Identificazione di cellule infette da EcoHIV in topi transgenici manipolati con microglia

Questo protocollo descrive come la combinazione dell'infezione da EcoHIV con topi Tmem119-EGFP offra un prezioso sistema biologico per studiare le alterazioni microgliali e i serbatoi virali in modelli di roditori di disturbi neurocognitivi associati all'HIV. La terapia antiretrovirale combinata ha migliorato notevolmente la qualità della vita delle persone che vivono con l'HIV. Per capire come l'HIV influisce sul sistema nervoso centrale, è necessario un modello affidabile e fattibile di HIV.

In precedenza, un nuovo sistema biologico che utilizza l'HIV chimerico, EcoHIV nella colazione, è stato sviluppato in un modello di ratto per studiare il deterioramento neurocognitivo e la disfunzione sinaptica. Rimane una sfida significativa nel chiarire la distribuzione neuroanatomica di EcoHIV, in particolare la sua espressione differenziale in vari tipi di cellule nel cervello. Nel presente studio, EcoHIV con marcatura a fluorescenza mScarlet è stato modificato e iniettato retro-orbitalmente in topi knock-in Tmem119-EGFP per determinare se le microglia sono il principale tipo di cellula responsabile dell'espressione virale e il serbatoio dell'HIV nel cervello.

Per iniziare, trasferire le cellule cerebrali fetali di ratto dissociate in una piastra a 12 pozzetti pre-rivestita di poli-L-lisina con inserti in vetro contenente un millilitro di DMEM-F12 più il 10% di FBS. Incubare le cellule per una notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, sostituire il terreno con un terreno neurobasale integrato con B27 e continuare a coltivare cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per tre settimane.

Quindi aggiungere 60 microlitri di EcoHIV-mScarlet nella coltura di cellule cerebrali e incubare per sei giorni. Dopo l'incubazione, fissare le cellule con il 4% di paraformaldeide. Eseguire l'immunocolorazione su cellule cerebrali infette utilizzando anticorpi primari specifici e visualizzarle su un microscopio confocale con un obiettivo 40x.

Le microglia sono state identificate come il principale tipo di cellula infetta nelle colture di cellule cerebrali di ratto, come evidenziato dalla colocalizzazione di mScarlet con i marcatori CD11b/c e Iba1. Per iniziare, apri il cuoio capelluto di un topo adulto decapitato e trasferisci il tessuto cerebrale in un'altra capsula di Petri contenente cinque millilitri di HBSS sterilizzato. Staccare le meningi e trasferire la corteccia frontale in due millilitri di HBSS.

Successivamente, aggiungi 20 microlitri di tripsina-EDTA allo 0,25% nella miscela. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente, facendo roteare la provetta ogni pochi minuti. Trasferire le cellule dissociate in un pallone da 75 centimetri quadrati prerivestito di poli-L-lisina contenente 10 millilitri di terreno DMEM-F12 e il 10% di FBS.

Colture di cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica fino a raggiungere il 90% di confluenza. Successivamente, digerire le cellule cerebrali con due millilitri di tripsina-EDTA allo 0,25%. Subcoltura delle cellule cerebrali digerite in un piatto di vetro da 35 millimetri contenente cinque millilitri di terreno di crescita DMEM-F12 fino a raggiungere l'80% di confluenza.

Quindi aggiungere otto microlitri di EcoHIV-mScarlet nelle cellule gliali del topo e incubare per due giorni. Le cellule gliali primarie di topo adulto sono state infettate con successo da EcoHIV-mScarlet dopo due giorni di trattamento. Per iniziare, fissare il topo anestetizzato Tmem119-EGFP in posizione laterale.

Scongelare l'EcoHIV-mScarlet con ghiaccio. Riempire la soluzione virale in una siringa per iniettori intraoculari con un ago smussato calibro 33. Posizionare il mouse nella posizione sdraiata laterale destra con la testa rivolta a sinistra.

Identificare l'area di iniezione intorno alla regione dell'occhio. Inserire lentamente e delicatamente l'ago nel canto mediale dell'occhio. Quindi far avanzare l'ago nei vasi dietro il bulbo oculare.

Iniettare 6,5 microlitri di EcoHIV-mScarlet nel seno retro-orbitale. Dopo l'iniezione, rimuovere con cautela l'ago. Posizionare il topo anestetizzato in posizione supina all'interno di una cappa chimica.

Aprire la pelle lungo la linea mediana toracica. Quindi separare il diaframma e aprire il torace con le forbici. Ora inserisci un ago da 22 gauge da un ago e mezzo nel ventricolo sinistro.

Apri l'atrio destro con le forbici. Perfondere l'atrio destro con 50 millilitri di PBS 100 millimolare pre-raffreddato, quindi perfondere con 100 millilitri di paraformaldeide pre-raffreddata al 4%. Rimuovi l'intero cervello del topo.

Dopo aver fissato il cervello in paraformaldeide al 4%, fissare il tessuto cerebrale utilizzando l'adesivo per tessuti sulla piattaforma metallica del Vibratome. Taglio di sezioni coronali spesse 50 micrometri con lame in acciaio al carbonio. Quindi, posiziona le fette di cervello su vetrini usando un pennello.

Aggiungere immediatamente 0,1 millilitri di mezzo di montaggio anti-sbiadimento a ciascuna sezione. Posizionare un vetrino coprioggetti da 22 x 50 millimetri sulle sezioni del cervello e asciugare i vetrini Superfrost al buio per un giorno. Il giorno successivo, utilizzare un microscopio confocale con lunghezze d'onda di 488 nanometri e 594 nanometri per acquisire immagini multicanale della regione cerebrale di interesse.

I segnali di EcoHIV-mScarlet sono stati osservati principalmente nelle cellule microgliali marcate con EGFP nel cervello di topo Tmem119-EGFP. Non è stata rilevata alcuna infezione neuronale significativa in cellule cerebrali di ratto in coltura trattate con EcoHIV-mScarlet.