Name: Isolamento di condrociti e condroprogenitori mediante adesione della fibronectina e saggio migratorio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Impara l'isolamento di condrociti e condroprogenitori dalla cartilagine articolare umana mediante digestione enzimatica e saggi di adesione alla fibronectina. Questo metodo supporta la ricerca in ingegneria tissutale cartilaginea.

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<meta charset="utf8"></head><body>Isolamento di condroprogenitori e condrociti dalla cartilagine articolare umana

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<li>Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+science+of+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Health%22%5BJournal%5D)">The basic science of articular cartilage.</a> Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).</li>
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<li>Lavrentieva, A., Hatlapatka, T., Neumann, A., Weyand, B., Kasper, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+for+osteogenic+and+chondrogenic+differentiation+of+MSC%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Potential for osteogenic and chondrogenic differentiation of MSC.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 129, 73-88 (2013).</li>
<li>Fernandez-Moure, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+osteogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cells+from+cortical+bone%3A+a+comparative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhanced osteogenic potential of mesenchymal stem cells from cortical bone: a comparative analysis.</a> Stem Cell Res Ther. 6, 203(2015).</li>
<li>Goldberg, A., Mitchell, K., Soans, J., Kim, L., Zaidi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+mesenchymal+stem+cells+for+cartilage+repair+and+regeneration%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">The use of mesenchymal stem cells for cartilage repair and regeneration: a systematic review.</a> J Orthop Surg Res. 12, 39(2017).</li>
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<li>Vinod, E., Kachroo, U., Amirtham, S. M., Ramasamy, B., Sathishkumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+fresh+chondrocytes%2C+cultured+chondrocytes+and+chondroprogenitors+derived+from+human+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of fresh chondrocytes, cultured chondrocytes and chondroprogenitors derived from human articular cartilage.</a> Acta Histochem. 122 (1), 151462(2019).</li>
<li>Korpershoek, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+highly+proliferative+and+multipotent+meniscus+progenitors+through+differential+adhesion+to+Fibronectin%3A+A+novel+approach+in+meniscus+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Selection of highly proliferative and multipotent meniscus progenitors through differential adhesion to Fibronectin: A novel approach in meniscus tissue engineering.</a> Int J Mol Sci. 22 (16), 8614(2021).</li>
<li>Wang, J., Roberts, S., Li, W., Wright, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+of+regional+human+meniscus+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization of regional human meniscus progenitor cells.</a> Front Bioeng Biotechnol. 10, 1003966(2022).</li>
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<li>McCarthy, H. E., Bara, J. J., Brakspear, K., Singhrao, S. K., Archer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comparison+of+equine+articular+cartilage+progenitor+cells+and+bone+marrow-derived+stromal+cells+as+potential+cell+sources+for+cartilage+repair+in+the+horse%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+J%22%5BJournal%5D)">The comparison of equine articular cartilage progenitor cells and bone marrow-derived stromal cells as potential cell sources for cartilage repair in the horse.</a> Vet J. 192 (3), 345-351 (2012).</li>
<li>Elsaesser, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+migrative+subpopulation+of+adult+human+nasoseptal+chondrocytes+with+progenitor+cell+features+and+their+potential+for+in+vivo+cartilage+regeneration+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Biosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of a migrative subpopulation of adult human nasoseptal chondrocytes with progenitor cell features and their potential for in vivo cartilage regeneration strategies.</a> Cell & Biosci. 6, 11(2016).</li>
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<li>Vinod, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraarticular+injection+of+allogenic+chondroprogenitors+for+treatment+of+osteoarthritis+in+rabbit+knee+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Orthop+Trauma%22%5BJournal%5D)">Intraarticular injection of allogenic chondroprogenitors for treatment of osteoarthritis in rabbit knee model.</a> J Clin Orthop Trauma. 10 (1), 16-23 (2018).</li>
