Name: Una pipeline completa per valutare lefficienza delleritropoiesi umana in vitro ed ex vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Scopri una pipeline robusta per valutare l'efficienza dell'eritropoiesi umana in vitro usando cellule CD34+ e FACS. Questo metodo semplificato aiuta a studiare le sindromi mielodisplastiche e l'anemia.

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<meta charset="utf8"></head><body>Modellazione dell'eritropoiesi utilizzando HSPC dal sangue del cordone ombelicale e dal midollo osseo

<ol><li>Sender, R., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+cellular+turnover+in+the+human+body%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The distribution of cellular turnover in the human body.</a> Nat Med. 27 (1), 45-48 (2021).</li>
<li>Cazzola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ineffective+erythropoiesis+and+its+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ineffective erythropoiesis and its treatment.</a> Blood. 139 (16), 2460-2470 (2022).</li>
<li>Silverberg, D. S., Iaina, A., Wexler, D., Blum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathological+consequences+of+anaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Haematol%22%5BJournal%5D)">The pathological consequences of anaemia.</a> Clin Lab Haematol. 23 (1), 1-6 (2001).</li>
<li>Safiri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+anemia+and+its+underlying+causes+in+204+countries+and+territories%2C+1990-2019%3A+results+from+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Burden of anemia and its underlying causes in 204 countries and territories, 1990-2019: results from the Global Burden of Disease Study 2019.</a> J Hematol Oncol. 14 (1), 185(2021).</li>
<li>Bondu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+erythroferrone+disrupts+iron+homeostasis+in+SF3B1-mutated+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A variant erythroferrone disrupts iron homeostasis in SF3B1-mutated myelodysplastic syndrome.</a> Sci Transl Med. 11 (500), eaav5467(2019).</li>
<li>Elvarsdottir, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+in+vitro+model+of+erythropoiesis+recapitulates+erythroid+failure+in+myelodysplastic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional in vitro model of erythropoiesis recapitulates erythroid failure in myelodysplastic syndromes.</a> Leukemia. 34 (1), 271-282 (2020).</li>
<li>Yip, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+L-leucine+in+5q-+syndrome+and+other+RPS14-deficient+erythroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Effects of L-leucine in 5q- syndrome and other RPS14-deficient erythroblasts.</a> Leukemia. 26 (9), 2154-2158 (2012).</li>
<li>Clough, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+missplicing+of+TMEM14C+and+ABCB7+causes+ring+sideroblast+formation+in+SF3B1-mutant+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Coordinated missplicing of TMEM14C and ABCB7 causes ring sideroblast formation in SF3B1-mutant myelodysplastic syndrome.</a> Blood. 139 (13), 2038-2049 (2022).</li>
<li>Chao, R., Gong, X., Wang, L., Wang, P., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD71%28high%29+population+represents+primitive+erythroblasts+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">CD71(high) population represents primitive erythroblasts derived from mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res. 14 (1), 30-38 (2015).</li>
<li>Loken, M. R., Shah, V. O., Dattilio, K. L., Civin, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+human+bone+marrow%3A+I.+Normal+erythroid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of human bone marrow: I. Normal erythroid development.</a> Blood. 69 (1), 255-263 (1987).</li>
<li>Marsee, D. K., Pinkus, G. S., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD71+%28transferrin+receptor%29%3A+an+effective+marker+for+erythroid+precursors+in+bone+marrow+biopsy+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">CD71 (transferrin receptor): an effective marker for erythroid precursors in bone marrow biopsy specimens.</a> Am J Clin Pathol. 134 (3), 429-435 (2010).</li>
<li>Berastegui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+DDIT3+is+a+potential+driver+of+dyserythropoiesis+in+myelodysplastic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The transcription factor DDIT3 is a potential driver of dyserythropoiesis in myelodysplastic syndromes.</a> Nat Commun. 13 (1), 7619(2022).</li>
<li>Mian, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+B5+and+succinyl-CoA+improve+ineffective+erythropoiesis+in+SF3B1-mutated+myelodysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Vitamin B5 and succinyl-CoA improve ineffective erythropoiesis in SF3B1-mutated myelodysplasia.</a> Sci Transl Med. 15 (685), eabn5135(2023).</li>
<li>Armes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+ERCC+excision+repair+6+like+2+%28ERCC6L2%29+mutations+lead+to+impaired+erythropoiesis+and+reshaping+of+the+bone+marrow+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Germline ERCC excision repair 6 like 2 (ERCC6L2) mutations lead to impaired erythropoiesis and reshaping of the bone marrow microenvironment.</a> Br J Haematol. 199 (5), 754-764 (2022).</li>
<li>Hug, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+role+for+the+RNA+helicase+DHX34+in+NMD+and+pre-mRNA+splicing+and+its+function+in+hematopoietic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A dual role for the RNA helicase DHX34 in NMD and pre-mRNA splicing and its function in hematopoietic differentiation.</a> RNA. 28 (9), 1224-1238 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2x HEPES</td><td>Merck</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Perline</td><td>Thermo Scientific</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>CD235a APC Cy7</td><td>Biolegend</td><td>349115</td><td></td></tr><tr><td>CD34 PerCP Cy5.5 anticorpo</td><td>BD Biosciences</td><td>347222</td><td></td></tr><tr><td>CD71 PE anticorpo</td><td>Biolegend 334106</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Merck</td><td>D4527-200KU</td><td></td></tr><tr><td>DPX supporto di montaggio&nbsp;</td><td>VWR</td><td>1.00579.0500</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria Fusion&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Merck</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Merck</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di Giemsa</td><td>Abcam</td><td>ab150670</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck</td><td>H0887-100mL</td><td></td></tr><tr><td>EPO umano</td><td>PeproTech</td><td>100-64</td><td></td></tr><tr><td>Ligando Flt-3 umano</td><td>PeproTech</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>Umano G-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-23</td><td></td></tr><tr><td>Umano IGF1</td><td>PeproTech</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>Umano IL-6</td><td>PeproTech</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>Umano SCF</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>Umano TPO</td><td>PeproTech</td><td>AF-300-18</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa Cell Analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>May-Grunwald soluzione&nbsp;</td><td>Scanner ad alta produttività Generon</td><td>26250-01</td><td></td></tr><tr><td>Pannoramic 250&nbsp;</td><td>3DHISTECH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytospin 3&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>Cellule</td> staminali NA <td></td></tr><tr><td>Medium Tecnologie delle cellule staminali</td><td>medie</td><td>9655</td><td></td></tr></tbody></table>

