Name: Sviluppo e applicazione di tirosin-fosfatasi regolate dalla rapamicina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Scopri il sistema regolato dalla rapamicina per controllare l'attività delle tirosin-fosfatasi nelle cellule HEK-293T. Questo metodo permette di studiare gli effetti temporali di SHIP-2 sulla migrazione cellulare.

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<meta charset="utf8"></head><body>Regolazione temporale dell'attività della fosfatasi con il sistema regolato dalla rapamicina

<ol><li>Amin, A. R. M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHP-2+tyrosine+phosphatase+inhibits+p73-dependent+apoptosis+and+expression+of+a+subset+of+p53+target+genes+induced+by+EGCG%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SHP-2 tyrosine phosphatase inhibits p73-dependent apoptosis and expression of a subset of p53 target genes induced by EGCG.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (13), 5419-5424 (2007).</li>
<li>Niogret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shp-2+is+critical+for+ERK+and+metabolic+engagement+downstream+of+IL-15+receptor+in+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Shp-2 is critical for ERK and metabolic engagement downstream of IL-15 receptor in NK cells.</a> Nat Commun. 10, 1-14 (2019).</li>
<li>Wang, Y. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+infection+activates+Src+homology-2+domain-containing+phosphatase+2+to+suppress+IFN-%CE%B3+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori infection activates Src homology-2 domain-containing phosphatase 2 to suppress IFN-γ signaling.</a> J Immunol. 193 (8), 4149-4158 (2014).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tyrosine+phosphatase+SHP2+promotes+proliferation+and+oxaliplatin+resistance+of+colon+cancer+cells+through+AKT+and+ERK%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">The tyrosine phosphatase SHP2 promotes proliferation and oxaliplatin resistance of colon cancer cells through AKT and ERK.</a> Biochem Biophys Res Commun. 563, 1-7 (2021).</li>
<li>Lauriol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+SHP2+dysfunction+underlies+cardiac+hypertrophy+in+Noonan+syndrome+with+multiple+lentigines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Developmental SHP2 dysfunction underlies cardiac hypertrophy in Noonan syndrome with multiple lentigines.</a> J Clin Invest. 126 (8), 2989-3005 (2016).</li>
<li>Tartaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+PTPN11%2C+encoding+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2%2C+cause+Noonan+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome.</a> Nat Genet. 29, 465-468 (2001).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Shp2+tyrosine+phosphatase+is+implicated+in+leukemogenesis+in+adult+human+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Shp2 tyrosine phosphatase is implicated in leukemogenesis in adult human leukemia.</a> Blood. 106 (9), 3142-3149 (2005).</li>
<li>Mustelin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+phosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine phosphatases.</a> Front Biosci. 7 (4), d85-d142 (2002).</li>
<li>Stanford, S. M., Bottini, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tyrosine+phosphatases%3A+time+to+end+the+stigma%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Targeting tyrosine phosphatases: time to end the stigma.</a> Trends Pharmacol Sci. 38 (6), 524-540 (2017).</li>
<li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+phosphatases%3A+From+molecule+design+to+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Targeting phosphatases: From molecule design to clinical trials.</a> Eur J Med Chem. 264, 116031(2024).</li>
<li>Weiser, D. C., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+protein+phosphatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of protein phosphatase inhibitors.</a> Curr Protoc Mol Biol. 62, 1-18 (2003).</li>
<li>Fauser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+protein+tyrosine+phosphatase+signaling+by+engineered+chemogenetic+control+of+its+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissecting protein tyrosine phosphatase signaling by engineered chemogenetic control of its activity.</a> J Cell Biol. 221 (8), e202111066(2022).</li>
<li>Karginov, A. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+activation+of+kinases%3A+design+and+application+of+RapR+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Allosteric activation of kinases: design and application of RapR kinases.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 14, Unit 14.13 (2011).</li>
<li>Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+allosteric+activation+of+kinases+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineered allosteric activation of kinases in living cells.</a> Nat Biotechnol. 28, 743-747 (2010).</li>