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<li>Vinod, E., Padmaja, K., Ramasamy, B., Sathishkumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+review+of+articular+cartilage+derived+chondroprogenitors+for+cartilage+repair+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthopaed%22%5BJournal%5D)">Systematic review of articular cartilage derived chondroprogenitors for cartilage repair in animal models.</a> J Orthopaed. 35, 43-53 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>22 lame per bisturi&nbsp;</td><td>Piastra a</td> 6 pozzetti GLASS VAN<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>CORNING</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Blu Alciano</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>J6012</td><td></td></tr><tr><td>Rosso Alizarina&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>130223</td><td></td></tr><tr><td>Amfotericina-B (2 &mu; g/mL).</td><td>GIBCO</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>acido ascorbico (62 &mu; g/mL)</td><td>Citometro a flusso SIGMA ALDRICH</td><td>A4544-25G</td><td></td></tr><tr><td>BC CytoFLEX LX&nbsp;</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>CYTExpert Software Versione 2.5</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>&nbsp; C34006</td><td></td></tr><tr><td>CD105-FITC</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 561443 <tr><td>CD106-APC</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 551147 <tr><td>CD14-FITC</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 555397 <tr><td>CD29-APC</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 559883 <tr><td>CD34-PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 348057 <tr><td>CD45-FITC</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td> 347463</tr><tr><td>CD49b-FITC</td><td>MILTENYL BIOTEC</td><td>&nbsp; MACS 130/100337</td><td></td></tr><tr><td>CD49e-PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 555617 <tr><td>CD73-PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>550257 CD90-PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>561970</td><td></td></tr><tr><td>Contatore cellulare</td><td>DE NOVIX</td><td>Cell Drop BF</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare</td><td>HIMEDIA</td><td>TCP024</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>Allegra X-30R</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore CO2&nbsp;</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>MODEL-371</td><td></td></tr><tr><td>Collagene di tipo X (COL10A1), fattore di trascrizione correlato a Runt (RUNX2), fattore di trascrizione SRY-Box 9 (SOX-9), Aggrecan (ACAN) e collagene di tipo II (COL2A1)&nbsp;</td><td>EUROGENTEC, BELGIO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo II</td><td>WORTHINGTON</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium F-12)</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>D8900-1L</td><td></td></tr><tr><td>ELISA PLATE READER</td> DISPOSITIVI <td>MOLECOLARI</td><td>SpectraMax i3x Reader</td><td></td></tr><tr><td>Fast</td><td>Green FISHER SIENTIFIC</td><td>2353459</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>GIBCO</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>CLOUD CLONE CORP</td><td>APA551Hu01</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina (10 &; L/mL)</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di sintesi del primo filamento</td><td>TAKARA BIO</td><td>6110A</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>GIBCO</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Ematossilina</td><td>QUALIGENS</td><td>Q39411</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>M8787</td><td></td></tr><tr><td>Olio Rosso O</td><td>SIGMA</td><td>1320065</td><td></td></tr><tr><td>PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>PCR termociclatore&nbsp;</td><td>APPLIED BIOSYSTEMS</td><td>Termociclatore Quantstudio 12K Flex&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina (100 UI/mL)</td><td>GIBCO</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Picrosirius Red</td><td>ALFA AESAR</td><td>2610108</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo primario (topo Collagene tipo II)</td><td>DSHB</td><td>DSHB II II6B3</td><td></td></tr><tr><td>Pronasi</td><td>ROCHE</td><td>10165913103</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT Picogreen reagente DNA</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Frigorifero</td><td>ELANPRO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MiniKit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Safranina O</td><td>QUALIGENS</td><td>Q39962</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario (Anticorpo IgG anti-topo di capra, coniugato HRP)</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>31430</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua agitante&nbsp;</td>Kit di differenziazione <td>REMI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StemPro&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>1007201, A1007001 e A1007101</td><td></td></tr><tr><td>Pallone T-25</td><td>CORNING</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>TakyonTM Low Rox SYBR Master Mix dTTP Blue&nbsp;</td><td>EUROGENTEC</td><td>UF-LSMT-B0701</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta;</td><td>ABCAM</td><td>ab277760</td><td></td></tr><tr><td>Petridish di coltura tissutale</td><td>TARSONS</td><td>960010</td><td></td></tr><tr><td>Blu di toluidina</td><td>QUALIGENS</td><td>2040</td><td></td></tr><tr><td>Blu di tripano&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA</td><td>GIBCO</td><td>25200072</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento di condrociti e condroprogenitori mediante adesione della fibronectina e saggio migratorio

