Una pipeline completa per valutare l'efficienza dell'eritropoiesi umana in vitro ed ex vivo
10 gennaio 2025
La modellizzazione dell'eritropoiesi fornisce una preziosa opportunità per comprendere il significato biologico degli attori in questo processo e per valutare nuovi approcci terapeutici che possono alleviare i difetti di differenziazione. Qui, descriviamo un metodo semplice e affidabile per differenziare in modo efficiente le cellule staminali ematopoietiche CD34+ e le cellule progenitrici ex vivo.
La nostra ricerca si concentra sulle leucemie, in particolare sulle sindromi mielodisplastiche o neoplasie mielodisplastiche. È una malattia delle cellule staminali originata dalle cellule staminali ematopoietiche. Colpisce vari lignaggi di cellule del sangue, in particolare il lignaggio eritroide, che è responsabile della produzione di cellule del sangue del cuore.
L'interruzione di questo lignaggio può portare all'anemia, che è comunemente osservata nei pazienti con SMD. La pipeline che forniamo in questo articolo consente un metodo robusto e semplificato per valutare l'efficienza dell'eritroblasto umano in vitro dopo la modifica genica o il trattamento farmacologico. Le cellule staminali ematopoietiche sono presenti dalla nascita fino all'ultimo istante della nostra vita.
Non c'è più tessuto proliferativo nel nostro organismo con trilioni di cellule prodotte ogni giorno. Ci sono ancora così tante cose da capire, quindi continueremo a studiare queste incredibili cellule in tessuti amminici sani con una forte enfasi sulla proteostasi e sulla biologia dell'RNA. Per iniziare, scongelare 100.000 cellule CD34+UCB immergendo la fiala per 30 secondi in un bagno d'acqua impostato a 37 gradi Celsius.
Aggiungere un millilitro di terreno di scongelamento goccia a goccia nella fiala, quindi risospendere delicatamente le cellule pipettando su e giù. Trasferire la sospensione della cella risoluta goccia a goccia in cinque millilitri di terreno di sbrinamento. Quindi centrifugare la sospensione cellulare per otto minuti a 320 G a temperatura ambiente.
Lavare le cellule in 10 millilitri di smistamento cellulare attivato da fluorescenza o tampone FACS con DNAsi. Dopo aver centrifugato nuovamente le cellule, risospendere il pellet in due millilitri di mezzo di stimolazione. Trasferire due millilitri di sospensione cellulare in una piastra a 24 pozzetti e incubare la piastra per quattro-sei ore a 37 gradi Celsius.
Quindi raccogliere le cellule in provette di smistamento cellulare attivate dalla fluorescenza e rabboccarle con un millilitro di terreno di coltura delle cellule staminali. Dopo aver scongelato il virus, aggiungere il volume necessario ai mezzi di stimolazione per ottenere una molteplicità di infezioni di 30. Risospendere le cellule pellettate in terreni contenenti virus a una densità di 100.000 cellule per 100 microlitri di virus e trasferirle in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
Aggiungere PBS ai pozzetti vuoti e incubare per una notte a 37 gradi Celsius. Quindi trasferire l'intero volume della sospensione cellulare dal pozzetto della piastra a 96 pozzetti in provette FACS con un millilitro di terreno di coltura di cellule staminali. Lavare il pozzetto e il puntale della pipetta con terreno di coltura per cellule staminali per aggiungere due millilitri di terreno di coltura con cellule staminali alla provetta FACS.
Dopo aver centrifugato la provetta FACS, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in due millilitri di mezzo di espansione. Trasferire la sospensione in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e incubare le cellule. Per iniziare, trasferire l'intero volume di cellule CD34+ trasdotte con il reporter EGFP in una provetta FACS separata.
Centrifugare a 320 G per otto minuti a temperatura ambiente. Risospendere le cellule pellettate in 100 microlitri di tampone FACS. Aggiungere cinque microlitri di anticorpi CD34 per provetta e incubare le provette al buio a quattro gradi Celsius per 20 minuti.
Quindi risospendere le cellule in un millilitro di tampone FACS contenente DAPI e centrifugare per otto minuti a 320 G a temperatura ambiente. Dopo aver risospeso le cellule in 200 microlitri di tampone FACS contenente DAPI, filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino da 40 micrometri prima della cernita. Quindi, aggiungere 0,5 microlitri di anticorpo CD34 a una goccia di perline in 100 microlitri di PBS.
