Name: Analisi specifica dei filamenti di proteine in replicazione di filamenti di DNA tramite arricchimento e sequenziamento del metodo del DNA nascente associato a proteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Scopri il metodo eSPAN per analizzare il riciclaggio degli istoni parentali durante la replicazione del DNA in lievito e cellule staminali embrionali di topo. Questa tecnica rivela la dinamica della deposizione degli istoni e i meccanismi dell'eredità epigenetica.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dei National Institutes of Health R35GM118015 (Z.Z.), R01GM130588 (C.Y.) e dall'Hormel Startup Fund (C.Y.).

<ol><li>Bell, S. P., Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-dependent+recognition+of+eukaryotic+origins+of+DNA+replication+by+a+multiprotein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ATP-dependent recognition of eukaryotic origins of DNA replication by a multiprotein complex.</a> Nature. 357 (6374), 128-134 (1992).</li>
<li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (6), 360-374 (2015).</li>
<li>Burgers, P. M. J., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+DNA+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic DNA replication fork.</a> Annu Rev Biochem. 86, 417-438 (2017).</li>
<li>Pursell, Z. F., Isoz, I., Lundstrom, E. B., Johansson, E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+DNA+polymerase+epsilon+participates+in+leading-strand+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast DNA polymerase epsilon participates in leading-strand DNA replication.</a> Science. 317 (5834), 127-130 (2007).</li>
<li>Nick Mcelhinny, S. A., Gordenin, D. A., Stith, C. M., Burgers, P. M., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+labor+at+the+eukaryotic+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Division of labor at the eukaryotic replication fork.</a> Mol Cell. 30 (2), 137-144 (2008).</li>
<li>Daigaku, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+profile+of+replicative+polymerase+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A global profile of replicative polymerase usage.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 192-198 (2015).</li>
<li>Koyanagi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+replicative+DNA+polymerase+usage+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Global landscape of replicative DNA polymerase usage in the human genome.</a> Nat Commun. 13 (1), 7221(2022).</li>
<li>Clausen, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+replication+enzymology+in+vivo+by+genome-wide+mapping+of+ribonucleotide+incorporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 185-191 (2015).</li>
<li>Reijns, M. aM., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lagging-strand+replication+shapes+the+mutational+landscape+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lagging-strand replication shapes the mutational landscape of the genome.</a> Nature. 518 (7540), 502-506 (2015).</li>
<li>Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribose-seq%3A+Global+mapping+of+ribonucleotides+embedded+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ribose-seq: Global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA.</a> Nat Methods. 12 (3), 253 p following 257 251-257 (2015).</li>
<li>Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+at+the+replication+fork+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases at the replication fork in eukaryotes.</a> Mol Cell. 30 (3), 259-260 (2008).</li>
<li>Zhou, Z. X., Lujan, S. A., Burkholder, A. B., Garbacz, M. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+DNA+polymerase+delta+in+initiating+and+terminating+leading+strand+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Roles for DNA polymerase delta in initiating and terminating leading strand DNA replication.</a> Nat Commun. 10 (1), 3992(2019).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+analysis+shows+protein+binding+at+replication+forks+and+PCNA+unloading+from+lagging+strands+when+forks+stall%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Strand-specific analysis shows protein binding at replication forks and PCNA unloading from lagging strands when forks stall.</a> Mol Cell. 56 (4), 551-563 (2014).</li>
<li>Gan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mcm2-ctf4-polalpha+axis+facilitates+parental+histone+h3-h4+transfer+to+lagging+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mcm2-ctf4-polalpha axis facilitates parental histone h3-h4 transfer to lagging strands.</a> Mol Cell. 72 (1), 140-151.e3 (2018).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+preventing+asymmetric+histone+segregation+onto+replicating+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A mechanism for preventing asymmetric histone segregation onto replicating DNA strands.</a> Science. 361 (6409), 1386-1389 (2018).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mcm2+promotes+symmetric+inheritance+of+modified+histones+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mcm2 promotes symmetric inheritance of modified histones during DNA replication.</a> Science. 361 (6409), 1389-1392 (2018).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+alpha+interacts+with+H3-H4+and+facilitates+the+transfer+of+parental+histones+to+lagging+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase alpha interacts with H3-H4 and facilitates the transfer of parental histones to lagging strands.</a> Sci Adv. 6 (35), eabb5820(2020).</li>
<li>Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+protein-DNA+interactions+in+vivo+with+formaldehyde%3A+Evidence+that+histone+h4+is+retained+on+a+highly+transcribed+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: Evidence that histone h4 is retained on a highly transcribed gene.</a> Cell. 53 (6), 937-947 (1988).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cut%26tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cut&tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nat Commun. 10 (1), 1930(1930).</li>
