Name: Produzione di collagene nanofibrillare per lingegneria tissutale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Impara un metodo di estrusione a taglio per fabbricare idrogeli di collagene con fibrille nanostrutturate per l'ingegneria tissutale. Questa tecnica controlla l'allineamento delle fibrille per guidare le interazioni cellulari.

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<meta charset="utf8"></head><body>Fabbricazione di collagene nanofibrillare ingegnerizzato con patterning diretto

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Collagene I, alta concentrazione, coda di ratto</td><td>Corning</td><td>CB354249</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TE-2000-U microscopio</td><td>Nikon</td><td>TE-2000-U&nbsp;</td><td>Microscopio invertito</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio extra spessi</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-267-005</td><td>Funziona bene per la superficie di estrusione del collagene</td></tr><tr><td>FEI Helios G3 NanoLab DualBeam</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>Microscopio elettronico a scansione</td></tr><tr><td>Set di strumenti per tagliavetro 2mm-20mm Stile matita Punta in metallo duro per alimentazione a olio</td><td>Amazon/MOARMOR</td><td></td><td>B07Y1D243H Opzione per un tagliavetro</td></tr><tr><td>Hamilton Kel-F Hub Aghi a punta smussata (Luer Lock, 22 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-815-574</td><td>Aghi per estrusione di collagene</td></tr><tr><td>Nexterion Slide H 3-D</td><td>Schott</td><td>NC0782819</td><td>Vetrini idrofobici</td></tr><tr><td>PBS Compresse</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicole 8000</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>Tubo per dialisi in cellulosa senza saldatura&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25645G</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin Clip per dialisi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI68011</td><td></td></tr><tr><td>Synthware Tagliavetro</td><td>Synthware</td><td>31-501-927</td><td>Opzione per un tagliavetro</td></tr></tbody></table>

