Progettazione e sviluppo guidati dalla struttura di nuovi inibitori della ciclofilina A e derivati del ganoderiolo-F: un approccio in-silico
23 giugno 2026
Qui presentiamo un protocollo per la progettazione guidata dalla struttura dell'interazione di legame proteina-ligando tra Sanglifehrin A e Ciclofilina A/Ganoderiolo-F, essenziale per scoprire nuovi farmaci. La stabilità del complesso ligando-recettore è stata valutata tramite simulazione della dinamica molecolare.
Questa ricerca si concentra sulla progettazione di nuovi inibitori della ciclofilina A e di antiproliferanti gan-it-role per colpire l'asse DCDK della ciclofilina e inibire la proliferazione del cancro cellulare. Le principali sfide includono il raggiungimento ottimale di un'interazione geometrica ligando-recettore e il mantenimento di complessi stabili ligando-proteina in condizioni sperimentali e fisiologiche dinamiche. Per iniziare, apri il file 1NMK".
Localizza l'amminoacido arginina nella posizione numero 55 e registra le coordinate X, Y e Z nell'interfaccia AutoDock. Apri il menu "File", seleziona Leggi molecole. Scegli il file 1NMK e clicca su Open.
Aggiungi atomi di idrogeno selezionando Modifica, scegliendo Idrogeno e cliccando su Aggiungi. Poi scegli Solo Polo" e conferma con OK. Poi vai di nuovo al menu "Modifica", scegli Atomi e seleziona Assegna un tipo di atomo AD4. Successivamente, scegli "Charges" e seleziona Kollman Charges.
Salva il recettore preparato come 1NMK. pdbqt"selezionando File, scegliendo Salva, impostando il tipo di file e confermando la posizione di salvataggio. Poi, apri il menu Ligando, seleziona Input.
Clicca su Open, scegli il file PDB e poi clicca di nuovo su "Open". Quando appare la finestra informativa, rivedi i dettagli dei liganti. Per rilevare la radice del ligando, seleziona Ligando, poi scegli "Albero di torsione" e clicca su "Rileva radice".
Salva il ligando selezionando Ligando, scegliendo Output e cliccando su Salva come PDBQT. Prepara la griglia dei recettori selezionando Griglia, scegliendo Macromolecola, selezionando 1NMK e cliccando su Molecola. Conferma l'avviso e salva come 1NMK.pdbqt.
Per impostare i tipi di mappa, seleziona Griglia, seguita da Set Tipi di Mapa, Ligando. Scegli Ligando" e infine seleziona di nuovo Ligando. Poi definisci il centro della casella della griglia selezionando Griglia, scegliendo Casella della Griglia e cliccando su Centro.
Poi seleziona un atomo e inserisci le coordinate della riquadra della griglia. Salva il parametro della griglia come file GPF. Configura l'attracco selezionando Docking, seguito da "Macromolecola" e imposta Nome file rigido.
Naviga nella cartella richiesta e clicca su 1NMK.pdbqt. per aprirla, seleziona Docking, scegli Output, clicca Lamarckian GA e salva il file dei parametri di docking come 1NMK.dpf. Nel terminale Cygwin", digita cd C:e premi enter; Poi digita CD project" e premi di nuovo invio.
Poi, tipfigura "molecole di cd" e premi invio. Poi digita cd 3" e premi invio. Digita il comando AutoGrid" per generare mappe a griglia e premi invio per eseguire AutoGrid.
Dopo l'esecuzione, tipare coda f 1NMK. glg"e premi invio per visualizzare i progressi del log, digita il comando per la simulazione di attracco molecolare. Per generare il file di log di docking, premi invio per avviare l'AutoDock.
Poi, tipa coda f 1NMK. dlg"e premi invio per monitorare il processo di attracco. Dopo aver creato tutti i file DLG, vai nella cartella 1 e apri il file DLG su WordPad, premi Ctrl+F.