<li>Dagliyan, O., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+proteins+for+allosteric+control+by+light+or+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Engineering proteins for allosteric control by light or ligands.</a> Nat Protoc. 14, 1863-1883 (2019).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+SHP2+phosphatase+promotes+vascular+damage+and+inhibition+of+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Targeting the SHP2 phosphatase promotes vascular damage and inhibition of tumor growth.</a> EMBO Mol Med. 13, e14089(2021).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHP2+regulates+the+development+of+intestinal+epithelium+by+modifying+OSTERIX%2B+crypt+stem+cell+self-renewal+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">SHP2 regulates the development of intestinal epithelium by modifying OSTERIX+ crypt stem cell self-renewal and proliferation.</a> FASEB J. 35, e21106(2021).</li>
<li>Zhang, E. E., Chapeau, E., Hagihara, K., Feng, G. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Shp2+tyrosine+phosphatase+controls+energy+balance+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal Shp2 tyrosine phosphatase controls energy balance and metabolism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 16064-16069 (2004).</li>
<li>Song, Y., Zhao, M., Zhang, H., Yu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-edged+roles+of+protein+tyrosine+phosphatase+SHP2+in+cancer+and+its+inhibitors+in+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Double-edged roles of protein tyrosine phosphatase SHP2 in cancer and its inhibitors in clinical trials.</a> Pharmacol Ther. 230, 107966(2022).</li>
<li>Hartman, Z. R., Schaller, M. D., Agazie, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tyrosine+phosphatase+SHP2+regulates+focal+adhesion+kinase+to+promote+EGF-induced+lamellipodia+persistence+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The tyrosine phosphatase SHP2 regulates focal adhesion kinase to promote EGF-induced lamellipodia persistence and cell migration.</a> Mol Cancer Res. 11 (6), 651-664 (2013).</li>
<li>Yu, D. H., Qu, C. K., Henegariu, O., Lu, X., Feng, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-tyrosine+phosphatase+Shp-2+regulates+cell+spreading%2C+migration%2C+and+focal+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein-tyrosine phosphatase Shp-2 regulates cell spreading, migration, and focal adhesion.</a> J Biol Chem. 273 (33), 21125-21131 (1998).</li>
<li>Kramer, M. F., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+DNA+by+PCR%3A+standard+procedures+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization.</a> Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-14 (2001).</li>
<li>Sandhu, G. S., Precup, J. W., Kline, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+one-step+characterization+of+recombinant+vectors+by+direct+analysis+of+transformed+Escherichia+coli+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid one-step characterization of recombinant vectors by direct analysis of transformed Escherichia coli colonies.</a> Biotechniques. 7, 689-690 (1989).</li>
<li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellGeo%3A+A+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Ray, A. -M., Klomp, J. E., Collins, K. B., Karginov, A. V. Dissecting kinase effector signaling using the RapRTAP methodology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRay%2C+A-M+%22Kinase+Signaling+Networks%22">Kinase Signaling Networks</a>. Tan, A. -C., Huang, P. H. , Springer. New York, NY. 21-33 (2017).</li>
<li>Mercan, F., Bennett, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+tyrosine+phosphatases+and+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein tyrosine phosphatases and substrates.</a> Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18.16 (2010).</li>
<li>Karginov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+regulation+of+protein+dimerization+and+kinase+activity+in+living+cells+using+photocaged+rapamycin+and+engineered+FKBP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Light regulation of protein dimerization and kinase activity in living cells using photocaged rapamycin and engineered FKBP.</a> J Am Chem Soc. 133 (3), 420-423 (2011).</li>
<li>Karginov, A. V., Hahn, K. M., Deiters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optochemical+activation+of+kinase+function+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optochemical activation of kinase function in live cells.</a> Methods Mol Biol. 1148, 31-43 (2014).</li>
</ol>

Le proteine tirosina fosfatasi sono una famiglia critica di proteine coinvolte in una pletora di eventi di segnalazione cellulare. È stato dimostrato che svolgono un ruolo chiave nella regolazione della proliferazione cellulare, della migrazione e dell'apoptosi 1,2,3. Di conseguenza, la disregolazione delle proteine tirosin-fosfatasi porta a una varietà di malattie e disturbi debilitanti 4,5,6,7. Lo studio della funzione fisiologica delle tirosin-fosfatasi e del loro ruolo nello sviluppo di queste patologie è stato storicamente ostacolato dalla mancanza di strumenti necessari per sondare le complessità del segnale della fosfatasi8.
