Name: Visualizzazione in vivo dei transitori di calcio durante la fecondazione e lo sviluppo precoce in C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 11 s
Description: Scopri la visualizzazione dei transitori di calcio durante la fecondazione e lo sviluppo precoce in C. elegans utilizzando il reporter CaFE. Questo metodo genetico semplifica lo studio della segnalazione calcica in vivo.

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<meta charset="utf8"></head><body>Monitoraggio del calcio nelle prime fasi di sviluppo di C. elegans

<ol><li>Stein, P., Savy, V., Williams, A. M., Williams, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulators+of+calcium+signalling+at+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulators of calcium signalling at fertilization.</a> Open Biol. 10 (7), 200118(2020).</li>
<li>McAvey, B. A., Wortzman, G. B., Williams, C. J., Evans, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+calcium+signaling+and+the+actin+cytoskeleton+in+the+membrane+block+to+polyspermy+in+mouse+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Biolo+Reprod%22%5BJournal%5D)">Involvement of calcium signaling and the actin cytoskeleton in the membrane block to polyspermy in mouse eggs.</a> Biolo Reprod. 67 (4), 1342-1352 (2002).</li>
<li>Takayama, J., Onami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sperm+TRP-3+channel+mediates+the+onset+of+a+Ca+2%2B+wave+in+the+fertilized+C.+elegans+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The sperm TRP-3 channel mediates the onset of a Ca 2+ wave in the fertilized C. elegans oocyte.</a> Cell Rep. 15 (3), 625-637 (2016).</li>
<li>Yamamoto, I., Kosinski, M. E., Greenstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Start+me+up%3A+Cell+signaling+and+the+journey+from+oocyte+to+embryo+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Start me up: Cell signaling and the journey from oocyte to embryo in C. elegans.</a> Dev Dyn. 235 (3), 571-585 (2006).</li>
<li>Hubbard, E. J. A., Greenstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+gonad%3A+A+test+tube+for+cell+and+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans gonad: A test tube for cell and developmental biology.</a> Dev Dyn. 218 (1), 2-22 (2000).</li>
<li>Korta, D. Z., Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soma-germline+interactions+that+influence+germline+proliferation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Soma-germline interactions that influence germline proliferation in Caenorhabditis elegans.</a> Dev Dyn. 239 (5), 1449-1459 (2010).</li>
<li>Toperzer, K. M., Brennan, S. J., Carroll, D. J., Guisbert, E. A., Kim Guisbert,, S, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+biphasic+calcium+wave+during+fertilization+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+genetically+encoded+calcium+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Visualization of the biphasic calcium wave during fertilization in Caenorhabditis elegans using a genetically encoded calcium indicator.</a> Biol Open. 12 (9), 059832(2023).</li>
<li>Samuel, A. D., Murthy, V. N., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics+during+fertilization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics during fertilization in C. elegans.</a> BMC Dev Biol. 1 (1), 8(2001).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nat Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+methods+for+measuring+induction+of+the+heat+shock+response+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Standardized methods for measuring induction of the heat shock response in Caenorhabditis elegans.</a> J Vis Exp. (161), e61030(2020).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Kamath, R., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30 (4), 313-321 (2003).</li>
<li>Kachur, T. M., Audhya, A., Pilgrim, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNC-45+is+required+for+NMY-2+contractile+function+in+early+embryonic+polarity+establishment+and+germline+cellularization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">UNC-45 is required for NMY-2 contractile function in early embryonic polarity establishment and germline cellularization in C. elegans.</a> Dev Biol. 314 (2), 287-299 (2008).</li>
<li>Takayama, J., Fujita, M., Onami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+live+imaging+of+calcium+waves+and+other+cellular+processes+during+fertilization+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo live imaging of calcium waves and other cellular processes during fertilization in Caenorhabditis elegans.</a> Bio Protoc. 7 (7), e2205(2017).</li>
<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Conte, D., MacNeil, L. T., Walhout, A. J. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA Interference in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Protoc Mol Biol. 109, 1-30 (2015).</li>
<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Reboul, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+ORFeome+version+1.1%3A+experimental+verification+of+the+genome+annotation+and+resource+for+proteome-scale+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">elegans ORFeome version 1.1: experimental verification of the genome annotation and resource for proteome-scale protein expression.</a> Nat Genet. 34 (1), 35-41 (2003).</li>
