellule sono state trattate con DMSO, HU e inibitore di PARP per 2 ore, mentre il trattamento CPT è durato 1 ora. Il grafico rappresentativo mostra un aumento dell'accumulo di rotture nelle cellule trattate con inibitori di CPT, HU o PARP. I momenti di coda delle analisi sono tracciati come grafici a scatola e baffi che rappresentano valori percentili 10-90, con valori mediani rappresentati da linee orizzontali all'interno delle caselle. I valori p sono stati calcolati utilizzando il test di Kruskal-Wallis con i confronti multipli di Dunn (valore p di 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig10large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagente</td>
			<td>Soluzione funzionante</td>
		</tr><tr><td>Tampone di lisi</td>
			<td>SDS 0,5%, 200 mM Tris-Cl (pH 7,4), 50 mM EDTA</td>
		</tr><tr><td>1x tampone TAE</td>
			<td>40 mM Tris Base, 20 mM Acido acetico, 1 mM EDTA a pH 8,45</td>
		</tr><tr><td>Soluzione di precipitazione del DNA</td>
			<td>1 M di acetato di ammonio, 87% etanolo</td>
		</tr><tr><td>Soluzione di etanolo al 70%</td>
			<td>70% di etanolo in acqua distillata</td>
		</tr><tr><td>1x soluzione SYBR Green</td>
			<td>1x SYBR Green in 1x tampone TAE</td>
		</tr><tr><td>Terreni di coltura DMEM</td>
			<td>DMEM con 7,5% FBS</td>
		</tr><tr><td>Terreni di coltura DMEM/F12</td>
			<td>DMEM/F12 con 7,5% FBS</td>
		</tr><tr><td>Soluzione di svolgimento alcalina (per l'uso nel saggio della cometa alcalina)</td>
			<td>200 mM NaOH, 1 mM EDTA in pH&gt;13</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Elenco dei buffer e delle soluzioni.

Questo protocollo è progettato per studiare l'entità del danno al DNA che si verifica durante la replicazione del DNA. In condizioni neutre, l'induzione di rotture del DNA può essere facilmente valutata in un breve lasso di tempo. Inoltre, il protocollo è adattabile ad altri tipi di cellule e a vari reagenti per lo stress di replicazione.

Rilevamento di rotture del DNA nelle cellule umane in divisione mediante saggio della cometa neutra

DNA replication is constantly challenged by a wide variety of endogenous and exogenous stressors that can damage DNA. Such lesions encountered during ...

detection-of-dna-breaks-in-dividing-human-cells-by-neutral-comet-assay

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Il video mostra il test della cometa per rilevare danni al DNA in seguito all'esposizione ad agenti nocivi. In condizioni alcaline, il DNA si srotola e si denatura, e dopo l'elettroforesi, il DNA integro e danneggiato migra in modo diverso nel gel di agarosio, formando una struttura a forma di cometa. Il DNA intatto che migra lentamente forma la testa circolare della cometa, mentre i frammenti di DNA danneggiati che migrano rapidamente formano la coda allungata della cometa.

Saggio della cometa per il rilevamento del danno al DNA nelle cellule

Il test della cometa è un modo efficiente di rilevare rotture a singolo e doppio filamento, compresi alcali-labili siti e DNA-DNA/DNA-protein legami incrociati sul DNA in tutte le cellule, compresi i neuroni dell'ippocampo. Il metodo sfrutta la migrazione differenziale di DNA in un campo elettrico dovuto a differenze nelle quantità di danno al DNA.

Il saggio danneggiare il DNA in neuroni ippocampali Utilizzo del Comet Assay

Descriviamo qui una piattaforma che consente di rilevare test della cometa di danno al DNA con velocità senza precedenti. Il dispositivo modelli di cellule di mammifero in un microarray e consente l'elaborazione parallela di 96 campioni. L'approccio facilita l'analisi del danno al DNA livello di base, danno al DNA indotto da esposizione e di riparazione del DNA cinetica.

CometChip: A High-throughput di 96-Well Piattaforma per la misurazione dei danni cagionati DNA in cellule umane Microarrayed

Il test della cometa è un metodo efficace per rilevare danni al DNA compreso singolo e doppio filamento di DNA si rompe. Descriviamo la cometa alcalino e neutro saggi per misurare il danno del DNA in cellule di cancro per valutare l'effetto terapeutico della chemioterapia.

Valutazione In Vitro del DNA danni utilizzando test della cometa

Questo protocollo descrive diverse procedure per la preparazione di campioni di tessuto congelato di alta qualità al momento della necroscopia per l'uso nel saggio della cometa per valutare il danno al DNA: 1) tessuto macinato, 2) cellule epiteliali raschiate dal tratto gastrointestinale e 3) tessuto immatolato campioni, richiedendo l'omogeneizzazione utilizzando un dispositivo di mincing dei tessuti.

Uso di tessuto congelato nel saggio Cometa per la valutazione del danno del DNA

Qui descriviamo due modifiche del test della fibra di DNA per studiare le lacune del DNA a singolo filamento nella replicazione del DNA dopo l'induzione della lesione. Il test della fibra S1 consente il rilevamento di lacune post-replicative utilizzando l'endonucleasi S1 specifica per ssDNA, mentre il test di riempimento delle lacune consente la visualizzazione e la quantificazione della riparazione del gap.

Rilevamento di lacune post-replicative accumulo e riparazione nelle cellule umane utilizzando il test delle fibre di DNA

Il saggio della cometa è un mezzo popolare per rilevare danni al DNA. Questo studio descrive un approccio per eseguire diapositive in varianti rappresentative del saggio della cometa. Questo approccio ha aumentato significativamente il numero di campioni diminuendo il tempo di esecuzione del test, il numero di manipolazioni dei vetrini e il rischio di danni ai gel.

Un approccio di analisi delle comete ad alto rendimento per la valutazione del danno al DNA cellulare

Questo protocollo descrive un metodo efficace per quantificare la differenza nel danno al DNA indotto da inibitori di tipo I e di tipo II nelle cellule mutanti FLT3 attraverso l'applicazione del saggio della cometa.

Saggio della cometa per quantificare il danno al DNA nelle cellule 32D che esprimono mutanti FLT3 dopo l'esposizione a inibitori FLT3 di tipo I e II

"E-DNA" sensori, reagentless, biosensori elettrochimici che ottengono buoni risultati anche quando sfidato direttamente nel sangue e altre matrici complesse, sono stati adattati per il rilevamento di una vasta gamma di acidi nucleici, proteine ​​e analiti di piccole molecole. Qui vi presentiamo una procedura generale per la fabbricazione e l'uso di sensori di questo tipo.

Fabbricazione di elettrochimica-DNA biosensori per il rilevamento Reagentless di acidi nucleici, proteine ​​e piccole molecole

Dimostriamo il montaggio e l'applicazione di una scala molecolare dispositivo alimentato da una proteina topoisomerasi. Il costrutto è un bio-sensore molecolare che le etichette due tipi principali di rotture del DNA nelle sezioni di tessuto allegando due fluorofori diversi per i loro fini.

In Assemblea in vitro di semi-artificiale della macchina molecolare e il suo utilizzo per il rilevamento del danno al DNA

Scopri come rilevare rotture del DNA in cellule umane in divisione mediante saggio della cometa neutra. Questo metodo valuta i danni durante la replicazione e il ruolo del remodelatore cromatinico SNF2L.

Rilevamento di rotture del DNA nelle cellule umane in divisione mediante saggio della cometa neutra

Esplora altri video