Produzione di collagene nanofibrillare per l'ingegneria tissutale

La missione scientifica generale del nostro gruppo è quella di sviluppare trattamenti terapeutici per le lesioni muscoloscheletriche traumatiche utilizzando strategie di bioingegneria. In particolare, progettiamo materiali con caratteristiche biofisiche regolabili per modulare gli ambienti extracellulari e guidare fenotipi cellulari rigenerativi. Il nostro obiettivo è quello di utilizzare questi materiali per migliorare la guarigione e migliorare la qualità della vita.

Applicando il taglio al collagene durante la fibrogenesi, l'organizzazione o l'anisotropia delle singole fibrille di collagene può essere controllata per generare scaffold con fibrille altamente allineate o casualmente con caratteristiche su scala nanometrica. Queste caratteristiche possono guidare le interazioni cellulari e l'organizzazione del citoscheletro lungo la direzione delle fibrille. Questo protocollo è in grado di fabbricare biomateriali con pattern fibrillari su scala nanometrica senza costose attrezzature specializzate o reagenti.

Ciò lo rende più accessibile rispetto ad altre tecniche di fabbricazione fibrosa e altamente efficace per le applicazioni di ingegneria tissutale inotropa. I nostri risultati pongono le basi per l'adattamento di questo protocollo ad altre proteine della matrice extracellulare. Stiamo esplorando un bio link a base di muscolo decellularizzato per vedere come imitare sia il pattern tissutale che la composizione proteica possa migliorare la rigenerazione.

Questo lavoro pone anche le basi per l'utilizzo del nostro biomateriale in una varietà di tessuti diversi. Attualmente stiamo utilizzando questa tecnologia per generare tessuti ingegnerizzati in grado di facilitare la guarigione complessa di più tipi di tessuti. Parallelamente, stiamo cercando di creare sinergie tra i nostri materiali ingegnerizzati e gli stimoli meccanici.

Speriamo di ottenere una comprensione più profonda di come le caratteristiche su scala nanometrica guidano i fenotipi cellulari e di sviluppare terapie ingegnerizzate più robuste in futuro. Per iniziare, tagliare il tubo di dialisi a circa tre pollici e reidratarlo in acqua ultrapura. Quindi agganciare un'estremità del tubo con una clip per tubo di dialisi utilizzando una siringa da 10 millilitri dotata di un ago calibro 18, trasferire da cinque a sei millilitri di collagene di coda di ratto di tipo uno nel tubo.

Successivamente, agganciare l'altra estremità del tubo per chiuderlo. Quindi, posiziona uno strato spesso da 0,5 a un centimetro di glicole polietilenico o scaglie di peg sul fondo di un piatto di vetro. Quindi posizionare il tubo per dialisi riempito di collagene sullo strato di pioli.

Aggiungere altri fiocchi di pioli per coprire completamente il tubo e mettere il piatto in un frigorifero a quattro gradi Celsius. Ogni 10-15 minuti, rimuovere le scaglie di peg bagnate dalla superficie del tubo di dialisi. Recuperare il tubo con un nuovo strato di molletta asciutta e rimettere il piatto nel frigorifero a quattro gradi Celsius.

Dopo 30-35 minuti, rimuovere le scaglie bagnate dalla superficie del tubo di dialisi. Sciacquare i fiocchi bagnati con acqua di rubinetto e asciugare il tubo con un fazzoletto. Quindi sganciare un'estremità del tubo e trasferire il collagene dializzato in provette da microcentrifuga.

Centrifugare brevemente eventuali bolle d'aria nel collagene utilizzando una mini centrifuga a 2.000 G per un massimo di 30 secondi a temperatura ambiente. Conservare il collagene a quattro gradi Celsius per un uso successivo. Un giorno prima dell'uso, aspirare circa un millilitro di collagene dializzato in una siringa da un millilitro con un ago da 16 gauge.

Quindi rimuovere l'ago e avvolgere la testina della siringa con il parafilm. Conservare la siringa in posizione verticale a quattro gradi Celsius durante la notte per consentire la rimozione di piccole bolle d'aria. Per iniziare, estrarre una siringa di collagene dializzato preparato dal frigorifero e collegare un ago smussato calibro 22.

Posizionare un vetrino di vetro nel coperchio di una piastra a quattro pozzetti e coprire il vetrino con una temperatura di 37 gradi Celsius sufficiente per immergerlo. Tenendo la siringa a un angolo di circa 30-45 gradi, estrudere manualmente sottili strisce di collagene sul vetrino. Attendi uno o due minuti affinché il collagene completi la fibrogenesi o fino a quando non diventa bianco opaco.

Quindi usa una pinza per tagliare le strisce di collagene alla lunghezza desiderata. Una alla volta, drappeggiare delicatamente le strisce di collagene nel senso della lunghezza parallele alla regione incisa su una scheggia di vetro preparata. Infila i bordi delle strisce sotto il chip.

Continuare a posizionare le strisce di collagene fino a raggiungere le dimensioni desiderate. Ora, posiziona l'idrogel di collagene appena formato su due pozzetti di una piastra a pozzetti. Lasciare asciugare gli idrogel sul piano di lavoro per una o tre ore o fino a quando i cristalli di sale PBS coprono dal 50% al 90% della superficie dell'idrogel.

Quindi immergere ogni idrogel in PBS per circa 30-60 secondi o fino a quando i cristalli di sale non si sono sciolti. Tamponare delicatamente l'eccesso di PBS dagli idrogel con un fazzoletto. Infine, riposizionare gli idrogel sulla piastra a pozzetti e lasciarli asciugare in una cappa aspirante per una notte.

Per iniziare, togli una siringa di collagene dal frigorifero e attacca un ago smussato calibro 22. Estrudere il collagene a circa 3,2 millilitri al minuto su una scheggia di vetro asciutta. Assicurarsi che venga estruso una quantità sufficiente di collagene per ottenere dimensioni come le ideroghe di collagene allineate.

Ora, usa una pinza per immergere il collagene estruso in un tubo da 50 millilitri di 10XPBS riscaldato. Attendere da 45 a 60 secondi affinché il collagene completi la fibrogenesi o fino a quando non diventa bianco opaco. Quindi tamponare delicatamente il PBS in eccesso dal collagene con un fazzoletto.

Dopo aver risciacquato e asciugato gli idrogel, sterilizzarli insieme alla piastra a pozzetti circostante in etanolo al 70% per 15 minuti. Sollevare brevemente gli idrogel a metà della sterilizzazione utilizzando una pinza per assicurarsi che sia la parte inferiore del chip di vetro che l'idrogel siano a contatto con l'etanolo. Quindi rimuovere l'etanolo e lasciare asciugare gli idrogel all'aria per 10 minuti.

Lavare gli idrogel tre volte in PBS sterile per 10 minuti ciascuno per rimuovere l'etanolo residuo e reidratare gli idrogel. Immagini in campo chiaro di mioblasti primari del muscolo scheletrico di topo hanno mostrato che la guida nanotopografica anisotropa della fibro di collagene promuove l'allineamento cellulare.