<li>Bui, Y. K., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+inositol+5-phosphatase+homolog+negatively+regulates+inositol+1%2C4%2C5-triphosphate+signaling+in+ovulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans inositol 5-phosphatase homolog negatively regulates inositol 1,4,5-triphosphate signaling in ovulation.</a> Mol Biol Cell. 13 (5), 1641-1651 (2002).</li>
<li>Muto, A., Kume, S., Inoue, T., Okano, H., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+waves+along+the+cleavage+furrows+in+cleavage-stage+Xenopus+embryos+and+its+inhibition+by+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium waves along the cleavage furrows in cleavage-stage Xenopus embryos and its inhibition by heparin.</a> J Cell Biol. 135 (1), 181-190 (1996).</li>
<li>Paudel, S., Sindelar, R., Saha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+vertebrate+development+and+its+role+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in vertebrate development and its role in disease.</a> Int J Mol Sci. 19 (11), 3390(2018).</li>
<li>Paudel, S., Yue, M., Nalamalapu, R., Saha, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+calcium+code%3A+A+review+of+calcium+activity+analysis+methods+employed+to+identify+meaningful+activity+in+early+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Deciphering the calcium code: A review of calcium activity analysis methods employed to identify meaningful activity in early neural development.</a> Biomolecules. 14 (1), 138(2024).</li>
<li>Goldstein, B., Hird, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+the+anteroposterior+axis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Specification of the anteroposterior axis in Caenorhabditis elegans.</a> Development. 122 (5), 1467-1474 (1996).</li>
<li>Johnston, W. L., Dennis, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eggshell+in+the+C.+elegans+oocyte-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">The eggshell in the C. elegans oocyte-to-embryo transition.</a> Genesis. 50 (4), 333-349 (2012).</li>
<li>Stevenson, Z. C., Moerdyk-Schauwecker, M. J., Jamison, B., Phillips, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+self-selecting+and+clone-free+integration+of+transgenes+into+engineered+CRISPR+safe+harbor+locations+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Rapid self-selecting and clone-free integration of transgenes into engineered CRISPR safe harbor locations in Caenorhabditis elegans.</a> G3. 10 (10), Bethesda. 3775-3782 (2020).</li>
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<li>Webb, S. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+during+zebrafish+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling during zebrafish embryonic development.</a> BioEssays. 22 (2), 113-123 (2000).</li>
<li>Wiseman, E., Carroll, D. J., Fowler, S. R., Guisbert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iteration+in+an+inquiry-based+undergraduate+laboratory+strengthens+student+engagement+and+incorporation+of+scientific+skills%5BTitle%5D)+AND+%22J+Scholarsh+Teach+Learn%22%5BJournal%5D)">Iteration in an inquiry-based undergraduate laboratory strengthens student engagement and incorporation of scientific skills.</a> J Scholarsh Teach Learn. 20 (2), 99-112 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-07-4</td><td>2 kg; La polvere si dissolve più facilmente dei fiocchi</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>MidSci</td><td>BE-A125</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Lampada ad alcool</td><td>Fisher Scientific</td><td>S13475</td><td>Utilizzare con il 95% di etanolo</td></tr><tr><td>Cloruro di ammonio (NH4Cl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1500030</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td>5 g</td></tr><tr><td>AMSCO Serie 400 Sterilizzatore a vapore piccolo</td><td>Steris Healthcare</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1420-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Bacto-triptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0123-17-3</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio (CaCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C69-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Colesterolo</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11470.18</td><td>50 g</td></tr><tr><td>Dragonfly 200 disco rotante confocale</td><td>Oxford Instruments Andor</td><td>N/A</td><td>Utilizzato con il microscopio Leica</td></tr><tr><td>Fisherbrand Vetrini per microscopio citogenico Superfrost</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-035-900</td><td>144 vetrini per confezione</td></tr><tr><td>Pinze a becchi piatti, ganasce lisce</td><td>Home Depot</td><td>305530604</td><td>Assicurarsi che le pinze siano a ganasce lisce</td></tr><tr><td>Isopropil &beta;- d-1-tiogalattopiranoside&nbsp;( IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td><td>10 g; senza diossano</td></tr><tr><td>Nastro da