una pipeline completa per valutare l'efficienza dell'eritropoiesi umana in vitro ed ex vivo

A Comprehensive Pipeline to Assess the Efficiency of Human Erythropoiesis In Vitro and Ex Vivo

Le cellule CD34+ del sangue del cordone ombelicale o del midollo osseo vengono prima scongelate, stimolate e trasdotte con uno shRNA che esprime GFP (Figura 1A). Le cellule CD34+GFP+ vengono selezionate 4 giorni dopo la trasduzione, secondo la strategia di gating illustrata nella Figura 1B. I risultati rappresentativi hanno mostrato la maturazione delle cellule CD34+ dopo la trasduzione e lo smistamento FACS. Le cellul...

Una pipeline completa per valutare l'efficienza dell'eritropoiesi umana in vitro ed ex vivo

Erythropoiesis, a remarkably dynamic and efficient process responsible for generating the daily quota of red blood cells (approximately 280 &plusmn; 20 ...

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Un metodo di citometria a flusso per l'identificazione e l'analisi molecolare di cellule progenitrici murino differenziazione fase-specifici eritroide e precursori, direttamente nel midollo del mouse appena raccolte osseo, milza o del fegato fetale. Il test si basa sulla superficie cellulare marker CD71, Ter119, e le dimensioni delle cellule.

Identificazione e analisi dei mouse progenitori eritroidi utilizzando il CD71/TER119 Flow-citometria Assay

Lentivirali-mediata Knockdown Durante Ex Vivo</emEritropoiesi> di cellule staminali emopoietiche

Un sistema di coltura 3D per ematopoiesi è descritta utilizzando sangue umano corda e leucemiche cellule del midollo osseo. Il metodo si basa sull'impiego di un poliuretano poroso scaffold sintetico rivestito con proteine ​​della matrice extracellulare. Questa impalcatura è adattabile per soddisfare una vasta gamma di celle.

