Name: Identificazione di cellule infette da EcoHIV in topi transgenici manipolati con microglia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Scopri l'identificazione di cellule infette da EcoHIV in topi transgenici Tmem119-EGFP per studiare le alterazioni microgliali e i serbatoi virali nei disturbi neurocognitivi associati all'HIV.

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<meta charset="utf8"></head><body>Infezione da EcoHIV nei topi Tmem119-EGFP per lo studio delle alterazioni microgliali

<ol><li>Vigorito, M., Lashomb, A. L., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+learning+and+memory+in+HIV-1+transgenic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Spatial learning and memory in HIV-1 transgenic rats.</a> J Neuroimmune Pharmacol. 2, 319-328 (2007).</li>
<li>Moran, L. M., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+and+time+again%3A+Temporal+processing+demands+implicate+perceptual+and+gating+deficits+in+the+HIV-1+transgenic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Time and time again: Temporal processing demands implicate perceptual and gating deficits in the HIV-1 transgenic rat.</a> J. Neuroimmune Pharmacol. 8 (4), 988-997 (2013).</li>
<li>Repunte-Canonigo,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+consistent+with+neuroAIDS+and+impaired+working+memory+in+HIV-1+transgenic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes consistent with neuroAIDS and impaired working memory in HIV-1 transgenic rats.</a> Mol Neurodegener. 9, 26(2014).</li>
<li>Reid, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+HIV-1+transgenic+rat+that+develops+HIV-related+pathology+and+immunologic+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (16), 9271-9276 (2001).</li>
<li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+timing%3A+NeuroHIV+progression+in+the+post-cART+era%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Disruption of timing: NeuroHIV progression in the post-cART era.</a> Sci Rep. 9, 827(2019).</li>
<li>Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+transgenic+female+rat%3A+Synaptodendritic+alterations+of+medium+spiny+neurons+in+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 transgenic female rat: Synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens.</a> J Neuroimmune Pharmacol. 9 (5), 642-653 (2014).</li>
<li>Denton, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+monoaminergic+and+histaminergic+circuit+dysregulation+following+long-term+HIV-1+protein+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22J+NeuroVirol%22%5BJournal%5D)">Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure.</a> J NeuroVirol. 25 (4), 540-550 (2019).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+transgenic+rat+as+a+model+for+HIV-1+infected+individuals+on+HAART%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 transgenic rat as a model for HIV-1 infected individuals on HAART.</a> J Neuroimmunol. 218 (1-2), 94-101 (2010).</li>
<li>Abbondanzo, S. J., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+transgenic+rats+display+alterations+in+immunophenotype+and+cellular+responses+associated+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">HIV-1 transgenic rats display alterations in immunophenotype and cellular responses associated with aging.</a> PLoS ONE. 9, e105256(2014).</li>
<li>Potash, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+study+of+systemic+HIV-1+infection%2C+antiviral+immune+responses%2C+and+neuroinvasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102 (10), 3760-3765 (2005).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Illenberger, J. M., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+HIV-1+expression%3A+Role+in+HIV-1+associated+neurocognitive+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Microglial HIV-1 expression: Role in HIV-1 associated neurocognitive disorders.</a> Viruses. 13 (5), 924(2021).</li>
<li>Kaiser, T., Feng, G. Tmem119-EGFP and Tmem119-CreERT2 transgenic mice for labeling and manipulating microglia. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaiser%2C+T+%22eNeuro%22">eNeuro</a>. 6 (4), (2019).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci. USA. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li>