laboratorio</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-10R</td> Il <td>nastro da 0,5 pollici viene utilizzato per il nastro adesivo per microscopio</td></tr><tr><td>Levamisolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC187870100</td><td>10 g</td></tr><tr><td>Solfato di magnesio (MgSO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Vetro di copertura per microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12541016</td><td>confezione da 1 oz</td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE Ti2 scansione laser confocale</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nikon NIS Elements software</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>Confocal</td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Filo di platino</td><td>TriTech</td><td>PT-9010</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio bibasico (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA1159436</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico eptaidrato (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S471-3</td><td>3 kg</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Leica</td><td>KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>Petri sterile piastra (35 mm x 10 mm)</td><td>CellTreat</td><td>229638</td><td>960 piastre di Petri per confezione</td></tr><tr><td>Piastra di Petri sterile (60 mm x 15 mm)</td><td>CellTreat</td><td>229665</td><td>500 piastre di Petri per scatola</td></tr><tr><td>Ceppo EAG16 spn-4p::jGCaMP7s::p ie-1u</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>EAG16</td><td>Creato da Kim Guisbert Lab</td></tr><tr><td>Ceppo EAG25 spn-4p::jGCaMP7s:: torta-1u; ujIs113 II.</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>EAG25</td><td>Creato da Kim Guisbert Lab</td></tr><tr><td>Strain EAG28 spn-4p::jGCaMP7s::p ie-1u; unc-119(ed3) III; ltIs44 V.</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>EAG28</td><td>Creato da Kim Guisbert Lab</td></tr><tr><td>Strain JIM113 ujIs113 II [pie-1p::mCherry::H2B::p ie-1 3'UTR + nhr-2p:: his-24::mCherry::let-858 3'UTR + unc-119(+)]</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>JIM113</td><td>Creato da E. Preston - Murray Lab</td></tr><tr><td>Strain OD70 unc-119(ed3) III; ltIs44 V [pie-1p::mCherry::P H(PLC1delta1) + unc-119(+)]</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OD70</td><td>Creato da Audhya/Oegema - Greenstein Lab</td></tr><tr><td>Tritech Worm Pick Handle</td><td>TriTech</td><td>TWPH1</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>IBI Scientific</td><td>IB49160</td><td>500 g</td></tr></tbody></table>

visualizzazione in vivo dei transitori di calcio durante la fecondazione e lo sviluppo precoce in c. elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Utilizzando i protocolli delineati in questo manoscritto, i modelli dinamici di segnalazione del calcio nella fecondazione e nell'embriogenesi sono stati osservati in C. elegans.
Una tipica sequenza di fecondazione nei vermi contenenti il reporter CaFE è mostrata nella Figura 2. Per facilitare l'analisi, è stato utilizzato il ceppo EAG28 che combina il reporter CaFE con un transgene13 del dominio di omologia della pleckstrin (PH-mCherry). Il marcatore PH-mCherry si localizza sulla membrana plasmatica e consente una più facile visualizzazione dei confini cellulari, in particolare nel braccio delle gonadi. Il ceppo EAG28 è stato creato incrociando il ceppo EAG16 contenente il reporter CaFE con il ceppo reporter OD70 PH-mCherry13. In C. elegans, l'ovulazione e la fecondazione avvengono contemporaneamente. Il tempo 0 della fecondazione è considerato il primo fotogramma in cui viene rilevato un segnale di fluorescenza nell'ovocita in ovulazione (Figura 2). Un'esplosione luminosa di fluorescenza si verifica nel sito di fusione degli spermatozoi non appena il bordo anteriore dell'ovocita entra nella spermateca, l'organo di stoccaggio degli spermatozoi7. Il segnale appare prima che l'ovulazione sia completa. L'onda di calcio è bifasica, con una rapida esplosione iniziale seguita da un'onda di fluorescenza dal punto di ingresso verso il polo opposto. L'intero ovocita diventa fluorescente in &lt;30 s.
Si noti che il reporter CaFE è in una singola copia e, quindi, il segnale non è così luminoso come altri transgeni. Il time-lapse Z-stack non è raccomandato durante l'ovulazione a meno che non sia disponibile e ottimizzato un confocale a disco rotante. Le immagini Z stack possono essere ottenute prima o dopo un filmato per catturare i cambiamenti 3D nella morfologia delle gonadi. Sebbene le immagini qui siano state scattate con un microscopio confocale, i transienti sono stati osservati anche utilizzando la microscopia a fluorescenza a campo largo, che è più comune ed economica di quella confocale. Utilizzando una scansione confocale laser, la frequenza dei fotogrammi è di circa 1 fps. Utilizzando un confocale a disco rotante, la frequenza dei fotogrammi è di 10 fps o superiore. Il segnale di fondo del reporter CaFE è sufficiente per illuminare gli ovociti in maturazione nel braccio delle gonadi. Dopo la fecondazione, si osserva tipicamente un aumento di 1,5-2 volte dell'intensità del segnale GFP.