Tradizionalmente, le fosfatasi vengono studiate utilizzando metodi che non hanno la specificità desiderata e/o non forniscono un controllo temporale della loro attività. Queste limitazioni critiche degli strumenti disponibili rendono difficile sezionare ruoli specifici delle fosfatasi nelle vie di segnalazione. La sovraespressione di mutanti negativi costitutivamente attivi e dominanti o la sottoregolazione dell'espressione della fosfatasi forniscono specificità ma mancano di controllo temporale e spesso possono innescare meccanismi compensatori che mascherano la vera funzione dell'enzima.
Gli inibitori farmacologici consentono la regolazione temporale delle fosfatasi. Tuttavia, molti inibitori della fosfatasi sono notoriamente aspecifici a causa della composizione ben conservata del sito attivo nelle tirosin-fosfatasi9. Inoltre, a causa di vincoli di progettazione, gli inibitori che prendono di mira il sito catalitico mostrano una scarsa permeabilità della membrana cellulare10. Un'altra limitazione degli inibitori è che consentono solo l'esame degli effetti dell'inattivazione della fosfatasi11. Pertanto, c'è bisogno di strumenti che consentano l'attivazione specifica e temporalmente regolabile delle fosfatasi. Questi strumenti consentiranno ai ricercatori di identificare gli effetti diretti dell'attivazione della fosfatasi, separandoli da molteplici cascate di segnalazione parallele spesso attivate da stimoli biologici. È importante sottolineare che uno stretto controllo temporale dell'attività consente l'identificazione di eventi transitori indotti da una fosfatasi e separa gli effetti dell'attività fosfatasi acuta e prolungata. La combinazione della regolazione temporale con l'analisi mutazionale consentirà una dissezione dettagliata dei ruoli specifici dei singoli domini della fosfatasi e l'interrogazione del suo segnale a valle12.
Per affrontare la mancanza di capacità desiderate negli strumenti esistenti, il gruppo Karginov ha sviluppato il sistema regolato dalla rapamicina (RapR) 13,14,15. Il sistema RapR utilizza un dominio switch ingegnerizzato, iFKBP, che consente la regolazione allosterica della proteina di interesse (POI). L'inserimento del dominio iFKBP in una posizione allostericamente accoppiata al sito catalitico del POI lo rende suscettibile alla regolazione da parte della rapamicina. In assenza di rapamicina, iFKBP interrompe il sito catalitico a causa della dinamica strutturale intrinsecamente elevata di iFKBP e quindi inattiva il POI. L'aggiunta di rapamicina induce l'interazione di iFKBP con la proteina FRB co-espressa (Figura 1). Ciò provoca la stabilizzazione del dominio di commutazione, che di conseguenza ripristina la struttura e la funzione del dominio catalitico del POI. In quanto tale, lo strumento consente un'attivazione specifica e temporalmente regolabile del POI.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig01.jpg"> Figura 1: Schema del sistema regolato dalla rapamicina RapR-Shp2. RapR consente l'attivazione allosterica della proteina di interesse con l'aggiunta di rapamicina. Questa cifra è stata modificata da Fauser et al.12. Abbreviazioni: iFKBP = inseribile FKBP12; FRB = dominio di legame FKBP-rapamicina; R = rapamicina; Shp2 = Proteina tirosina fosfatasi contenente il dominio Src omologia-2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Lo strumento RapR può essere applicato a diverse famiglie di proteine. Può essere utilizzato per regolare le protein chinasi e le fosfatasi12,14. Questo protocollo si concentrerà sull'applicazione dello strumento RapR per il controllo della fosfatasi Shp2. Shp2 è una proteina tirosina fosfatasi espressa in modo ubiquitario che è coinvolta in processi di segnalazione come la proliferazione, la migrazione, l'immunomodulazione e la differenziazione 1,16,17,18. La disregolazione di Shp2 è stata associata a una serie di tumori solidi, leucemia mieloide e disturbi dello sviluppo 5,7. Tuttavia, Shp2 è caduto vittima delle stesse carenze degli strumenti descritte sopra. Per combattere queste limitazioni, è stato sviluppatoe caratterizzato RapR-Shp2, un costrutto Shp2 specificamente e temporalmente regolabile.