<li>Satoh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMEM119+marks+a+subset+of+microglia+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology%22%5BJournal%5D)">TMEM119 marks a subset of microglia in the human brain.</a> Neuropathology. 36 (1), 39-49 (2016).</li>
<li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+filamentous+actin+%28F-actin%29+puncta+in+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons.</a> J Vis Exp. (108), e53697(2016).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+EcoHIV+brain+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A rat model of EcoHIV brain infection.</a> J Vis Exp. (167), e62137(2021).</li>
<li>Alfar, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+optimizing+production+and+quality+control+of+infective+EcoHIV+virions%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for optimizing production and quality control of infective EcoHIV virions.</a> STAR Protoc. 4 (3), 102368(2023).</li>
<li>Malatesta, P., Hartfuss, E., Götz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+radial+glial+cells+by+fluorescent-activated+cell+sorting+reveals+a+neuronal+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Isolation of radial glial cells by fluorescent-activated cell sorting reveals a neuronal lineage.</a> Development. 127 (24), 5253-5263 (2000).</li>
<li>Parpura, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-mediated+astrocyte-neuron+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glutamate-mediated astrocyte-neuron signaling.</a> Nature. 369 (6483), 744-747 (1994).</li>
<li>Wahl, A., Al-Harthi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+of+non-classical+cells+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV infection of non-classical cells in the brain.</a> Retrovirology. 20 (1), 1(2023).</li>
<li>Pandey, H. S., Seth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friends+turn+foe-astrocytes+contribute+to+neuronal+damage+in+NeuroAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Friends turn foe-astrocytes contribute to neuronal damage in NeuroAIDS.</a> J. Mol. Neurosci. 69 (2), 286-297 (2019).</li>
<li>Minagar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+macrophage%2Fmicroglia+and+astrocytes+in+the+pathogenesis+of+three+neurologic+disorders%3A+HIV-associated+dementia%2C+Alzheimer%27s+disease%2C+and+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of macrophage/microglia and astrocytes in the pathogenesis of three neurologic disorders: HIV-associated dementia, Alzheimer's disease, and multiple sclerosis.</a> J Neurol Sci. 202 (1-2), 13-23 (2002).</li>
<li>Borrajo, A., Spuch, C., Penedo, M. A., Olivares, J. M., Agís-Balboa, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+role+of+microglia+in+HIV-1+associated+neurocognitive+disorders+and+the+molecular+pathways+implicated+in+its+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Med%22%5BJournal%5D)">Important role of microglia in HIV-1 associated neurocognitive disorders and the molecular pathways implicated in its pathogenesis.</a> Ann Med. 53 (1), 43-69 (2021).</li>
<li>González-Scarano, F., Martín-García, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropathogenesis+of+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The neuropathogenesis of AIDS.</a> Nat Rev Immunol. 5 (1), 69-81 (2005).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+proliferation+underlies+synaptic+dysfunction+in+the+prefrontal+cortex%3A+Implications+for+the+pathogenesis+of+HIV-1-associated+neurocognitive+and+affective+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Microglia proliferation underlies synaptic dysfunction in the prefrontal cortex: Implications for the pathogenesis of HIV-1-associated neurocognitive and affective alterations.</a> J. Neurovirol. 29 (4), 460-471 (2023).</li>
<li>Kim, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcoHIV+infection+of+primary+murine+brain+cell+cultures+to+model+HIV+replication+and+neuropathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">EcoHIV infection of primary murine brain cell cultures to model HIV replication and neuropathogenesis.</a> Viruses. 16 (5), 693(2024).</li>
<li>Réu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lifespan+and+turnover+of+microglia+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The lifespan and turnover of microglia in the human brain.</a> Cell Rep. 20 (4), 779-784 (2017).</li>