<li>Lengronne, A., Pasero, P., Bensimon, A., Schwob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+S+phase+progression+globally+and+locally+using+brdu+incorporation+in+tk%28%2B%29+yeast+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring S phase progression globally and locally using brdu incorporation in tk(+) yeast strains.</a> Nucleic Acids Res. 29 (7), 1433-1442 (2001).</li>
<li>Viggiani, C. J., Aparicio, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+vectors+for+simplified+construction+of+brdu-incorporating+strains+of+saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">New vectors for simplified construction of brdu-incorporating strains of saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (14-15), 1045-1051 (2006).</li>
<li>Yu, C., Gan, H., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+analysis+of+DNA+synthesis+and+proteins+association+with+DNA+replication+forks+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Strand-specific analysis of DNA synthesis and proteins association with DNA replication forks in budding yeast.</a> Methods Mol Biol. 1672, 227-238 (2018).</li>
<li>Li, Z., Hua, X., Serra-Cardona, A., Xu, X., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+strand-specific+profiling+of+replicating+chromatin+with+enrichment+and+sequencing+of+protein-associated+nascent+DNA+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient and strand-specific profiling of replicating chromatin with enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA in mammalian cells.</a> Nat Protoc. 16 (5), 2698-2721 (2021).</li>
<li>Rosebrock, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+budding+yeast+cell+cycle+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of the budding yeast cell cycle by flow cytometry.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2017 (1), (2017).</li>
<li>Brogaard, K., Xi, L., Wang, J. P., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+nucleosome+positions+in+yeast+at+base-pair+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of nucleosome positions in yeast at base-pair resolution.</a> Nature. 486 (7404), 496-501 (2012).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+landscape+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Replication landscape of the human genome.</a> Nat Commun. 7, 10208(2016).</li>
<li>Foltman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+replisome+components+cooperate+to+process+histones+during+chromosome+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic replisome components cooperate to process histones during chromosome replication.</a> Cell Rep. 3 (3), 892-904 (2013).</li>
<li>Jia, J., Yu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+MCM2-7+helicase+subunit+MCM2+in+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">The role of the MCM2-7 helicase subunit MCM2 in epigenetic inheritance.</a> Biology (Basel). 13 (8), 572(2024).</li>
<li>Alabert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+chromatin+capture+proteomics+determines+chromatin+dynamics+during+DNA+replication+and+identifies+unknown+fork+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nascent chromatin capture proteomics determines chromatin dynamics during DNA replication and identifies unknown fork components.</a> Nat Cell Biol. 16 (3), 281-293 (2014).</li>
<li>Sirbu, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+dynamics+at+active%2C+stalled%2C+and+collapsed+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks.</a> Genes Dev. 25 (12), 1320-1327 (2011).</li>
<li>Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2d+gel+electrophoresis+to+detect+DNA+replication+and+recombination+intermediates+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">2d gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast.</a> Methods Mol Biol. 2119, 43-59 (2020).</li>
<li>Ramachandran, S., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mince-seq%3A+Mapping+in+vivo+nascent+chromatin+with+edu+and+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mince-seq: Mapping in vivo nascent chromatin with edu and sequencing.</a> Methods Mol Biol. 1832, 159-168 (2018).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+and+sister+chromatid-resolved+profiling+of+protein+occupancy+in+replicated+chromatin+with+CHOR-seq+and+SCAR-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-wide and sister chromatid-resolved profiling of protein occupancy in replicated chromatin with CHOR-seq and SCAR-seq.</a> Nat Protoc. 16 (9), 4446-4493 (2021).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+nanogram-range+immunoprecipitated+DNA+in+chip-seq+application%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Purification of nanogram-range immunoprecipitated DNA in chip-seq application.</a> BMC Genomics. 18 (1), 985(2017).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+distribution+of+parental+h3k9me3+in+s+phase+silences+l1+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Asymmetric distribution of parental h3k9me3 in s phase silences l1 elements.</a> Nature. 623 (7987), 643-651 (2023).</li>
<li>Kanev, P. B., Atemin, A., Stoynov, S., Aleksandrov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parp1+roles+in+DNA+repair+and+DNA+replication%3A+The+basi%28c%29s+of+parp+inhibitor+efficacy+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Parp1 roles in DNA repair and DNA replication: The basi(c)s of parp inhibitor efficacy and resistance.</a> Semin Oncol. 51 (1-2), 2-18 (2023).</li>
<li>Hanzlikova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+poly%28adp-ribose%29+polymerase+as+a+sensor+of+unligated+Okazaki+fragments+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The importance of poly(adp-ribose) polymerase as a sensor of unligated Okazaki fragments during DNA replication.</a> Mol Cell. 71 (2), 319-331.e3 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La rilevazione delle proteine associate a filamenti di replicazione avanzati e rallentati è importante per comprendere i meccanismi di replicazione della cromatina e il processo associato, direttamente rilevanti per la ricerca sul cancro umano e i meccanismi di resistenza ai farmaci. Sono stati impiegati diversi metodi, come il gel 2D, l'immunoprecipitazione nativa della Cromatina (nChIP), iPOND e la cattura nascente dellacromatina 29,30,31, per studiare la replicazione del DNA e processi correlat...