Digita la parola chiave di ricerca e premi invio tre volte per arrivare alla tabella RMSD. Copia l'energia di legame e le relative informazioni di corrispondenza per ogni molecola dalla tabella RMSD, compila le prime 20 molecole in un foglio di calcolo con colonne create per numero di serie, energia minima di legame e corri. Nel Cygwin"terminal, naviga alla cartella delle molecole specifiche all'interno della directory del progetto.
Digita il comando per estrarre le coordinate di ligando dockate dal DLG e ritrima i dati. Premi ancora invio per finalizzare, confermando la creazione del file PDBQT"run 1NMK. Verifica che il file PDB eseguito da 1NMK sia stato creato nella stessa cartella.
Successivamente, apri il software PyMOL 2.5" e l'AutoDock dal desktop, e apri il file del recettore per selezionare la struttura del recettore da visualizzare. Apri il corrispondente file di configurazione dei liganti per la molecola scelta e visualizza il ligando caricato nello spazio di lavoro 3D. Seleziona "Nascondi tutto" dal menu, importa il file su Maestro per visualizzare la struttura, e poi clicca su Interazione con i ligandi per ottenere il diagramma di interazione dei liganti.
Apri il software UCSF Chimera dal desktop. Seleziona File, seguito da Apri. Naviga per guidare C, progetto e molecole.
Seleziona il file 1NMK. pdb" e clicca su Open. Dal menu, seleziona "Residuo" e scegli "UNL Zoom" per concentrarti sulla regione dei residui UNL.
Seleziona zona. Poi premi OK" per confermare. Poi, seleziona Azione.
Scegli Etichetta, poi seleziona "Residuo" e scegli Nome più Specificatore per etichettare i residui. Apri Strumenti, seleziona Analisi Struttura, e poi clicca su Trova. Nella finestra predefinita di "Impostazioni di FindHBond", seleziona le caselle per i legami H di colore che non soddisfano criteri precisi e trova solo i legami H selezionati.
Libera la selezione delle zone per iniziare un nuovo rilevamento. Poi seleziona i parametri della zona, ingrandisci il display molecolare e osserva le linee blu e arancioni che rappresentano i legami a idrogeno. Infine, esaminare la struttura visualizzata e contare il numero totale di legami a idrogeno visibili.
La conferma di attracco del complesso ligando-recettore è stata visualizzata utilizzando PyMOL 2.5, mostrando 109 idrossietil idrossietil legato all'interno della tasca attiva del recettore 1NMK. Il ligando acido 4-idrossimandelico ha formato legami a idrogeno con il recettore 1NMK, in particolare con l'arginina 55 a una distanza di 1,53 angstrom. L'analisi strutturale bidimensionale ha illustrato gli amminoacidi con cui i liganti interagivano tramite legami a idrogeno.
Le simulazioni di dinamica molecolare confermano la stabilità del complesso ligando-recettore attraverso l'analisi del raggio di giro su 1000 picosecondi. Il grafico RMSD ha mostrato una stabilizzazione costante del complesso dopo un nanosecondo di simulazione, indicando un legame costante proteina-ligando. La densità media del sistema era di circa 1019 chilogrammi per metro cubo, confermando l'equilibrio in condizioni NVT, e la pressione del sistema rimane stabile durante l'equilibrio NPT per 100 picosecondi.
La temperatura si stabilizzò intorno a 300 kelvin durante la fase NVT, confermando un bilanciamento termico riuscito. La scatola della traiettoria del complesso ligando-proteina è stata visualizzata dopo la simulazione, mostrando la distribuzione delle molecole d'acqua attorno al complesso agganciato. Pochi studi indagano l'antiproliferativo a ruolo gan-it-role come bersaglio terapeutico oncogenico.