<li>Jones, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+glial+cell+modulators+in+the+management+of+substance+use+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Drugs%22%5BJournal%5D)">Potential of glial cell modulators in the management of substance use disorders.</a> CNS Drugs. 34 (7), 697-722 (2020).</li>
<li>Kaalund, S. S., Johansen, A., Fabricius, K., Pakkenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untreated+patients+dying+with+aids+have+loss+of+neocortical+neurons+and+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Untreated patients dying with aids have loss of neocortical neurons and glial cells.</a> Front Neurosci. 13, 1398(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Celle 293FT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>33 G, ago RN con mozzo piccolo, (stile della punta: 3, lunghezza dell'ago: 19,25 mm)</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione antibiotica-antimicotica</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100x</td></tr><tr><td>C57BL/6-Tmem119em2Gfng/J</td> Il ceppo di <td>laboratorio Jackson</td><td>#:031823</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina Corning BioCoat 75cm&sup2; Pallone rettangolare per colture cellulari con collo inclinato con tappo ventilato</td><td>Life Technologies</td><td>354488</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; DMEM con L-glutammina, 4,5 g/L di glucosio e piruvato di sodio</td><td>Life Technologies</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura</td><td>VWR</td><td>637-137</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Pinze</td><td>World Precision Instruments</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>Maxi kit plasmidi EndoFree (10)</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Microcentrifuga con tappo a scatto Biopur Safe-Lock Tubes</td><td>Life Technologies</td><td>22600028</td><td></td></tr><tr><td>Feather Lame in acciaio al carbonio a doppio taglio</td><td>Ted Pella, inc.</td><td>121-9</td><td></td></tr><tr><td>Bioreagenti Fisher&nbsp; Terreni di microbiologia: LB Broth, Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo umano ricombinante anti-CD11b</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-120-214</td><td>Diluizione 1:50</td></tr><tr><td>Siringa per iniettore intraoculare (6,5 &; L), ago rimovibile</td><td>Hamilton</td><td>6609071-01</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp; Reagente di trasfezione Lipofectamine 3000&nbsp;</td><td>Tecnologie per la vita</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp; One Shot TOP10 Electrocomp&nbsp;E. coli</td><td>Fisher Scientific</td><td>C404052</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per iride</td><td>World Precision Instruments</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per iride</td><td>World Precision Instruments</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>Kit ELISA p24 associato a lentivirus</td><td>Cell Biolabs, inc.</td><td>VPK-107-5</td><td></td></tr><tr><td>Concentratore Lenti-X</td><td>Takara</td><td>PT4421-2</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Siero Ridotto Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PELCO easiSlicer&nbsp; Affettatrice vibrante per tessuti</td><td>Ted Pella, inc.</td><td>11000</td><td></td></tr><tr><td>PELCO Pro CA44 Adesivo tissutale</td><td>Ted Pella, inc.</td><td>10033</td><td></td></tr><tr><td>PELCO Pro Specimen Retriever</td><td>Ted Pella, inc.</td><td>101-33</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio monoclonale anticorpo anti-Iba1</td><td>Abcam</td><td>ab178847</td><td>Diluizione 1:500</td></tr><tr><td>RN Raccordo a compressione 1 mm</td><td>Hamilton</td><td>55750-01</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurano</td><td>Merritt Fornitura veterinaria</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley ratto gravido</td><td>Inotiv</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrini SuperFrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154%&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>To-Pro-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td>Kit di colorazione del nucleo</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Forbici</td><td>World Precision</td><td>Instruments 500086</td><td></td></tr></tbody></table>