Prima dello sviluppo di RapR-Shp2, era noto che Shp2 era coinvolto nella migrazione cellulare 19,20,21. Tuttavia, il suo ruolo specifico nella segnalazione coinvolta in questo processo era sconosciuto. Non si sapeva nemmeno su quale scala temporale Shp2 regoli la migrazione delle cellule e quali specifici cambiamenti morfodinamici induca nei diversi momenti della sua attivazione. Inoltre, non era chiaro se l'attivazione acuta e prolungata di Shp2 causerà effetti diversi. Utilizzando RapR-Shp2, è stato riscontrato che l'attivazione acuta di Shp2 induce una diffusione cellulare transitoria, un aumento delle sporgenze, la polarizzazione cellulare e la migrazione. Sono stati identificati anche percorsi specifici a valle di Shp2 che regolano distinti cambiamenti morfodinamici12. Questo protocollo fornisce dettagli per la progettazione e la caratterizzazione di RapR-Shp2, che possono essere utilizzati per guidare lo sviluppo e l'applicazione di altre fosfatasi RapR.

<table><tbody><tr><td>#1.5 Vetrini coprioggetti 25 mm Round</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0715</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 1,5 mL</td><td>USA</td><td>Scientific cc7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Buffer</td><td></td><td></td><td>per 500 mL: 5,18 g Tris-HCL, 131,5 mL glicerolo, 52,5 mL 20% SDS, 0,5 g blu bromofenolo, pH finale 6,8</td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEAN TGX Gel prefabbricato</td><td>Biorad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion Plus Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>F538L</td><td></td></tr><tr><td>A431 Celle</td><td>ATCC</td><td>CRL-1555</td><td></td></tr><tr><td>Oro agarsosoBiotech</td><td></td><td>A-201</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor Camera cellulare</td><td>invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gemini Bio-products</td><td>100-106</td><td>Triplo inattivato a caldo 0,1 &; m filtrato sterile</td></tr><tr><td>Brig 35,30 p/v %</td><td>Acros</td><td>329581000</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>GoldBiotech</td><td>A-420</td><td></td></tr><tr><td>CellGeo</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Pubblicato il 10.1083/jcb.201306067</td></tr><tr><td>CellMask Deep Red plasma membrana colorante</td><td>invitrogen</td><td>c10046</td><td></td></tr><tr><td>Colony Screen MasterMix</td><td>Genesee</td><td>42-138</td><td></td></tr><tr><td>DH5a competente cellule</td><td>: NEB</td><td>C2987H,</td><td></td></tr><tr><td>DMEM,</td><td>Corning</td><td>15-013-CV</td><td></td>,</tr><tr><td>DMSO</td>, <td>Thermo Scientific,</td><td>F-515</td><td></td></tr>, <tr><td>DNA Ladder</td>, <td>GoldBio</td><td>D010-500</td><td></td></tr>, <tr><td>dNTP,</td><td>NEB</td><td>N04475</td><td></td></tr>, <tr><td>DpnI, enzima</td><td>NEB</td><td>R01765</td><td></td></tr>, <tr><td>DTT</td>, <td>GoldBio</td>, <td>DTT10</td>, <td>DL-Ditiotreitolo, Reagenti di Cleland</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros</td><td>409910250</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina da plasma bovino</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE(R) 6 Reagente di trasfezione</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Reagente di trasfezione</td></tr><tr><td>Kit di estrazione su gel</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0692</td><td>Kit di estrazione su gel GeneJET</td></tr><tr><td>Gel Verde Colorazione di acido nucleico GoldBio</td><td></td><td>G-740-500</td><td></td></tr><tr><td>Gel Caricamento Colorante Viola 6x</td><td>NEB</td><td>B7024A</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>GlutaMAX-l (100x) 100 mL</td></tr><tr><td>HEK 293T Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>HeLa Cells</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fischer</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Processing Software</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630 (NP40)</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td></td></tr><tr>tampone <td></td><td></td><td>imidazolo</td><td>25 mM imidazolo pH 7,2, 2,5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>L-15 1x</td><td>Corning</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>tampone</td><td></td><td></td> <td>di lisi20 mM Hepes-KOH, pH 7,8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40</td></tr><tr><td>L'aggiornamento MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>R 2022b è stato utilizzato per eseguire le funzioni CellGeo Software di</td></tr><tr><td>automazione e analisi delle immagini per microscopia Metamorph</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Chemical</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Sigma</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>MiniPrep Kit</td><td>Gene