Visualizzazione in vivo dei transitori di calcio durante la fecondazione e lo sviluppo precoce in C. elegans

La produzione di embrioni vitali è un processo complesso. Il nostro obiettivo generale è quello di definire i segnali cellulari che coordinano la transizione da un ovocita a un embrione. Il reporter CaFE è un nuovo strumento sviluppato per visualizzare i segnali del calcio che si verificano dopo la fecondazione e durante l'embriogenesi precoce.

Utilizzando il reporter CaFE, abbiamo scoperto un'ondata di calcio ritardata negli ovociti che vengono ovulati prematuramente. Abbiamo anche scoperto la presenza di transitori di calcio a singola cellula durante l'embriogenesi precoce. Entrambi i risultati illustrano l'utilità di un indicatore di calcio geneticamente codificato durante lo sviluppo precoce.

Le tecniche precedenti per visualizzare gli ovociti di calcio si basavano sull'iniezione di colorante nella gonade. Questa tecnica è laboriosa e richiede attrezzature specializzate per microiniezioni. Il reporter CaFE consente una facile visualizzazione dell'onda di calcio negli ovociti e negli embrioni con attrezzature ampiamente disponibili.

Il CaFE Reporter facilita l'indagine sui tempi e sulla regolazione della segnalazione del calcio negli ovociti e negli embrioni. Questo reporter può essere facilmente combinato con mutanti, marcatori e knockdown di RNAi esistenti per scoprire il comportamento del calcio rispetto ad altri eventi fondamentali durante l'embriogenesi precoce, come la maturazione miotica. Per iniziare, afferra il manico del plettro e allenta il collare d'argento verso la sua testa in modo che le quattro sezioni si separino.

Posiziona un filo di platino da 1,5 pollici al centro delle quattro sezioni. Tenere il filo al centro mentre si stringe il collare per unire le quattro sezioni. Usando un paio di pinze a becchi piatti, modella con cura il filo e fissa ripetutamente l'estremità del filo per creare un piede di circa due o tre millimetri.

Usa questo piedino per raccogliere i vermi. Preparare una soluzione di agarosio al 3% in acqua e scaldarla al microonde fino a quando l'agarosio non si scioglie completamente. Posizionare un vetrino da microscopio vuoto tra altri due vetrini da microscopio che hanno un singolo strato di nastro da laboratorio lungo l'asse lungo.

Utilizzando una pipetta da un millilitro, far cadere la soluzione riscaldata di agarosio al 3% al centro del vetrino bianco. Posizionare rapidamente un nuovo vetrino da microscopio sulla gocciolina di agarosio, perpendicolarmente al vetrino bianco, con la gocciolina appoggiata sui vetrini adiacenti con nastro adesivo, quindi separare delicatamente i vetrini, mantenendo intatto il tampone. Usando una pipetta da 20 microlitri, aggiungere una piccola goccia di levamisolo da un millimolare in tampone M9 al centro del tampone di agarosio per paralizzare i vermi.

Raccogli almeno cinque vermi sincronizzati e tocca delicatamente il piede del manico del verme con la gocciolina di levamisolo per trasferire i vermi. Coprire accuratamente il tampone di agarosio con un vetrino coprioggetti. Controllare la posizione dei vermi, poiché il vetrino coprioggetti può causare la dispersione dei vermi.

Etichettare il vetrino del microscopio con i dettagli appropriati, come il nome del ceppo di verme. Localizzare i vermi utilizzando un obiettivo a bassa potenza sul microscopio utilizzando l'illuminazione a campo chiaro. Utilizzare un obiettivo ad aria minimo 20x o un obiettivo a immersione 40x per visualizzare chiaramente l'onda di calcio negli ovociti.

Per una visualizzazione ottimale dei reporter fluorescenti, regolare il guadagno o il tempo di esposizione per i canali GFP e RFP. Esamina ogni ovocita meno uno nei bracci delle gonadi del verme per determinare se un evento di fecondazione è imminente. Dopo la rottura dell'involucro nucleare, il citoscheletro dell'ovocita meno uno più prossimale si riorganizzerà, assumerà un aspetto arrotondato e si separerà dall'ovocita meno due.

Quando l'ovulazione si verifica imminente, inizia immediatamente a registrare il video in un ambiente ad ampio campo. L'ovocita prossimale è indicato con il meno uno direttamente prima della spermateca, dove sono conservati gli spermatozoi. L'embrione più recente si trova più vicino alla spermateca, ma all'interno dell'utero.

L'onda di calcio ha mostrato un modello bifasico, iniziando con una rapida esplosione seguita da un'onda di fluorescenza che si muoveva dal punto di ingresso verso il polo opposto. Un segnale di calcio è stato osservato immediatamente dopo l'ingresso nella spermateca nell'ovocita meno uno principale, ma non nell'ovocita meno due finale. Gli embrioni in utero ed ex-utero hanno mostrato un segnale di fluorescenza in una singola cellula durante l'embriogenesi.