identificazione di cellule infette da ecohiv in topi transgenici manipolati con microglia

Identification of EcoHIV-Infected Cells in Microglia-Manipulated Transgenic Mice

Un frammento di mScarlet (1858 bp) contenente siti enzimatici di "Cla1" all'estremità 3' e "Not1" all'estremità 5' è stato inserito nel vettore lentivirale pNL4-3-EcoHIV (Figura 1). Per convalidare l'espressione di EcoHIV-mScarlet, le cellule cerebrali primarie isolate dalla corteccia di embrioni E18 di ratto sono state trattate con EcoHIV-mScarlet (60 μL, 1,26 × 106 TU/mL) per 6 giorni in vitro. I dati in Figura 2 hanno mostrato che i segnali fluorescenti rossi di mScarlet erano localizzati principalmente nei tipi di cellule gliali in base alla diversa morfologia cellulare. Inoltre, la marcatura di CD11b/c e Iba1 (marcatori cellulari per la microglia) ha mostrato che i segnali mScarlet erano co-localizzati con cellule CD11b/c + e/o Iba1 +. I dati hanno indicato che le microglia erano il principale tipo di cellula di distribuzione di EcoHIV-mScarlet in vitro. Non c'è stata alcuna infezione neuronale significativa nelle cellule in coltura (Figura supplementare 1). 
Successivamente, l'infezione da EcoHIV-mScarlet è stata testata su cellule gliali miste primarie di topo adulto. A tal fine, le cellule gliali miste sono state prima isolate e purificate da topi adulti (2 mesi) e infettate con EcoHIV-mScarlet (8 μL, 1,26 × 106 TU/mL) per 2 giorni. Le immagini nella Figura 3 hanno mostrato che EcoHIV-mScarlet ha infettato con successo la glia di topo adulto.
Per affrontare ulteriormente il modello di distribuzione di EcoHIV-mScarlet nel cervello del topo, in particolare per identificare il tipo di cellula infetta, EcoHIV-mScarlet è stato iniettato retro-orbitale nella linea di topo knock-in Tmem119-EGFP in cui le microglia sono state specificamente marcate con segnali EGFP senza altri tipi di conflitti macrofagici5. I risultati nella Figura 4 (anche nella Figura 2 supplementare) mostrano che i segnali di fluorescenza rosso scarlatto sono stati osservati nelle cellule EGFP-positive, suggerendo che la microglia è il principale tipo di cellula di espressione di EcoHIV nel cervello dei topi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67150/67150fig01.jpg"> 
Figura 1: La mappa vettoriale di EcoHIV-NL-4-3-mScarlet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/67150fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67150/67150fig02.jpg"> 
Figura 2: L'infezione da EcoHIV-mScarlet nelle cellule cerebrali primarie di ratto. (A,E) Immagini rappresentative della colorazione CD11b/c nelle cellule cerebrali primarie. Le cellule cerebrali sono state isolate da embrioni di ratto E18 e infettate con il virus EcoHIV-mScarlet per 6 giorni. (B,F) Immagini rappresentative dei segnali fluorescenti mScarlet da cellule cerebrali in vitro . (C,G) Immagini rappresentative della colorazione Iba1 nelle cellule cerebrali primarie. (D,H) Immagini unite della tripla etichettatura di CD11b/c, mScarlet e Iba1. Barre della scala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/67150fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67150/67150fig03.jpg"> 
Figura 3: Infezione da EcoHIV-mScarlet in cellule gliali primarie miste di topo. (A,B) Immagini confocali rappresentative della distribuzione di mScarlet in vitro. Le cellule gliali miste primarie sono state isolate da topi adulti C57BL6 (di 2 mesi) e coltivate per 2 settimane prima dell'infezione virale. EcoHIV-mScarlet è stato aggiunto al terreno di coltura per due giorni e ha catturato le immagini sotto l'obiettivo del 60× del microscopio confocale. Barra della scala: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/67150fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67150/67150fig04.jpg"> 
Figura 4: Distribuzione di EcoHIV-mScarlet nella linea di topi knock-in Tmem119-EGFP . (A,B) Immagini unite dei segnali mScarlet/EGFP/ToPro3 nelle sezioni cerebrali. Il riquadro giallo indica l'area target di (B). Barra della scala: 300 μm. (C) Immagine rappresentativa della distribuzione di mScarlet nello strato plessiforme esterno della regione olfattiva della linea murina knock-in Tmem119-EGFP . (D) Immagine rappresentativa della distribuzione del EGFP. I segnali fluorescenti sono stati localizzati nelle cellule della microglia nella linea di topi knock-in Tmem119-EGFP . (E) Immagine rappresentativa della colorazione del nucleo di TO-PRO-3. Barre della scala: 300 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/67150fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura 1 supplementare: Colorazione MAP2 e MOG di cellule cerebrali primarie di ratto infettate con il virus EcoHIV-mScarlet. Barre di scala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura 2 supplementare: Immagini confocali dell'infezione da EcoHIV-mScarlet nella linea murina knock-in Tmem119-EGFP . Barre di scala: 75 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 1: EcoHIV-mSequenza di DNA plasmidico scarlatto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/Supplementary%20data%20-%20EcoHIV-mScarlet%20plasmid%20DNA%20sequence.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Identificazione di cellule infette da EcoHIV in topi transgenici manipolati con microglia