Incubare la miscela al buio a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Quindi aggiungere un millilitro di PBS al composto. Centrifugare per otto minuti a 320 g a temperatura ambiente.
Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 500 microlitri di PBS. Quindi, aggiungere le cellule leucemiche GFP-negative e GFP-positive a una provetta FACS. Lavare le cellule in un millilitro di tampone FACS.
Dopo aver centrifugato le cellule, risospendere 100.000 cellule GFP-negative e 100.000 cellule GFP-positive, ciascuna in 500 microlitri di tampone FACS. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino da 40 micrometri prima della cernita. Quindi raccogliere le cellule selezionate nel terreno delle cellule staminali.
Centrifugare le celle per otto minuti a 320 g a temperatura ambiente. Quindi risospendere le cellule in tre millilitri di terreno di differenziazione eritroide. Ora erogare un millilitro di cellule risospese in tre pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.
Riempi tutti i pozzetti esterni con PBS. Per rinfrescare il terreno, assicurarsi che le celle si siano depositate sul fondo della piastra. Appoggiare delicatamente la piastra e rimuovere 500 microlitri di supporto.
Quindi aggiungere 500 microlitri di terreno di differenziazione eritroide con citochine 2X per rinfrescare la piastra. Il sesto giorno, trasferire le cellule in una piastra a 12 pozzetti e aggiungere un millilitro di terreno a ciascun pozzetto per raggiungere un volume finale di due millilitri. Raccogliere 200 microlitri di cellule da ciascun pozzetto della piastra a 12 pozzetti.
Sostituire il volume rimosso con 250 microlitri di terreno di differenziazione eritroide 2X. Aggiungere un millilitro di tampone FACS a ciascuna provetta di raccolta. Dopo aver centrifugato le provette, risospendere le cellule pellettate in 100 microlitri di tampone FACS.
Aggiungere un microlitro ciascuno di anticorpi CD71, CD34 e CD235a alle provette. Quindi risospendere le cellule in un millilitro di tampone FACS contenente DAPI. Centrifugare le provette per otto minuti a 320 g a temperatura ambiente.
Risospendere le cellule in 200 microlitri di tampone FACS con DAPI. Impostare DAPI rispetto alla dispersione laterale o SSC per escludere le celle morte. Impostare l'altezza SSC rispetto all'area SSC per escludere gli aggregati e selezionare le singole celle.
Impostare l'area di dispersione in avanti rispetto a SSCA per rimuovere i detriti in base alle dimensioni. Impostare CD235a contro CD71. Impostare CD34 rispetto a SSCA.
Far scorrere le perle, le celle GFP-positive e le cellule colorate con DAPI. Compensare le letture e applicare la compensazione alle impostazioni del citometro. Le cellule CD34-positive del sangue del cordone ombelicale hanno mostrato un aumento delle cellule apoptotiche positive all'annessina V dal 14,4% del quarto giorno al 34,2% del giorno 17.
Il grafico a barre mostra un aumento significativo della percentuale di cellule V-positive all'annessina V entro il giorno 17, raggiungendo circa il 40%
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Panoramica
Questo studio analizza la differenziazione delle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici CD34+ ex vivo, affrontando i processi critici coinvolti nell'eritropoiesi e le sue implicazioni per il trattamento di disturbi correlati come le sindromi mielodisplastiche. Fornendo un metodo semplificato per valutare l'efficienza degli eritroblasti, la ricerca mira a migliorare la comprensione dei disturbi alla base dell'anemia in questi pazienti.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Eritropoiesi
- Sindromi mielodisplastiche
- Biologia delle cellule staminali ematopoietiche
Sfondo
- I sindromi mielodisplastici sono malattie delle cellule staminali che colpiscono le linee cellulari del sangue.
- Il deterioramento della linea eritoide può portare all'anemia.
- Comprendere le cellule staminali ematopoietiche è fondamentale poiché queste persistono per tutta la durata della vita umana.
