Isolamento di condrociti e condroprogenitori mediante adesione della fibronectina e saggio migratorio

Nel campo dell'ingegneria del tessuto cartilagineo e della medicina rigenerativa, c'è ancora la necessità di migliorare i risultati biologici e funzionali in termini di miglioramento del trattamento in corso e di sviluppo di nuove strategie terapeutiche. L'attuale ricerca preclinica indica il potenziale utilizzo di condroprogenitori derivati dalla cartilagine come opzione praticabile per la guarigione della cartilagine. La ricerca attuale include strategie per migliorare ulteriormente il potenziale condrogenico mantenendo una minore potenza ipertrofica attraverso l'uso di fattori di crescita aggiuntivi e tecniche di ricombinazione genica.

I condroprogenitori affrontano sfide sperimentali, tra cui la mancanza di consenso sulla nomenclatura, le diverse tecniche di isolamento, le difficoltà di caratterizzazione, la variabilità delle condizioni di coltura e la comprensione limitata dei meccanismi sottostanti. Dimostrare clinicamente che i condroprogenitori producono risultati positivi rispetto alle cellule comunemente utilizzate potrebbe ridurre significativamente il carico globale associato alle patologie legate alla cartilagine. Evoluzione di terapie migliorate utilizzando alternative prive di cellule, come le vescicole extracellulari derivate dai progenitori, e utilizzando strategie ricombinanti per la rigenerazione di una vera cartilagine ialina-simile.

Per iniziare, prelevare le articolazioni tibiofemorali o del ginocchio da donatori umani in 1X PBS in condizioni sterili, quindi trasferire le articolazioni prelevate sul sottocuscinetto sterile del cappuccio. Per stabilizzare le articolazioni, tenere l'osso subcondrale con la cartilagine rivolta verso l'alto. Utilizzando una lama di bisturi numero 22, prelevare trucioli di cartilagine di forma rettangolare dalle aree non portanti.

Tagliare la cartilagine in sezioni di otto millimetri per 10 millimetri dallo strato superficiale allo strato più profondo. Dopo aver lavato le fette con PBS, metterle in una capsula Petri contenente uno o due millilitri di Dulbecco modificato Eagle's medium, o DMEM. Quindi, utilizzando una lama di bisturi numero 22, tritare le fette di cartilagine fino a una dimensione inferiore a un millimetro cubo.

Per iniziare, ottieni la cartilagine tritata dalle articolazioni del ginocchio umane estratte. Mettere la cartilagine tritata in un pallone T25 verticale contenente 10 millilitri di DMEM/F-12 privo di siero con lo 0,15% di collagenasi di tipo II per la digestione enzimatica. Lasciare il pallone indisturbato in un incubatore ad anidride carbonica per 12-14 ore.

Dopo la digestione notturna, trasferire il terreno contenente i condrociti rilasciati in una provetta da centrifuga sterile fresca. Usa un colino per separare le celle dai detriti. Aggiungere un volume uguale di DMEM/F-12 con il 10% di siero fetale bovino, o FBS.

Centrifugare le celle filtrate a 1,200 G per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Dopo aver scartato il surnatante, ricostituire il pellet in un millilitro di terreno. Contare le cellule vitali utilizzando un saggio di esclusione del blu di tripano.

Quindi, caricare i condrociti in un pallone T25 a una concentrazione di 10.000 cellule per centimetro quadrato. Espandi le celle fino al numero di passaggio richiesto utilizzando DMEM/F-12 contenente il 10% di FBS. Rinfrescare il terreno ogni tre giorni prima di raccogliere le cellule alla subconfluenza utilizzando lo 0,125% di tripsina contenente EDTA.

I condrociti hanno aderito prontamente dopo il carico e sono passati da una forma arrotondata di ciottoli a un aspetto fibroblastico man mano che si espandono. Per iniziare, ottenere trucioli di cartilagine dalle articolazioni tibiofemorali o del ginocchio umane estratte. Sottoporre i trucioli di cartilagine a digestione enzimatica sequenziale durante la notte, utilizzando prima lo 0,2% di pronasi per tre ore, seguito dallo 0,04% di collagenasi di tipo II per 12 ore in un bagno d'acqua agitante mantenuto a 37 gradi Celsius.

Quindi, rivestire il numero richiesto di pozzetti di una piastra a sei pozzetti con 1,5 millilitri della soluzione di fibronectina PBS. Sigillare bene il piatto e conservare in frigorifero per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno seguente, rimuovere la piastra a sei pozzetti rivestita di fibronectina dal frigorifero.

Dopo aver rimosso la fibronectina in eccesso, aggiungere due o tre millilitri di terreno DMEM/F-12 semplice nei pozzetti rivestiti. Seminare i condrociti rilasciati sui pozzetti rivestiti a una densità di 4.000 cellule per pozzetto e lasciare la piastra indisturbata per 20 minuti. Dopo l'incubazione, aspirare il terreno in eccesso e le cellule non aderenti.

Aggiungere due o tre millilitri di DMEM/F-12 con il 10% di siero fetale bovino ai pozzetti. Mantenere le cellule aderenti in condizioni di coltura standard per 10-12 giorni per ottenere cloni di cellule progenitrici condrogeniche, o CPC, quindi isolare i cloni CPC utilizzando lo 0,125% di tripsina EDTA per 180 secondi, quindi riprodurre con un rapporto di un clone per cinque centimetri quadrati. Espandere le CPC policlonali arricchite fino alla confluenza richiesta.

I condrociti sottoposti a un saggio di adesione alla fibronectina mostrano una crescita clonale, raggiungendo un raddoppio della popolazione di cinque entro il giorno 10. Per iniziare, ottenere gli espianti di cartilagine rasata dall'articolazione articolare raccolta in terreno DMEM/F-12 integrato. Posizionare la piastra con gli espianti all'interno di un incubatore ad anidride carbonica impostato a 37 gradi Celsius per 48 ore.

Dopo due giorni, trasferire gli espianti in una provetta da centrifuga contenente 10 millilitri di soluzione di collagenasi allo 0,1% per la digestione enzimatica. Incubare la provetta a 37 gradi Celsius per due ore. Dopo la digestione, sciacquare gli espianti con 1X PBS e rimetterli negli stessi pozzetti della piastra contenente il terreno DMEM/F-12 fresco integrato.

Mantenere la piastra nell'incubatrice in condizioni di coltura standard e monitorare la migrazione dei condroprogenitori nei giorni successivi. Una volta che gli espianti raggiungono la subconfluenza, raccogliere le cellule condroprogenitrici mesenchimali, o MCP, utilizzando una soluzione di EDTA di tripsina allo 0,125%. Espandi gli MCP utilizzando il mezzo DMEM/F-12 integrato.

I condroprogenitori iniziano a migrare dal bordo dell'espianto entro il decimo giorno di coltura, esibendo un modello di crescita a forma di fuso con un'ulteriore espansione.