Negli organismi eucarioti, la duplicazione genomica viene avviata da più siti chiamati origini di replicazione, dove il complesso di riconoscimento delle origini (ORC) si lega e avvia la macchina proteica di reclutamento, inclusa l'elicasa CMG, per iniziare la replicazionedel DNA 1. La macchina a risposta in ciascuna origine di replicazione forma due forche di replicazione che si muovonobidirezionalmente 2,3. Le forchette di replicazione gemelle replicano i due fili genitori di DNA attraverso la sintesi continua del filamento principale e la sintesi discontinua del filamento ritardato. Data questa natura asimmetrica di ogni forchetta di replicazione, i componenti di replicazione, inclusi i DNA polimerasi sui filamenti anteriori e rallentativi, sono diversi. Analisi genetiche precedenti basate su DNA polimerasi mutanti dimostrano che DNA Pol ε e DNA Pol δ sono le principali polimerasi responsabili rispettivamente della replicazione della catena che della fase di ritardo e della ritardata. Sono stati sviluppati diversi metodi per rilevare la preferenza per il filamento della DNA polimerasi, tra cui Pu-seq 6,7, HydEn-seq8 ed emRiboSeq o RiboSeq 9,10. Questi metodi genetici per dissezionare la specificità del filamento sono limitati alle DNA polimerasi e richiedono l'introduzione di mutazioni su ciascunaproteina 4,5,11,12. Tracciare l'associazione di qualsiasi proteina bersaglio con filamenti anteriori e rallentati delle forchette di replicazione del DNA fornirà preziose informazioni sulla replicazione del DNA. In questo impegno, abbiamo inizialmente sviluppato la tecnica eSPAN (arricchimento e sequenziamento del DNA nascente associato a proteine, Figura 1) nelle cellule di lievito. Come studio proof-of-principle, abbiamo inizialmente mostrato che Pol δ e Pol δ sono arricchiti rispettivamente su filamenti anteriori e ritardati. Abbiamo inoltre scoperto la preferenza per il filamento dei componenti chiave della replicazione del DNA, inclusa l'elicasa replicativa del DNA, la proteina di legame al DNA a filamento singolo (proteina di replicazione A), la lampada antigene nucleare delle cellule proliferanti (PCNA) e il suo fattore di replicazione del loader C (RFC)13. È importante sottolineare che noi e altri abbiamo utilizzato questo metodo per scoprire i meccanismi del trasferimento degli istoni genitoriali, un processo che è stato insolvibile per oltre 4 decenni14, 15, 16, 17.
Il metodo eSPAN prevede due passaggi sequenziali: l'arricchimento della proteina bersaglio tramite ChIP18 o CUT&Tag 19 e l'arricchimento del DNA nascente associato alla proteina tramite immunoprecipitazione BrdU. In un ceppo standard di lievito (W303 o S288C), BrdU o EdU extracellulari non possono entrare nelle cellule e incorporarsi nei cromosomi. Questi ceppi non dispongono di un appropriato trasportatore nucleosidico per l'assorbimento della timidina né della timidina chinasi necessaria per fosforilare la timidina in TMP, che converte BrdU (o EdU) in BrdUMP (EdUMP). L'espressione del trasportatore nucleosidico equilibrativo umano 1 (hENT1) e del virus dell'herpes simplex timidina chinasi (HSV-TK) aumenta l'assorbimento della timidina e la conversione di BrdU (o EdU) in BrdUMP (EdUMP)20. Pertanto, per eseguire l'esperimento eSPAN sul lievito, i ceppi dovevano essere inseriti con una struttura BrdU-Incorporante (BrdU-Inc) (HSV-TK e hENT1)13,21.
In precedenza, fornivamo il protocollo eSPAN per le proteine di replicazione del DNA nellievito 22. Recentemente, abbiamo integrato il metodo CUT&Tag nel protocollo eSPAN nelle cellule di mammifero per affrontare passaggi tecnicamente complessi che richiedono ottimizzazione, come il cross-linking, lo shear della cromatina e per minimizzare il numero di celluleiniziali 17,23. Qui, abbiamo fornito l'eSPAN degli istoni per la visualizzazione utilizzando cellule di lievito (Figura 2). Questo metodo è utilizzato principalmente per analizzare la distribuzione delle forme modificate di istones sui filamenti di DNA replicanti. Mentre testavamo diversi segni di itoni, abbiamo usato come esempio H3K4me3, un marchio sull'istoria parentale H3. Per analizzare i componenti e i fattori dei risponditori coinvolti nella riparazione del DNA ai fork di replicazione, raccomandiamo di tagliare la cromatina in piccoli frammenti tramite sonicazione, come descritto nella nostra primapubblicazione 22. Per le cellule di mammiferi, abbiamo adottato le procedure modificate Cut&Tag per sostituire il passaggio ChIP descritto nellievito 23. Questa modifica riduce la quantità di materiale di partenza (cellule) e, cosa più importante, consente la generazione di librerie eSPAN per il sequenziamento senza l'uso di kit di preparazione del DNA a singolo filamento. Per il protocollo del lievito, abbiamo scelto di non usare il metodo Cut&Tag perché la quantità di materiale di partenza era sufficiente. Ancora più importante, abbiamo riscontrato che le procedure Cut&Tag non erano costantemente efficaci per le cellule di lievito nelle nostre mani.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL tubi a basso legame di DNA &nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Buffer Ampligase 10x</td><td>Lucigen</td><td>A1905B</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS e nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS</td><td>BioRad</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>16 G x 1-1/2 in. Ago BD PrecisionGlid</td><td>BD in Biologia</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>KIT DI BIBLIOTECA DI ACCEL-NGS 1S PIÙ DNA</td><td>Tecnologie Integrate del DNA</td><td>10009817</td><td>kit di preparazione per la libreria ssDNA e DNA a basso input&nbsp;</td></tr><tr><td>Bioanalizzatore Agilent 2100 &nbsp;</td><td>Agilent</td><td>Bioanalisi 2100</td><td></td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 kit &nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5607-1504</td><td></td></tr><tr><td>Ampligase&nbsp;</td><td>Lucigen</td><td>A0110K</td><td>Maneggiare con attenzione il paraformaldeide, è infiammabile, solido e pericoloso.