Questo protocollo colma questa lacuna progettando e validando l'inibitore utilizzando l'analisi del docking molecolare e della dinamica. Il nostro protocollo interroga molteplici strumenti computazionali in un flusso di lavoro unificato, garantendo un'analisi completa di ligando-proteina o recettore. Le nostre future ricerche si concentreranno sulla validazione di questi inibitori in vitro e in vivo, esplorando l'applicazione al confine degli inibitori della ciclofilina A in più tipi di cellule tumorali.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo studio si concentra sulla progettazione e validazione di nuovi inibitori della Ciclofilina A, mirati all'asse Ciclofilina D-CDK per sopprimere la proliferazione delle cellule tumorali. Attraverso un approccio guidato dalla struttura, i ricercatori hanno sviluppato 117 molecole ligandiche e ne hanno valutato le interazioni con il recettore enzimatico Sanglifehrin A (1NMK) mediante docking molecolare e simulazioni di dinamica molecolare. Il flusso di lavoro ha integrato diversi strumenti computazionali per ottimizzare il legame ligando-recettore, valutare la stabilità e identificare i residui chiave coinvolti nell'interazione, al fine di sviluppare potenziali farmaci antitumorali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Farmacologia del cancro
- Progettazione computazionale di farmaci
- Simulazione e docking molecolare
Sfondo
- La ciclofilina A (Cyp A) è implicata nella progressione del cancro attraverso la regolazione della proliferazione e della sopravvivenza cellulare.
- L'asse ciclofilina D-CDK rappresenta un promettente bersaglio terapeutico in oncologia.
- I derivati del ganoderiolo F hanno mostrato un potenziale come bersagli oncogenici in diversi tipi di cancro.
- La previsione accurata delle interazioni ligando-recettore richiede una modellizzazione computazionale robusta.
Scopo dello studio
- Progettare nuovi inibitori della Ciclofilina A utilizzando metodi guidati dalla struttura.
- Valutare l'affinità di legame ligando-recettore e la compatibilità geometrica mediante docking.
- Confermare la stabilità del complesso attraverso simulazioni di dinamica molecolare.
- Identificare i residui amminoacidici chiave coinvolti nei legami a idrogeno con i ligandi promettenti.
Metodi Utilizzati
- Chemsketch per costruire 117 nuove molecole di ligandi inibitori della ciclofilina.
- AutoDock 4.2.6 per il docking ligando-proteina al fine di determinare le geometrie di legame ottimali.
- PyMOL 2.5 per visualizzare le conformazioni di docking e le interazioni tra ligando e recettore.
- Chimera e Maestro per rilevare e analizzare i legami a idrogeno.
- Gromacs con campo di forza CHARMM 36 per la simulazione di dinamica molecolare del complesso ligando-recettore.
Risultati principali
- L'arginina 55 nel recettore 1NMK ha formato un legame a idrogeno con il ligando a una distanza di 1,53 Å.
- I residui chiave coinvolti nell'interazione includevano Asn, Gly, Thr, Lys, Ile, His, Phe e Cys.
- Il ligando ha formato 45 legami a idrogeno con il recettore, indicando un'elevata capacità di legame.
- La scatola di docking era centrata in X=38,86, Y=10,987, Z=40,734 nel recettore 1NMK.
- La simulazione di dinamica molecolare in Gromacs ha mostrato una stabilizzazione del complesso dopo 1 ns, con valori costanti di RMSD e raggio di girazione.
- Il sistema ha mantenuto l'equilibrio sotto condizioni NVT/NPT, con una densità media di circa 1019 kg/m³ e pressione e temperatura stabili (circa 300 K).
Conclusioni
- Il complesso ligando-recettore progettato dimostra una stabilità sufficiente per ulteriori sviluppi come terapia antitumorale.
- L'arginina 55 svolge un ruolo fondamentale nel legame del ligando all'interno del sito attivo della ciclofilina A.
- Il flusso di lavoro computazionale integrato identifica con successo inibitori promettenti della Cyp A.