Isolation of Chondrocytes and Chondroprogenitors Using Fibronectin Adhesion and Migratory Assay

Da 86,9 mg di fette di cartilagine, è stata notata una resa di cellule condrocitarie di 1,72 x 105 cellule. Al momento del caricamento, i condrociti aderiscono prontamente, presentando un aspetto iniziale arrotondato di ciottoli e trasformandosi in uno stato fibroblastico dopo un'ulteriore espansione (Figura 1 A, B). La semina di questi condrociti su piastre di fibronectina si traduce tipicamente in un'adesione del 2%, con ogni cellula che subisce una crescita clonale (Figura 2 C, D), raggiungendo un raddoppio della popolazione di 5 entro i giorni 10-12 (32 cellule/clone). I cloni all'interno dell'area di 10 cm² vengono combinati ed espansi fino al passaggio necessario per produrre FAA-CP. Gli espianti di cartilagine, sostenuti in coltura dopo l'incubazione della collagenasi, mostrano un allentamento della matrice extracellulare e la migrazione si osserva generalmente già al 7° giorno (Figura 2E). Sia i FAA-CP che gli MCP mostrano una struttura a forma di fuso, una caratteristica comunemente associata alle BM-MSC, che acquisisce una struttura a nido d'ape prima della confluenza (Figura 1E, F).
I tre tipi di cellule isolate, vale a dire condrociti, FAA-CP e MCP, sono attentamente monitorati utilizzando l'imaging a contrasto di fase. I FAA-CP vengono trasferiti solo dopo la conferma di cinque raddoppi della popolazione.
La caratterizzazione fenotipica delle cellule isolate ed espanse include tipicamente l'analisi citofluorimetrica per i marcatori putativi di condrogenesi, vale a dire CD146 e CD166, nonché l'analisi dell'espressione genica per i marcatori di condrogenesi (SOX-9, ACAN, COL2A1), il marcatore della fibrocartilagine COL1A1 e i marcatori di ipertrofia (RUNX2 e COL10A1). Tutti e tre i gruppi cellulari mostrano un'elevata espressione (&gt;95%) di CD105, CD73 e CD90; espressione da bassa a negativa di CD34 e CD45; e un'elevata espressione (&gt;98%) di CD166, con un'espressione moderata e dipendente dal donatore di CD146 (40%-75%)(Figura 2A).
I risultati della qRT-PCR mostrano un'espressione comparabile ed elevata di SOX-9, ACAN e anche COL1A1, un marcatore della fibrocartilagine, poiché le cellule vengono coltivate prima della valutazione (Figura 2B). Per la conferma della condrogenesi, in tutti i gruppi cellulari si osserva un assorbimento positivo di complessi rosso-arancio nelle aree contenenti GAG dopo la safranina O e di complessi bluastri-violacei dopo il blu di Alciano e il blu di toluidina, con una percentuale più elevata nei gruppi FAA-CP e MCP. L'analisi immunoistochimica dei pellet differenziati condrogenici per il collagene di tipo II mostra una captazione fibrillare brunastra in tutti e tre i gruppi (Figura 3). Inoltre, l'analisi GAG/DNA ha anche mostrato la conferma della differenziazione condrogenica con i gruppi FAA-CP che mostrano un'espressione più elevata (Figura 2C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67160/67160fig01.jpg"> 
Figura 1: Isolamento e caratterizzazione di condrociti e condroprogenitori. L'algoritmo di studio descrive l'isolamento di tre gruppi cellulari e le loro caratteristiche morfologiche al microscopio a contrasto di fase subito dopo l'isolamento e dopo alcuni giorni di espansione. (A) I condrociti appena isolati si attaccano alle colture aderenti durante i primi giorni di coltura, acquisendo un aspetto fibroblastico con ulteriore espansione (B). (C) I condrociti sottoposti a un saggio di adesione alla fibronectina mostrano una crescita clonale, raggiungendo un raddoppio della popolazione di 5 entro il giorno 10 (D). (E) I condroprogenitori migrano dal bordo dell'espiante entro il decimo giorno di coltura e mostrano un modello di crescita a forma di fuso con ulteriore espansione (F). Ingrandimento dell'immagine a contrasto di fase: 10x; Barre di scala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67160/67160fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67160/67160fig02.jpg"> 
Figura 2: Dati di caratterizzazione molecolare. (A) Analisi citofluorimetrica per marcatori MSC positivi e negativi e potenziali marcatori di condrogenesi. (B) Dati di espressione RT-PCR per i tre gruppi cellulari per l'analisi dell'espressione genica di marcatori condrogenici e ipertrofici. (C) Analisi GAG/DNA totale dei pellet differenziati condrogenici. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67160/67160fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67160/67160fig03.jpg"> 
Figura 3: Colorazione di conferma dopo differenziazione condrogenica. Safranina O e analisi immunoistochimica per il collagene di tipo II tra i tre gruppi cellulari. Barre della scala: per ingrandimento 10x, 50 μm; Ingrandimento 40x, 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67160/67160fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Isolamento di condrociti e condroprogenitori mediante adesione della fibronectina e saggio migratorio