Combined antiretroviral therapy (cART) has dramatically improved the quality of life for people living with HIV (PLWH). However, over 4 million PLWH are ...

identification-ecohiv-infected-cells-microglia-manipulated-transgenic

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Attivazione microglia e microgliosis sono risposte chiave per neurodegenerazione cronica. Qui vi presentiamo i metodi per in vivo, la visualizzazione a lungo termine della retina CX3CR1-GFP + cellule microgliali di oftalmoscopia confocale, e per la soglia e le analisi morfometrica per identificare e quantificare la loro attivazione. Monitoriamo modifiche microgliali durante fasi iniziali di glaucoma all'età.

In Vivo Dynamics of Retinal microglia attivazione durante neurodegenerazione: confocale oftalmoscopico Imaging e Morfometria cellulare in mouse Glaucoma

Un protocollo per l'isolamento di microglia primaria dal cervello murino è presentato. Questa tecnica aiuta a promuovere la comprensione corrente di condizioni neurologiche. Centrifugazione in gradiente di densità e separazione magnetica sono combinati per produrre sufficiente resa di un campione altamente puro. Inoltre, abbiamo delineare i passaggi per la caratterizzazione di microglia.

Caratterizzazione e isolamento di Mouse Microglia primaria di centrifugazione in gradiente di densità

Il protocollo qui presentato consente il trapianto di microglia umana derivata da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSMG) nel cervello attraverso una via transnasale in topi immunocompetenti. Viene mostrato il metodo per la preparazione e il trapianto transnasale di cellule e la somministrazione di miscela di citochine per il mantenimento di iPSMG.

Trapianto di microglia derivata da cellule staminali pluripotenti indotte umane nel cervello di topi immunocompetenti tramite via transnasale non invasiva

Questo lavoro descrive un protocollo per la quantificazione delle modificazioni istoniche globali utilizzando la citometria a flusso intranucleare in microglia cerebrali isolate. Il lavoro contiene anche il protocollo di isolamento della microglia che è stato utilizzato per la raccolta dei dati.

Quantificazione delle modificazioni post-traduzionali degli istoni globali utilizzando la citometria a flusso intranucleare nella microglia cerebrale di topo isolata

Descriviamo un protocollo per isolare le cellule microgliali dall'ipotalamo del topo (o piccole strutture cerebrali equivalenti) utilizzando il cell sorting attivato magneticamente (MACS), in un tempo relativamente breve. La microglia ipotalamica selezionata con MACS può essere utilizzata per analisi ex vivo e può essere piastrata per eseguire saggi in vitro .

Isolamento della microglia ipotalamica dal cervello di topo adulto appena perfuso mediante smistamento cellulare attivato magneticamente  

Questo articolo dimostra un metodo per visualizzare e quantificare la motilità della microglia e il contatto con i punti postsinaptici nella retina utilizzando la microscopia confocale a disco rotante.

Imaging dal vivo e caratterizzazione della dinamica della microglia e delle interazioni con le sinapsi nella retina murina malata

Questo protocollo combina la citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula per isolare e caratterizzare gli stati delle cellule microgliali nel cervelletto dei cervelli di topo postnatale precoce. Utilizza la dissociazione enzimatica, la centrifugazione Percoll e l'immunocolorazione per rivelare l'eterogeneità delle microglia e migliorare la comprensione del loro ruolo nello sviluppo e nella malattia cerebellare.

Citometria a flusso e analisi di singole cellule per caratterizzare l'attivazione della microglia nello sviluppo precoce del cervello di topo postnatale

Scopri l'identificazione di cellule infette da EcoHIV in topi transgenici Tmem119-EGFP per studiare le alterazioni microgliali e i serbatoi virali nei disturbi neurocognitivi associati all'HIV.

Identificazione di cellule infette da EcoHIV in topi transgenici manipolati con microglia

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