Ex vivo Mimicry di emopoiesi normale e anormale umana

Il presente protocollo descrive un nuovo metodo di identificazione di una popolazione di enucleare eritroblasti ortocromatiche dal flusso di imaging multispettrale citometria, fornendo una visualizzazione del processo di enucleazione eritroblasti.

Identificazione di un Murine eritroblasto sottopopolazione Enriched in enucleare Eventi da Multi-spettrale Imaging Citometria a Flusso

Vi presentiamo un mouse fetale sistema di coltura in vitro eritroblasto fegato che analizza le fasi precoce e tardiva dell'eritropoiesi terminale. Questo sistema facilita l'analisi funzionale di geni specifici in diversi stadi di sviluppo.

Mouse fetale Fegato Cultura di sistema per sezionare Funzioni gene bersaglio nelle fasi precoci e tardivi del Terminal eritropoiesi

È necessaria per monitorare attecchimento dopo trapianto di cellule staminali in pazienti con emoglobinopatie quantificazione delle cellule derivate dal donatore. Una combinazione di flusso cytometry-base cella ordinamento, analisi di formazione della Colonia e successiva analisi del tandem brevi ripetizioni possono essere utilizzati per valutare la proliferazione e il differenziamento dei progenitori nel vano degli eritrociti.

Rilevamento di cellule progenitrici eritroidi di donatore residua dopo trapianto di cellule staminali ematopoietiche per i pazienti con emoglobinopatie

Qui vi presentiamo le tecniche per misurare la deformabilità del globulo rosso ed eterogeneità cellulare di ektacitometria. Queste tecniche sono applicabili a indagini generali di deformabilità del globulo rosso e indagini specifiche di malattie del sangue caratterizzate dalla presenza di globuli rossi sia rigidi sia deformabili in circolazione, quali anemia falciforme.

Misurazione di deformabilità e l'eterogeneità delle cellule rosse nel sangue di ektacitometria

Qui, presentiamo un protocollo per formare con precisione l'endotelio emogenico dalle cellule staminali pluripotenti umane in una condizione senza alimentatore e xeno. Questo metodo avrà ampie applicazioni nella modellazione della malattia e nello screening per i composti terapeutici.

Differenziazione dell'endotelio endogenico dalle cellule staminali pluripotenti umane in una condizione definita senza alimentatore e Xeno

Il metodo qui presentato riassume i protocolli ottimizzati per la valutazione della bioenergetica cellulare nelle cellule staminali ematopoietiche non aderenti del topo e nelle cellule progenitrici primitive (HSPC) utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare per misurare il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) e il tasso di consumo di ossigeno (OCR) degli HSPC in tempo reale.

Valutazione della bioenergetica cellulare in cellule staminali ematopoietiche di topo e progenitrici primitive utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare

Qui, descriviamo un nuovo metodo citometrico a flusso per l'isolamento prospettico dei progenitori eritroidi dell'unità esplosiva precoce (BFU-e) e dell'unità eritroide formante colonie (CFU-e) direttamente dal midollo osseo e dalla milza freschi di topo. Questo protocollo, sviluppato sulla base di dati trascrittomici a singola cellula, è il primo a isolare tutti i progenitori eritroidi del tessuto con elevata purezza.

Identificazione e isolamento di progenitori eritroidi dell'unità burst-forming e dell'unità formante colonie da tessuto murino mediante citometria a flusso

Questo protocollo delinea una procedura per indurre la differenziazione delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche umane derivate dal midollo osseo del paziente e dalle cellule mononucleari del sangue periferico. Il test utilizza un mezzo di coltura semisolida che supporta l'impegno della linea eritroide e mieloide e incorpora metriche standardizzate per la classificazione delle colonie riproducibili per la caratterizzazione preclinica dei farmaci.

Test unitario formativo di colonie adattato per cellule mononucleari derivate dal paziente nel midollo osseo e nel sangue periferico

Scopri una pipeline robusta per valutare l'efficienza dell'eritropoiesi umana in vitro usando cellule CD34+ e FACS. Questo metodo semplificato aiuta a studiare le sindromi mielodisplastiche e l'anemia.

Una pipeline completa per valutare l'efficienza dell'eritropoiesi umana in vitro ed ex vivo

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