Scelta</td><td>96-308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Gel prefabbricati a 12 pozzetti</td><td>Bio-Rad</td><td>4561085</td><td></td></tr><tr><td>Grado di biologia molecolare</td><td>Corning</td><td>d'acqua 46-000-CV</td><td></td></tr><tr><td>Multibanda Specchio policroico</td><td>Tecnologia cromatica</td><td>89903BS</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo Olympus UPlanSAPO 40x</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PBS senza Ca e Mg</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Provette PCR</td><td>labForce</td><td>1149Z65</td><td>Provette e tappi da 0,2 mL a 8 strisce, striscia rigida Tappi a cupola fissati singolarmente</td></tr><tr><td>Phusion Plus DNA polimerasi</td><td>Thermo Scientific</td><td>F630S</td><td></td></tr><tr><td>Primer</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein-G Sepharose</td><td>Millipore</td><td>16-266</td><td></td></tr><tr><td>Membrane PVDF</td><td>BioRad</td><td>1620219</td><td>Immun-Blot PVDF/Carta da filtro Panini</td></tr><tr><td>Rapamicina</td><td>Fisher</td><td>AAJ62473MF</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina, 2,21 mM EDTA, 1x [-] sodio</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Acetato-EDTA (TAE) 50x</td><td>Fischer</td><td>BP1332-1</td><td>per elettroforesi</td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td> di lavaggio <td>20 mM Hepes-KOH, pH 7,8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Fisher Chemical</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-EGFR</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>2232</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ERK 1/2 Antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9102</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-flag</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GAPDH</td><td>invitrogen</td><td>AM4300</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFP Clontech</td><td></td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-mCherry</td><td>invitrogen</td><td>M11217</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-paxillina</td><td>Thermo Fischer</td><td>BDB612405</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-EGFR Y992 Anticorpo</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>2235</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Segnalazione cellulare anticorpale</td><td></td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-paxillina Y31 Anticorpo</td><td>Millipore-Sigma</td><td>05-1143</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-PLC&gamma; Y783 Segnalazione cellulare anticorpale</td><td></td><td>14008</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PLC&gamma; </td><td>Segnalazione cellulare anticorpale</td><td>5690</td><td></td></tr></tbody></table>

sviluppo e applicazione di tirosin-fosfatasi regolate dalla rapamicina

Development and Application of Rapamycin-regulated Tyrosine Phosphatases

La Figura 4 mostra i risultati che ci si può aspettare dal saggio di attività della fosfatasi a base di paxillina. In questo esperimento, l'attività costitutivamente attiva e dominante della fosfatasi negativa di Shp2 è stata confrontata con quella di RapR-Shp2 attiva e inattiva utilizzando la fosfo-paxillina come lettura. I costrutti Shp2 sono stati immunoprecipitati e sottoposti al test di attività come descritto nel protocollo. Le letture della fosfo-paxillina per Shp2 costitutivamente attivo e RapR-Shp2 attivo erano simili, indicando che il RapR-Shp2 attivo non era stato influenzato negativamente dall'introduzione del dominio RapR e manteneva la piena attività una volta attivato. Anche l'Shp2 negativo dominante e l'inattivo RapR-Shp2 erano simili, indicando che il costrutto RapR-Shp2 non ha attività quando è inattivo. Ciò indica il successo della progettazione di una RapR-fosfatasi. Il fosfo-substrato utilizzato per questo test può differire in base alla fosfatasi di interesse.
La Figura 5, simile alla Figura 4, confronta RapR-Shp2 costitutivamente attivo, dominante negativo e attivo e inattivo. Questo esperimento è stato condotto senza immunoprecipitazione dei costrutti. Invece, è stato progettato per caratterizzare gli effetti di segnalazione a valle del costrutto RapR-Shp2 all'interno delle cellule. Qui, i costrutti Shp2 sono stati espressi in cellule HEK293T. È stato dimostrato che l'effettore a valle ERK1/2 aumenta la fosforilazione in risposta all'attivazione di RapR-Shp2, proprio come nel campione costitutivamente attivo. Il RapR-Shp2 inattivo non ha indotto questo cambiamento. Ciò indica che la segnalazione a valle di Shp2 viene preservata con l'incorporazione del dominio RapR. Allo stesso modo, i fosfo-substrati noti EGFR e PLCγ sono stati defosforilati in risposta all'attivazione di RapR-Shp2 nelle cellule A431.