Metodi Utilizzati
- Scongelamento e risospensione delle cellule CD34+ da sangue del cordone ombelicale
- Trasduzione cellulare con modifiche geniche
- Ordinamento cellulare attivato da fluorescenza (FACS)
Risultati principali
- Le cellule CD34+ hanno mostrato un aumento delle percentuali di apoptosi nel tempo.
- È stata dimostrata una differenziazione efficiente in eritroblasti.
- I metodi specifici sviluppati permettono la valutazione dopo modificazione genica o trattamento farmacologico.
Conclusioni
- Lo studio dimostra un metodo robusto per differenziare le cellule ematopoietiche che potrebbe portare a trattamenti più efficaci per l'anemia causata dai sindromi mielodisplastici.
- Questo lavoro sottolinea l'importanza della comprensione della differenziazione cellulare nella biologia delle cellule staminali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Una valutazione efficiente dell'eritropoiesi umana è fondamentale per ridurre i rischi nella scoperta precoce di farmaci ematologici e per comprendere i meccanismi alla base dell'anemia e dei sindromi mielodisplastici. Questa metodologia consente una valutazione robusta e quantitativa della differenziazione eritroide e della funzione genica sia in sistemi umani sani che in quelli rilevanti per le malattie. L'approccio supporta una maggiore affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi terapeutici e orienta le decisioni strategiche relative a terapie che modulano l'eritropoiesi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi della funzione genica e dell'impatto sulle vie di differenziamento della linea eritroide.
- Supporta la riduzione del rischio biologico quantificando gli effetti di perturbazioni genetiche o indotte da composti sull'eritropoiesi.
- Facilita la validazione funzionale delle proteine bersaglio in cellule staminali e progenitrici ematopoietiche umane primarie.
- Fornisce informazioni meccanicistiche sulle alterazioni rilevanti per le malattie, come quelle osservate nei sindromi mielodisplastici.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce sistemi validati in vitro e ex vivo per lo screening di composti che influenzano la differenziazione eritroide.
- Consente letture quantitative e riproducibili mediante citometria a flusso e identificazione cellulare basata su marcatori.
- Supporta la standardizzazione dei saggi per consentire il confronto tra studi e tra gruppi di ricerca.
- Prepara piattaforme scalabili per la valutazione di strategie di modulazione genica e di recupero farmacologico.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i risultati ottenuti in vitro con modelli derivati da pazienti ex vivo per garantire continuità traslazionale.
- Permette l'avanzamento dei candidati con effetti dimostrati sull'eritropoiesi, adeguato al rischio.
- Supporta lo sviluppo di biomarcatori monitorando i marcatori di differenziazione e apoptosi in diversi punti temporali.
- Fornisce una riduzione del rischio meccanicistica per la selezione di candidati preclinici nei portafogli ematologici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo integra le fasi iniziali della scoperta fino all'identificazione del composto capostipite e alla validazione preclinica in pipeline specializzate in ematologia.
- Biologia della scoperta: Quantifica gli effetti di geni e composti sulla specificazione e maturazione della linea eritoide.
- Screening: Fornisce saggi standardizzati e riproducibili basati sulla citometria a flusso per lo screening di composti e genetico.
- Analisi: Fornisce output quantitativi come tassi di apoptosi ed espressione di marcatori per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro ed ex vivo a modelli di malattia rilevanti per i pazienti.
- Riutilizzo aziendale: Offre un flusso di lavoro modulare e riutilizzabile, adattabile a diversi bersagli genici e librerie di composti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi e nella comprensione meccanicistica dell'eritropoiesi.
- Valore operativo: Standardizza i flussi di lavoro per garantire riproducibilità e scalabilità tra i diversi team di ricerca e sviluppo.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di prosecuzione o interruzione e riduce i rischi biologici in fase avanzata nei programmi di ematologia.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei bersagli e dei composti in base agli effetti eritroidi validati, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di cellule staminali ematopoietiche e nell'analisi mediante citometria a flusso.
- Necessita dell'accesso a strumentazione FACS e a pannelli di anticorpi validati per marcatori eritroidi.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le strategie di gating e l'interpretazione dei dati.
- Adattabile sia a campioni provenienti da donatori sani che da pazienti, per una maggiore applicabilità.
- Dipende da una fornitura affidabile di cellule e da un rigoroso controllo della qualità per ottenere risultati riproducibili.
