Tecnica di nuoto orizzontale a forma di U per la preparazione di spermatozoi di alta qualità con basso indice di frammentazione del DNA

[Narratore] La ricerca si concentra su un metodo per l'ottimizzazione degli spermatozoi, con l'obiettivo di determinare se la tecnica UHS offre vantaggi nella preparazione di spermatozoi di alta qualità con un basso indice di frammentazione del DNA. La tecnologia microfluidica è stata utilizzata per ottimizzare la selezione di spermatozoi di alta qualità con DFI più basso. Il limite principale del metodo UHS è la sua elevata dipendenza dalla capacità di auto-nuoto di spermatozoi di alta qualità. Il metodo UHS non è adatto a pazienti con spermatozoi completamente immobili. La tigmotassi svolge un ruolo cruciale nella separazione degli spermatozoi. L'orbita a forma di U ha un bordo più lungo, che facilita il libero movimento di spermatozoi di alta qualità, consentendo la loro completa separazione da spermatozoi immobili, impurità e altri componenti. Rispetto alla tecnica DGC, il metodo UHS lane comporta meno passaggi operativi manuali per il personale di laboratorio e gli spermatozoi di alta qualità ottenuti attraverso il metodo UHS lane non subiscono ripetute procedure di centrifugazione, con conseguente DFI inferiore. Per iniziare, aggiungere 20 microlitri di terreno di fertilizzazione al piatto operatorio per creare tracce a forma di U. Aspirare 10 microlitri di terreno di concimazione con una pipetta per creare una gocciolina circolare nel punto di partenza sinistro del binario a forma di U. Utilizzando il terreno di fertilizzazione, creare due goccioline tampone di 10 microlitri ciascuna a intervalli lungo la sezione centrale sinistra del binario a forma di U. Collegare tutte le goccioline con il mezzo di fertilizzazione per formare una traccia continua. Utilizzare 2,5 microlitri di polivinilpirrolidone, o PVP, per creare una lunga striscia di gocciolina di liquido sul lato destro del binario a forma di U. Creare sei microgoccioline utilizzando il terreno di lavorazione degli ovociti sul lato destro della striscia PVP. Aggiungi sette millilitri di olio di coltura al piatto, assicurandoti che l'olio copra completamente il punto più alto delle goccioline. Metti il piatto in un incubatore a 37 gradi Celsius, 6% di anidride carbonica durante la notte per equilibrarlo. Dopo aver raccolto lo sperma, misurarne il volume con il metodo della pesatura, garantendo una precisione di 0,01 millilitri. Posizionare il campione di sperma in un ambiente a 37 gradi Celsius per 15-30 minuti e aspirarlo in una pipetta monouso di plastica a foro largo. Se lo sperma non si liquefa entro 60 minuti, aggiungere una quantità uguale di terreno di fertilizzazione. Inspirare ed espirare ripetutamente la miscela utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica monouso fino a quando non si liquefa completamente. Misurare il valore del pH dello sperma utilizzando una carta per test di pH di precisione con un intervallo da sei a 10. Prelevare 10 microlitri di sperma completamente liquefatto e gocciolarlo su una camera di conteggio maculare. Valutare la motilità degli spermatozoi in un campo 200X utilizzando un microscopio ottico. Aggiungere cinque microlitri di sperma alla microgocciolina del terreno di fertilizzazione nel punto di partenza sinistro della pista a forma di U nel piatto operatorio ICSI. Regolare l'angolazione e la posizione dell'ago che trattiene gli ovociti e dell'ago per iniezione sotto la lente dell'obiettivo 4X. Dopo aver verificato la configurazione, trasferire l'ovocita selezionato nella microgocciolina del terreno di processamento degli ovociti nel piatto operatorio ICSI. Posizionare la capsula operatoria contenente gli ovociti sul tavolino caldo dell'operatore del microscopio preparato. Dopo aver regolato la messa a fuoco, abbassare l'ago di iniezione nella striscia PVP del piatto operatorio ICSI. Spostare l'ago per iniezione nella lunga striscia sul lato destro della pista a forma di U ed estrarre spermatozoi di alta qualità. Trasferire lo sperma nella striscia PVP sul lato destro e posizionare lo sperma sul fondo del piatto operatorio. Premere delicatamente l'ago per iniezione nella sezione centrale o inferiore della coda dello sperma. Tira indietro rapidamente l'ago per iniezione e gratta lo sperma per immobilizzarlo. Ora, inspira lo sperma dalla coda alla testa nell'ago per iniezione. Iniettare lentamente lo spermatozoo nel citoplasma dell'ovocita e incubare l'ovocita iniettato. Aggiungere 1,5 millilitri di soluzione di centrifugazione in gradiente di densità al 45% a una provetta sterile a fondo conico da 15 millilitri. E aggiungere lentamente 1,5 millilitri di soluzione di centrifugazione in gradiente di densità al 90% sul fondo della soluzione con gradiente al 45%. A questo punto, aggiungere il seme liquefatto alla soluzione di centrifugazione in gradiente e centrifugare la provetta a 300 g per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso il surnatante, raccogliere circa 0,5 millilitri del sedimento spermatico rimanente e mescolarlo con tre millilitri di terreno di fertilizzazione. Centrifugare il composto a 200 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Pipettare con cura il surnatante, lasciando circa 0,2 millilitri di sedimento, quindi agitare e mescolare per risospendere il sedimento. Infine, contare la concentrazione e la motilità degli spermatozoi prima di conservare il campione in un incubatore a 37 gradi Celsius, con il 6% di anidride carbonica per un uso successivo. Mettere un tubo contenente 25 microlitri di soluzione di agarosio a basso punto di fusione in un bagnomaria a 90-100 gradi Celsius per uno o due minuti. Quindi trasferire il tubo in un bagnomaria a 37 gradi Celsius per cinque minuti fino a quando la temperatura non si stabilizza. Aggiungere da tre a 10 microlitri di sperma alle provette di agarosio a basso punto di fusione e mescolare accuratamente. Versare 30 microlitri di miscela su un vetrino pretrattato in posizione orizzontale. Dopo la copertura, posizionare il vetrino pretrattato in frigorifero a una temperatura compresa tra due e otto gradi Celsius per quattro minuti, assicurandosi che rimanga in posizione orizzontale. Rimuovere il vetrino dal frigorifero e sfilare delicatamente il vetro di copertura. Immergere rapidamente il vetrino pretrattato in soluzione denaturante per sette minuti. Rimuovere il carrello e posizionarlo in posizione verticale. Quindi utilizzare la carta da filtro per assorbire le goccioline d'acqua in eccesso senza toccare l'area del campione. Lavare il vetrino in acqua distillata per cinque secondi. Immergere il vetrino in serie nelle soluzioni appropriate per il periodo specifico. Quindi, mantenendo orizzontale il vetrino in vetro pretrattato, aggiungere circa un millilitro della soluzione colorante miscelata sul vetrino. Dopo aver colorato per cinque minuti, sciacquare delicatamente il vetrino con acqua distillata da 10 a 15 volte. Gli spermatozoi di alta qualità con una buona motilità progressiva nuotavano dolcemente lungo il bordo del binario a forma di U, facilitando l'assunzione individuale da parte dell'ago per iniezione intracitoplasmatica degli spermatozoi. Mentre gli spermatozoi buoni sono stati ottenuti utilizzando entrambi i metodi, l'indice di frammentazione del DNA di spermatozoi di alta qualità separati con il metodo di centrifugazione a gradiente di densità era significativamente più alto rispetto al metodo di nuoto orizzontale a forma di U.