Analisi specifica dei filamenti di proteine in replicazione di filamenti di DNA tramite arricchimento e sequenziamento del metodo del DNA nascente associato a proteine

La nostra ricerca si concentra sui meccanismi dell'ereditarietà epigenetica. In particolare, la replicazione del DNA ha accoppiato il processo di riciclo degli istoni parentali, che rappresenta il primo passo di emissione nell'eredità epigenetica. È stato identificato che la deposizione multipla di istoni parentali, coinvolti nella replicazione del DNA, svolge un ruolo importante nel riciclaggio degli istoni parentali.

Ciò include il complesso D elicasi, la DNA polimerasi e il complesso di replicazione per la protezione. Gli approcci genetici e biochimici tradizionali sono stati i valori utilizzati in questo campo di ricerca. Tradizionalmente, vengono impiegati metodi di sequenziamento ad alto rendimento per comprendere il processo di trasferimento degli istoni parentali.

Prima che l'arricchimento e il sequenziamento del DNA associato alle proteine, o il metodo sperimentale, fosse difficile studiare il processo di trasferimento degli istoni parentali. Il metodo dell'esperimento è stato quello di fornire un potente strumento per affrontare queste domande fondamentali. Per iniziare, limare i pellet di cellule di lievito e rimetterli in sospensione con un leggero vortice.

Quindi lavare lo stesso con 0,4 millilitri di tampone di lisi CHIP contenente inibitori della proteasi e una miscela di antibiotici per prevenire la contaminazione batterica. Centrifugare il composto a 5.000 g per un minuto. Quindi, aggiungere 0,1 millilitri di tampone di lisi CHIP con inibitori della proteasi e miscela di antibiotici al pellet.

Seguito da circa 100 microlitri di perle di vetro da 0,5 millimetri. Liare le cellule mediante perline per tre cicli in una cella frigorifera a quattro gradi Celsius. Utilizzando un ago caldo calibro 16, praticare dei fori sul fondo del tubo.

Raccogliere il lisato annidando la provetta perforata in una provetta vuota da 1,5 millilitri di DNA a basso legame e centrifugare a 1.600 g per due minuti a temperatura ambiente. Aspirare con cura il surnatante senza disturbare il pellet. La frazione di detriti cellulari conterrà la cromatina.

Risospendere i pellet cellulari mediante pipettaggio in 0,35 millilitri di nucleasi micrococcica integrata o tampone di digestione MNasi. Quindi, aggiungi 10 unità di MNase alla sospensione. Mescolare delicatamente capovolgendo da quattro a sei volte e incubare in un bagnomaria a 37 gradi Celsius per 20 minuti.

Estinguere la digestione della MNasi aggiungendo cinque microlitri di EDTA 0,5 molari a una concentrazione finale di 10 millimolari. Mescolare delicatamente per capovolgimento e mettere il tubo sul ghiaccio per almeno 30 minuti. Utilizzando microprovette Bioruptor da 1,5 millilitri, sonicare la miscela di reazione ad alta potenza per tre minuti con cicli di accensione e 30 secondi di spegnimento.

Quindi, centrifugare a 10.000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il surnatante in nuove provette e centrifugare nuovamente a 10.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, raccogliere circa 400 microlitri di surnatante.

Risparmia 30 microlitri come DNA in ingresso per l'estrazione del DNA e congela a meno 20 gradi Celsius. Utilizzare i restanti 370 microlitri di lisato cellulare per l'immunoprecipitazione della cromatina istonica. Per iniziare, far bollire circa 150 microlitri dell'input precedentemente ottenuto e dei campioni CHIP H3K4me3 su un blocco termico a 100 gradi Celsius Per cinque minuti, raffreddare immediatamente il campione su ghiaccio per cinque minuti.

Quindi, aggiungere la quantità richiesta dei componenti menzionati al campione. Mutare il campione per due ore su un rotore a quattro gradi Celsius e 10 giri/min. Trasferire il composto in un tubo da 1,5 millilitri contenente 20 microlitri di perle di proteina G Sepharose lavate.

Mutare la miscela per un'ora a quattro gradi Celsius sul rotore a 10 giri/min. Centrifugare i tubi a temperatura ambiente a 800 g per un minuto. Lavare le perle tre volte con un millilitro di bromo-deossiuridina fredda, o tampone di immunoprecipitazione BrdU ruotando per tre minuti per ogni lavaggio.

Centrifugare nuovamente la provetta e lavare con un millilitro di tampone TE per tre minuti. Centrifugare nuovamente i tubi a 800 g per un minuto a temperatura ambiente e aspirare accuratamente il surnatante. Aggiungere 100 microlitri di tampone TE con l'1% di SDS alle perline.

Incubare la miscela a 65 gradi Celsius per cinque minuti, quindi centrifugare a 800 G per un minuto a temperatura ambiente. Purificare il surnatante in 18 microlitri di tampone di eluizione utilizzando colonne di purificazione del DNA per ottenere i campioni di immunoprecipitazione BrdU e H3K4me3 eSPAN. Preparare la libreria di DNA a filamento singolo con i campioni menzionati seguendo il manuale del kit di preparazione della libreria di ssDNA e DNA a basso input.

Purificare il prodotto di legatura in 20 microlitri di tampone di eluizione a basso contenuto di EDTA. Amplifica la libreria di DNA utilizzando 50 microlitri di miscela di reazione dal kit di preparazione della libreria di DNA a filamento singolo. Dopo il ciclo visualizzato, amplificare la miscela PCR.

Purificare i prodotti PCR mescolandoli con 60 microlitri di perle, preriscaldate a 30 gradi Celsius. Mescolare accuratamente i prodotti PCR e le perline. Lasciate riposare il composto a temperatura ambiente per cinque minuti.

Legare le perline su un supporto magnetico per tre minuti e lavarle due volte con 200 microlitri di etanolo all'80% appena preparato. Asciugare le perle all'aria per due minuti e diluire il DNA in 20 microlitri di tampone a basso contenuto di EDTA fornito nel kit di preparazione della libreria del DNA. Misura la concentrazione della libreria e la distribuzione delle dimensioni dei frammenti utilizzando sistemi di elettroforesi ad alta risoluzione.

Raggruppare quantità uguali di librerie individuali, tra cui l'immunoprecipitazione della cromatina H3K4me3 in ingresso, l'immunoprecipitazione BrdU, i campioni eSPAN per eseguire il sequenziamento parallelo delle estremità accoppiate. Una tipica analisi su gel della libreria di sequenziamento del DNA di H3K4me3 eSPAN ha rivelato un pattern a scala nucleosomica della cromatina. La banda principale del mononucleosoma è apparsa in 270 coppie di basi dove gli adattatori sono stati aggiunti al frammento di DNA ottenuto dalla digestione.

La diversa mappatura dei campioni ha rivelato picchi nei singoli nucleosomi che circondano l'origine, replicando autonomamente la sequenza 607 in cellule wild-type e mcm2-3A. La distorsione media del filamento ha rivelato che nelle cellule di lievito wild-type, la deposizione di istoni parentali mostrava una leggera distorsione verso il filamento in ritardo. Tuttavia, nell'istone parentale mutante H3H4 è stato trasferito al filamento principale.