Chondroprogenitor cells (CPCs), recently identified as a distinct subpopulation, exhibit promise due to their mesenchymal properties, heightened ...

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Un sistema 3D per condrociti articolari umani in coltura liquido sinoviale

La biosintesi di matrice extracellulare cartilaginea dai condrociti può essere influenzata da applicazione di stimoli meccanici. Questo metodo descrive la tecnica di applicazione di compressione dinamiche ceppi di condrociti incapsulati in costrutti 3D e la valutazione dei cambiamenti indotti nel metabolismo dei condrociti.

La stimolazione meccanica di condrociti-agarosio idrogel

La riparazione della cartilagine rappresenta una sfida medica insoddisfatta e gli approcci basati sulle cellule per ingegnerizzare la cartilagine articolare umana sono una soluzione promettente. Qui, descriviamo gli idrogel biomimetici tridimensionali (3D) come uno strumento ideale per l'espansione e la maturazione dei condrociti articolari umani.

3D Hydrogel Ponteggi per articolare condrociti, Cultura e Cartilagine Generation

Presentiamo un protocollo per generare una linea condrogenica dal sangue periferico umano (PB) attraverso cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) utilizzando un metodo senza integrazione, che comprende la formazione del corpo embrionale (EB), l'espansione delle cellule fibroblasiche e l'induzione condrogenica.

Differenziare i condrociti da cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo derivato dal sangue

Un metodo per ottenere nanopatterns irregolare Dendrimero-based che consentono il controllo su scala nanometrica di locale arginina-glicina-aspartico (RGD) superficie densità dell'acido è descritto e applicato per lo studio del differenziamento cellulare adesione e chondrogenic.

Basato su Dendrimero Nanopatterns irregolare alla localmente adesività di superficie di controllo: un metodo per dirigere la differenziazione Chondrogenic

Ottenere una popolazione pura di fibroblasti è fondamentale per studiare il loro ruolo nella riparazione delle ferite e nella fibrosi. Descritto qui è un metodo dettagliato per isolare i fibroblasti e i miofibroblasti da cuori di topo feriti e feriti, seguiti dalla caratterizzazione della loro purezza e funzionalità da immunofluorescence, RTPCR, smistamento delle cellule assistite dalla fluorescenza, e contrazione del gel di collagene.

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Impara l'isolamento di condrociti e condroprogenitori dalla cartilagine articolare umana mediante digestione enzimatica e saggi di adesione alla fibronectina. Questo metodo supporta la ricerca in ingegneria tissutale cartilaginea.

Isolamento di condrociti e condroprogenitori mediante adesione della fibronectina e saggio migratorio

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