Esistono diversi metodi alternativi per la quantificazione. Ad esempio, il software di analisi delle immagini Imaris, creato da Oxford Instruments (la stessa società madre del microscopio confocale a disco rotante Andor Dragonfly), ha la capacità di quantificare il segnale in ogni fotogramma proveniente solo dall'ovocita in transito invece di un ROI maggiore. Tuttavia, il software Imaris non è gratuito. Inoltre, una strategia dettagliata di analisi delle immagini per misurare le onde di calcio nell'ovocita è stata descritta in modo estremamente dettagliato da Takayama, Fujita e Onami e utilizza ImageJ, che è disponibile gratuitamente14. In alternativa, i chimografi per illustrare l'onda del segnale fluorescente attraverso un singolo ovocita richiedono una manipolazione dell'immagine più estesa di quella descritta qui, ma sono descritti in Takayama e Onami3.
Un netto vantaggio di C. elegans è la sua capacità di abbattere l'espressione di quasi tutti i geni alimentando i vermi con batteri che esprimono dsRNA per innescare l'RNAi endogeno15,16. Per un'espressione ottimale del dsRNA, sia le piastre RNAi che la coltura di RNAi saturi contengono IPTG. Il dsRNA è prodotto esprimendo il gene di interesse con i promotori fiancheggiatori. Qui, abbiamo utilizzato la libreria Ahringer che prende di mira la maggior parte del genoma del verme attraverso l'uso di 16.256 ceppi batterici17. In alternativa, un ORFeome di ~11.000 cloni di RNAi è stato creato dal laboratorio Vidal utilizzando il sistema Gateway ed è disponibile per l'acquisto tramite Horizon Discovery18.
Per dimostrare l'utilità del reporter CaFE in combinazione con l'RNAi, abbiamo esaminato l'ovulazione prematura. Una delezione parziale in ipp-5 induce un doppio evento di ovulazione in cui sia l'ovocita -1 che l'ovocita -2 entrano nella spermateca durante la stessa ovulazione19. IPP-5 è una fosfatasi che agisce su IP3 e diminuisce efficacemente i livelli del secondo messaggero IP3. Abbiamo scoperto che il knockdown RNAi di ipp-5 suscita un fenotipo di doppia ovulazione simile al mutante.
L'analisi del reporter CaFE durante la doppia ovulazione indotta dal knockdown dell'RNAi di ipp-5 ha rivelato nuovi aspetti dell'OET. In primo luogo, un segnale di calcio è stato osservato immediatamente dopo l'ingresso nella spermateca nell'ovocita -1 principale ma non nell'ovocita -2 finale (Figura 3). Sebbene 2 ovociti siano ovulati, l'ovocita -1 è ancora l'unico ovocita che mostra segni di corretta maturazione, in particolare la rottura dell'involucro nucleare (NEBD). Questi dati suggeriscono che anche se l'ovocita -2 è in presenza di spermatozoi, non è competente per essere fecondato in quanto non è ancora maturato correttamente. In secondo luogo, l'ovocita -2 mostra un'onda di calcio ritardata, in genere quando l'ovocita esce dalla spermateca per l'utero. Sebbene la maturazione degli ovociti sia normalmente un prerequisito per l'ovulazione, questi dati suggeriscono che la maturazione dell'ovocita e la competenza per la fecondazione possono ancora avvenire dopo l'ovulazione. La visualizzazione dell'onda di calcio ritardata durante il knockdown di ipp-5 evidenzia i vantaggi del reporter CaFE per interrogare la competenza e la tempistica della fertilizzazione.