- I futuri studi si concentreranno sulla validazione in vitro e in vivo su diversi tipi di cellule tumorali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La progettazione computazionale guidata dalla struttura consente l'identificazione rapida di inibitori della Ciclofilina A con un legame ottimizzato all'asse Ciclofilina D-CDK, un bersaglio oncologico validato. Questo approccio riduce l'abbandono nelle fasi iniziali prioritizzando ligandi con un forte legame al bersaglio previsto e una stabilità del complesso. Il flusso di lavoro supporta l'identificazione di composti guida integrando docking, analisi delle interazioni e dinamica molecolare per ridurre i rischi associati alle ipotesi meccanicistiche prima della sintesi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche modellando le interazioni del ligando con la ciclofilina A a risoluzione atomica.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale del bersaglio mediante la previsione dell'affinità di legame e del coinvolgimento di residui chiave, come l'arginina 55.
- Valore predittivo: Aumenta la fiducia nella modulazione del bersaglio identificando ligandi che formano multipli legami idrogeno, inclusi i 45 osservati nel complesso principale.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera complessi ligando-recettore validati adatti allo sviluppo di saggi biochimici o biofisici.
- Riproducibilità: Standardizza i parametri di docking (centro della griglia a X=38.86, Y=10.987, Z=40.734) e il punteggio per uno screening virtuale consistente.
- Scalabilità: Consente la valutazione di ampie librerie di ligandi (117 molecole costruite) mediante flussi di lavoro automatizzati di docking.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Si concentra sulla ciclofilina A, implicata nella proliferazione e sopravvivenza tumorale in diversi tipi di cancro.
- Continuità traslazionale: Fornisce un collegamento meccanicistico dalla progettazione in silico alla successiva validazione in vitro e in vivo.
- Valutazione dei rischi: Valuta la stabilità del complesso mediante RMSD e raggio di girazione, supportando decisioni di avanzamento o interruzione prima della sintesi del composto.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto guida, consentendo un triage computazionale prima dei test in laboratorio.
- Biologia della scoperta: Verifica ipotesi terapeutiche modellando il modo in cui i ligandi inibiscono la funzione della Ciclofilina A nell'asse D-CDK.
- Screening: Fornisce risultati pronti per i saggi attraverso pose di docking standardizzate e classifiche di energia di legame per la priorizzazione dei composti.
- Analisi: Offre metriche quantitative (energia di legame, numero di legami idrogeno, RMSD) per confrontare le prestazioni dei ligandi e guidare l'ottimizzazione.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati computazionali al progresso preclinico validando la stabilità del complesso in una simulazione di 1000 ps.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una pipeline riutilizzabile per mirare ad altre interazioni proteina-proteina utilizzando la stessa integrazione di strumenti (Chemsketch, AutoDock, PyMOL, Gromacs).
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduzione del rischio meccanicistica attraverso la previsione di interazioni ligando-recettore e l'identificazione di residui critici di legame.
- Valore operativo: La standardizzazione dei flussi di lavoro tra strumenti riduce la variabilità e favorisce la collaborazione tra gruppi diversi.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione progettuale filtrando i composti in base alla stabilità prevista e al legame con la proteina bersaglio.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta per rischio di chemiotipi con elevati punteggi di docking e stabilità confermata mediante dinamica molecolare.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze nella modellizzazione molecolare, nel software di docking (AutoDock) e nelle piattaforme di simulazione (Gromacs).
- Accesso a infrastrutture computazionali per la generazione di griglie, il docking e la simulazione di dinamica molecolare di sistemi proteina-ligando.
- Standardizzazione dei protocolli per la preparazione del ligando, l'assegnazione delle cariche (Kollman) e il salvataggio dei parametri della griglia.
- Considerazioni adattative per diversi sistemi recettoriali oltre al 1NMK, inclusi il riposizionamento al centro della scatola di griglia e l'analisi specifica per residui.
- I limiti includono la dipendenza dall'accuratezza del campo di forze (CHARMM 36) e dalle scale temporali della simulazione per catturare eventi di legame rari.