Infine, la Figura 6 presenta i risultati dell'attivazione di RapR-Shp2 sulla morfodinamica delle cellule HeLa. Una volta attivato RapR-Shp2, le cellule hanno mostrato un aumento dell'attività protrusiva e dell'area cellulare. Ciò indica che l'attivazione di RapR-Shp2 è sufficiente per indurre cambiamenti morfodinamici nelle cellule HeLa e può consentire ai ricercatori di sondare specifiche vie di segnalazione a valle responsabili di questo effetto.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig04.jpg"> Figura 4: Risultati del test di attività basato sulla paxillina: costitutivamente attivi, dominanti negativi e RapR-Shp2 sono stati immunoprecipitati e soggetti al test di attività utilizzando il protocollo descritto. I livelli di paxillina pY31 sia in CA che in RapR-Shp2 erano simili, indicando che il costrutto RapR-Shp2 aveva un'attività simile rispetto a CA Shp2 una volta attivato. Il campione di RapR-Shp2 non attivato non aveva alcuna attività, in modo simile al campione DN, indicando che non era "permeabile". Questa cifra è stata modificata da Fauser et al.12. Abbreviazioni: RapR = Regolato dalla rapamicina; Shp2 = proteina tirosina fosfatasi contenente il dominio di omologia Src-2; DN = dominante negativo; CA = costitutivamente attivo; FRB = Dominio di legame FKBP-rapamicina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig05.jpg"> Figura 5: Risultati del test del lisato a cellula intera: RapR-Shp2 e RapR-Shp2 costitutivamente attivi sono stati espressi in HEK293T cellule e il protocollo del lisato a cellula intera è stato completato. Quando inattivo, RapR-Shp2 non ha attivato ERK1/2 mediante fosforilazione, in modo simile al campione DN Shp2. Ciò indica che RapR-Shp2 non ha attività quando è inattivo. Una volta attivato, il livello di fosforilazione di ERK1/2 era simile a quello del campione di CA Shp2, indicando il successo dell'attivazione e della segnalazione a valle di Shp2. Allo stesso modo, le cellule A431 che esprimono RapR-Shp2 hanno mostrato diminuzioni della fosforilazione sia di EGFR che di PLCγ, entrambi substrati noti di Shp2. Questa cifra è stata modificata da Fauser et al.12. Abbreviazioni: RapR = Regolato dalla rapamicina; Shp2 = proteina tirosina fosfatasi contenente il dominio di omologia Src-2; DN = dominante negativo; CA = costitutivamente attivo; ERK = chinasi regolata dal segnale extracellulare; GAPDH = gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi; EGFR = recettore del fattore di crescita epidermico; PLCγ = fosfolipasi C gamma; FRB = Dominio di legame FKBP-rapamicina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig06.jpg"> Figura 6: Analisi dei dati sull'area cellulare e sull'attività protrusiva basata sull'imaging dal vivo: le cellule HeLa sono state trasfettate con RapR-Shp2 e sottoposte al protocollo di imaging dal vivo delineato. I dati sono stati analizzati come indicato nel protocollo di analisi dei dati. Una volta attivate (indicate dalla linea grigia verticale), le cellule HeLa hanno mostrato aumenti sia dell'attività protrusiva cellulare che dell'area cellulare. Nei campioni negativi che esprimevano solo FRB, questa attività non era presente. Ciò indica che l'attivazione di RapR-Shp2 induce rapidi cambiamenti morfodinamici all'interno delle cellule HeLa e incoraggia la diffusione e la protrusione cellulare. Questa cifra è stata modificata da Fauser et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Sviluppo e applicazione di tirosin-fosfatasi regolate dalla rapamicina

Tyrosine phosphatases are an important family of enzymes that regulate critical physiological functions. They are often dysregulated in human diseases, ...

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