Inoltre, abbiamo scoperto che il reporter CaFE è rilevabile nelle uova deposte e rivela transitori di calcio a singola cellula durante l'embriogenesi precoce in C. elegans. Gli embrioni provenienti da EAG28 adulto sincronizzato del giorno 1 (CaFE; PH-mCherry) sono stati ripresi utilizzando i protocolli delle sezioni 1-5 con il disco rotante confocale Andor Dragonfly utilizzando la fotocamera Zyla (Figura 4). I transitori di calcio sono confinati a singole cellule e impiegano meno tempo rispetto all'onda di calcio della fecondazione per essere completati (~9 s, n=11). Tuttavia, l'onda di calcio durante l'embriogenesi non sembra essere bifasica. I transitori di calcio non sono stati osservati prima dello stadio a 8 cellule. In particolare, il calcio non si localizza nel solco di scissione in C. elegans, come si vede in molti altri organismi, inclusi gli esseri umani e Xenopus 20,21,22. I transienti di calcio unicellulari sono stati osservati ben dopo la gastrulazione (~200 minuti dopo la fecondazione) e nelle uova deposte. Un singolo embrione mostra più transitori di calcio nel tempo, ma in cellule diverse e in genere una cellula alla volta. Si noti che l'esposizione continua alla stimolazione laser danneggerà gli embrioni. Si consiglia una potenza LED/laser inferiore o un'esposizione discontinua. Tuttavia, poiché le onde di calcio sono relativamente brevi a ~9 s, non consigliamo di rallentare più di 2 s tra gli eventi di stimolazione LED/laser.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig01.jpg"> 
Figura 1: Braccio della gonade di C. elegans . Immagine di un braccio di gonade del ceppo di verme EAG25, che mostra il reporter CaFE GFP (verde) e l'istone 2B-mCherry marker (rosso), che evidenzia i nuclei nella linea germinale. L'ovocita prossimale è indicato con il -1 direttamente prima della spermateca, dove sono conservati gli spermatozoi (freccia). L'embrione situato più vicino alla spermateca ma all'interno dell'utero è l'embrione più recente. L'immagine è stata scattata utilizzando la scansione laser confocale Nikon ECLIPSE Ti2. Barra della scala = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig02.jpg"> 
Figura 2: Visualizzazione dell'onda di calcio durante la fecondazione. Immagini di serie temporali della fluorescenza che riflette il calcio intracellulare durante la fecondazione nel ceppo di vermi EAG28. Il ceppo EAG28 contiene sia il reporter CaFE (verde) che una fusione pleckstrin-homology domain-mCherry (giallo), che evidenzia le membrane plasmatiche. Il tempo 0 indica il primo fotogramma che ritrae un chiaro aumento del segnale fluorescente nell'ovocita. Il tempo di 24,4 s riflette il primo fotogramma che mostra la fluorescenza dell'intero ovocita. Le immagini delle serie temporali sono state scattate utilizzando il confocale a disco rotante Andor Dragonfly con una fotocamera Zyla. Barra della scala = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig03.jpg"> 
Figura 3: Onde di calcio durante un evento di doppia ovulazione indotta da ipp-5 RNAi. Immagini time-lapse di onde sequenziali di calcio dell'ovocita -1 e dell'ovocita -2 in un ceppo EAG16 (CaFE in verde GFP) esposto all'RNAi ipp-5 . Il frame -40.0 s include etichette per l'ovocita -1 (-1), -2 ovocita (-2), spermateca (*) e +1 embrione (+1). Il tempo 0 s mostra l'aumento iniziale della fluorescenza dell'onda di calcio dell'ovocita -1. Il tempo di 4,5 s mostra l'onda di calcio che si diffonde verso il polo opposto nell'ovocita -1. Il tempo 70,5 s mostra la fluorescenza dell'intera cellula nell'ovocita -1 accompagnata dall'ovocita -2 al segnale GFP basale; Entrambi gli ovociti si trovano nella spermateca. L'ovocita -1 fecondato e l'ovocita -2 non fecondato entrano nell'utero al tempo 158,3 s. A 219,3 s, l'ovocita -2 mostra un'onda di calcio fluorescente tardiva. Le immagini sono state scattate utilizzando il confocale a disco rotante Andor Dragonfly con una fotocamera Zyla. Barra di scala = 30 μM <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig04.jpg"> 
Figura 4: Transitori di calcio a cellula singola nell'embriogenesi precoce. (A) Gli embrioni in utero e (B) ex utero (uovo deposto) hanno mostrato un segnale fluorescente in una singola cellula durante l'embriogenesi. Le immagini sono state scattate utilizzando il confocale a disco rotante Andor Dragonfly con una fotocamera Zyla. Barra della scala = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Visualizzazione in vivo dei transitori di calcio durante la fecondazione e lo sviluppo precoce in C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

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Cellule staminali simil-<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionali espianti di studiare Caratteristiche precoce dello sviluppo neurale<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

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