</td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>Beckman</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Reagente SPRI AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi anti-BrdU &nbsp;</td><td>BD in Biologia</td><td>555627</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi anti-H3K4me3&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab8580</td><td></td></tr><tr><td>Contatore cellulari automatico&nbsp;, modello TC10</td><td>BioRad</td><td>145-0001</td><td></td></tr><tr><td>Bacitracina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11702</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptone&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>211830</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidina Cloridrato&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B2417</td><td>Solidi combustibili</td></tr><tr><td>BrdU&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td>Maneggia BrdU con attenzione, poiché è un potenziale mutageno e teratogeno.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore di colture cellulari &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Incubatore a CO2 modello Forma serie II con camicia d'acqua</td><td>3140</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di coltura cellulare &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linea cellulare ES-E14&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chelex-100&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1422842</td><td>200&ndash; Dimensione 400 a maglia secca</td></tr><tr><td>Cloroformio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Perle magnetiche rivestite di concanavalina A (ConA) &nbsp;</td><td>Poliscienze</td><td>86057-10</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Millipore</td><td>300410-5MG</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>E. coli&nbsp; tRNA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td>Maneggia l'etanolo con attenzione, è infiammabile</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP26324</td><td>Maneggiare con cura l'isoproprogenolo, è infiammabile</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart Ready Mix</td><td>Roche</td><td>7958889001</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>sigma</td><td>221473</td><td>Maneggia il KOH con attenzione, è corrosivo</td></tr><tr><td>Vuoto a bassa velocità</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Supporto magnetico&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>LSKMAGS08</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Gradient PCR Thermal Cycler</td><td>Eppendorf</td><td>5331</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Nucleasi micrococciale&nbsp; (MNase)</td><td>Worthington</td><td>LS004798</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione PCR MinElute & nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td></td></tr><tr><td>Picchiatore per mini-perline</td><td>Mini BeadBeater 24 Disruptor</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>Mini-centrifuga&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>Shaker multipiattaforma</td><td>Fisherbrand</td><td>02-217-765</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore multipiattaforma a shaker</td><td>Benchmark</td><td>INCU-SHAKER 10L</td><td></td></tr><tr><td>Blocco termico multitermico & nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Termomixer C</td><td></td></tr><tr><td>N-[Tris(idrossimetil)metil]-3-aminopropanosolfonico acido &nbsp; (BATTE)</td><td>Sigma</td><td>T5130</td><td>200&ndash; Dimensione 400 a maglia secca</td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>Maneggia il NaOH con attenzione, è corrosivo</td></tr><tr><td>NEBNext HiFi 2 volte; Mix master PCR</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 Igepal CA-630</td><td>Thermo Scientific</td><td>J61055. AP</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldhide</td><td>sigma</td><td>158127</td><td>Maneggiare con attenzione il paraformaldeide, è infiammabile, solido e pericoloso.</td></tr><tr><td>enzima pA-Tn5 &nbsp;</td><td>Addgene</td><td>121137</td><td></td></tr><tr><td>Pefabloc</td><td>Sigma</td><td>11429868001</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo-cloroformio-isoamil alcol &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15593049</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta P1000, P200, P20 e P2</td><td>Eppendorf</td><td>2231300004</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>Compressa cocktail inibitore della proteasi</td><td>Sigma</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Compressa cocktail per inibitori della proteasi&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Proteina G-perle di sepharosi&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0618-02</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di precipitazione proteica</td><td>Qiagen</td><td>848023</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di precipitazione proteica</td><td>Qiagen</td><td>848023</td><td>Maneggia il KOH con attenzione, è corrosivo</td></tr><tr><td>Soluzione di precipitazione proteica &nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>848023</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>311584401</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick kit di purificazione PCR &nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>SDS&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro&nbsp;</td><td>Thermo Scientific.</td><td>2000/2000c</td><td></td></tr><tr><td>Spermidina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Pol</td><td>New England Biolabs,&nbsp;</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da tavolo &nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-5</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>estratto di lievito &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>212730</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi specifica dei filamenti di proteine in replicazione di filamenti di dna tramite arricchimento e sequenziamento del metodo del dna nascente associato a proteine

Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

La duplicazione del genoma è orchestrata da proteine replisome, incluse le elicasi, che srotolano il DNA doppio filamento in singoli filamenti antiparalleli singoli, ognuno dei quali richiede modalità di replicazione distinte: continua (in precedenza) e discontinua (lagg). Comprendere le interazioni delle proteine associate alla cromatina con i filamenti di DNA replicanti in vivo è fondamentale per chiarire i meccanismi di assemblaggio della cromatina e riparazione del DNA accoppiati alla replicazione del DNA. Questo protocollo presenta il metodo di arricchimento e sequenziamento del DNA nascente associato alle proteine (eSPAN), progettato per quantificare i livelli relativi di proteine sui filamenti di DNA nascenti e in ritardo nei fork di replicazione. La procedura eSPAN inizia con immunoprecipitazione della cromatina (ChIP, nel lievito) o scissione sotto bersagli e etichettatura (CUT&Tag; nelle cellule di mammifero) di una proteina di interesse, seguita dall'arricchimento del DNA nascente associato alla proteina tramite immunoprecipitazione di bromodeossiuridina (BrdU). Il sequenziamento di nuova generazione specifico per filamenti viene applicato al DNA ssDNA isolato. Questa tecnica può essere utilizzata per determinare se una proteina è arricchita a forchette di replicazione in testa o in ritardo. L'eSPAN fornisce la preferenza per il filamento genomico delle proteine associate alla cromatina, inclusi gli istoni ai fork di replicazione.

eSPAN può essere utilizzato per acquisire informazioni specifiche del filamento riguardo a una proteina bersaglio, come istones e modifiche agli istoni. In questo risultato rappresentativo, sono stati effettuati processi di raccolta del campione e eSPAN seguendo lo schema descritto nella Figura 2 utilizzando il sistema del lievito di gemiola. Il trattamento e la raccolta del campione seguono la condizione della fase S precoce trattata dall'idrossiurea secondo questo protocollo. Furono impieg...

L'arricchimento e il sequenziamento del DNA nascente associato alle proteine (eSPAN) sono stati sviluppati per rilevare l'abbondanza relativa di una proteina associata alla cromatina su due filamenti di DNA replicanti, rivelando così una comprensione molecolare della replicazione della cromatina e dei suoi processi accoppiati. Questo protocollo descrive le procedure eSPAN nelle cellule staminali embrionali (ES) di lievito e topi.

Analisi specifica dei filamenti di proteine in replicazione di filamenti di DNA tramite arricchimento e sequenziamento del metodo del DNA nascente associato a proteine

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single ...

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Analisi specifica dei filamenti di proteine in replicazione di filamenti di DNA tramite arricchimento e sequenziamento del metodo del DNA nascente associato a proteine

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