produzione di collagene nanofibrillare per l'ingegneria tissutale

Production of Nanofibrillar Patterned Collagen for Tissue Engineering

Questo protocollo descrive una semplice tecnica di estrusione basata sul taglio per la fabbricazione di idrogel di collagene composti da nanofibrille allineate (Figura 2) o orientate in modo casuale (Figura 3). Il patterning delle nanofibrille si basa sul controllo preciso delle forze di taglio, che si ottiene attraverso la modulazione combinata della velocità della siringa e della velocità di estrusione del collagene. I valori ottimali per indurre l'allineamento delle fibrille sono stati precedentemente determinati come una velocità della siringa di 340 mm/s e una velocità di estrusione del collagene di 3,2 mL/min28,29. Questo equilibrio è fondamentale non solo per la formazione di nanofibrille allineate, ma anche per garantire la funzionalità degli idrogel su macroscala. Se questo rapporto è disallineato, c'è il rischio di fabbricare idrogel che non sono modellati come previsto, così come idrogel contenenti strisce di collagene troppo sottili (&lt;0,5 mm di diametro), spesse (&gt;1,5 mm di diametro) o ondulate per l'uso. Ad esempio, un movimento troppo veloce di una siringa, unito a una velocità di estrusione troppo lenta, si traduce in strisce sottili, mentre il rapporto opposto produce strisce spesse o ondulate (Figura 4A-D), a seconda del grado di squilibrio nel rapporto. Queste differenze nelle proprietà macroscopiche possono creare una variabilità da striscia a striscia sufficiente a influenzare la deposizione cellulare e l'adesione locale.
Dopo l'estrusione e l'assemblaggio del collagene, la fabbricazione dell'idrogel procede attraverso una fase iniziale di asciugatura, spesso da 1 a 3 ore, prima di essere sottoposta a una fase di lavaggio in 1x PBS (Figura 2 e Figura 3). Il raggiungimento di risultati topografici ottimali si basa su un delicato equilibrio tra i tempi e l'intensità della fase di lavaggio. Un lavaggio insufficiente o ritardato provoca una topografia delle fibre interrotta, denotata dalle impronte di cristalli di sale PBS sulle fibrille. Al contrario, un lavaggio eccessivo o prematuro del collagene post-fabbricazione provoca uno strato disciolto di collagene che copre le caratteristiche topografiche (Figura 4E, F).
La microscopia elettronica a scansione (SEM) conferma la presenza di orientamento allineato o casuale delle nanofibrille all'interno degli idrogel di collagene. Sia negli idrogel allineati che in quelli casuali, le nanofibrille mostrano diametri delle fibrille compresi tra 30 e 50 nm29. Qualitativamente, è evidente che gli idrogel allineati contengono nanofibrille allineate uniassialmente (Figura 5). Questo allineamento è stato precedentemente quantificato utilizzando l'analisi della trasformata di Fourier veloce 2D, in cui il grafico di allineamento mostra due picchi distinti distanziati di 180° l'uno dall'altro per gli idrogel allineati, in contrasto con gli idrogel orientati in modo casuale che mostrano solo picchi a bassa frequenza28.
Le immagini in campo chiaro dei mioblasti primari del muscolo scheletrico del topo illustrano che la guida nano-topografica anisotropa delle fibrille di collagene promuove l'allineamento cellulare (Figura 6). È stato dimostrato che questi idrogel di collagene nanostrutturati inducono l'allineamento cellulare non solo nei mioblasti26 ma anche in altri tipi di cellule, come le cellule endoteliali 23,24.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig01.jpg"> 
Figura 1: Illustrazione schematica del collagene ad altissima densità e della preparazione di vetrini in vetro tagliato. (A-F) Processo di dialisi del collagene: (A) preparazione del tubo per dialisi in strisce da 3 pollici e fissaggio della prima clip, (B) caricamento del collagene stock ad alta densità nel tubo e fissaggio della seconda clip, (C) rivestimento del tubo per dialisi caricato con scaglie di glicole polietilenico (PEG), (D) rimozione dei fiocchi di PEG saturi, (E) risciacquo dei fiocchi di PEG con acqua e (F) conservazione del collagene ad altissima densità in provette per microcentrifuga. (G-L) Processo di taglio dei vetrini: (G) acquisizione di vetrini per lo studio, (H,I) incisione del vetrino con taglierina diamantata, (J) rottura del vetrino dal lato non inciso, (K) risciacquo del vetro tagliato con acqua e (L) asciugatura del vetrino. Realizzato con BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig02.jpg"> 
Figura 2: Processo di fabbricazione dell'idrogel di collagene allineato. Fase 1: Estrusione del collagene sotto taglio nel tampone riscaldato PBS 10x e induzione della fibrillogenesi; Fase 2: Montaggio del collagene estruso su vetrini tagliati; Passaggio 3: montaggio di ulteriore collagene estruso per aumentare le dimensioni dell'idrogel; e Fase 4: Essiccazione degli idrogel di collagene. Realizzato con BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig03.jpg"> 
Figura 3: Processo di fabbricazione casuale dell'idrogel di collagene. Passaggio 1: estrusione del collagene su vetrini tagliati (striscia singola); Passaggio 2: l'estrusione continua di collagene aumenta le dimensioni (strisce multiple); Fase 3: Immersione del collagene estruso in un tampone PBS 10X per avviare la fibrillogenesi; e Passaggio 4: essiccazione degli idrogel. Realizzato con BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig04.jpg"> 
Figura 4: Possibili passaggi di errore nel processo di fabbricazione dell'idrogel di collagene. (A-F) Esempi di (A) strisce di collagene di spessore ottimale, (B) strisce di collagene eccessivamente spesse, (C) strisce di collagene non sufficientemente spesse, (D) strisce di collagene ondulate e (E,F) superfici di collagene eccessivamente lavate mostrate utilizzando la microscopia elettronica a scansione. Barra della scala = 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig05.jpg"> 
Figura 5: Immagini al microscopio elettronico a scansione di idrogel di collagene allineati e casuali. Le immagini sono state scattate utilizzando un microscopio elettronico. Le condizioni del fascio sono state impostate a 2 keV, con un intervallo di corrente di 25-100 pA e una distanza di lavoro di 4-5 mm. Le immagini sono state salvate in modo coerente con una risoluzione di 6144 x 4096 pixel con un tempo di permanenza di 1 μs. Barra della scala = 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig06.jpg"> 
Figura 6: Mioblasti primari di topo coltivati su idrogel di collagene allineati e casuali. I mioblasti sono stati coltivati sugli idrogel per 3 giorni prima dell'imaging. Le immagini in campo chiaro sono state scattate con un ingrandimento di 10x utilizzando un microscopio invertito. La freccia indica l'orientamento allineato delle nanofibrille. Barra della scala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Produzione di collagene nanofibrillare per l'ingegneria tissutale

Regenerative biomaterials are designed to facilitate cell-material interactions to guide the repair of damaged tissues and organs. These materials are ...

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Ingegneria 3D Cellularized collagene Gel per Vascolare Rigenerazione Tissutale

La creazione di microtessuti funzionali all'interno di dispositivi microfluidici richiede la stabilizzazione dei fenotipi cellulari adattando le tecniche tradizionali di coltura cellulare alle limitate dimensioni spaziali dei microdispositivi. La modifica del collagene consente la deposizione strato per strato di assemblaggi di collagene ultrasottili in grado di stabilizzare le cellule primarie, come gli epatociti, come modelli di tessuto microfluidico.

Layer-by-layer collagene Deposizione nel Microfluidic Dispositivi per microtessuto Stabilizzazione

È stata sviluppata un'innovativa tecnica di biofabbricazione per ingegnerizzare costrutti tridimensionali che assomigliano alle caratteristiche architettoniche, ai componenti e alle proprietà meccaniche dei tessuti in vivo. Questa tecnica presenta un materiale sacrificale di nuova concezione, la gomma BSA, che trasferisce caratteristiche spaziali dettagliate, riproducendo le architetture in vivo di un'ampia varietà di tessuti.

Tridimensionale Tecnologia biomimetica: Novel Biorubber Consente di creare Definito micro e macro scala Architetture in collagene idrogel

Qui viene presentato un protocollo per generare tessuti connettivi ingegnerizzati per una coltura parallela di 48 tessuti in una piastra multi-pozzo con doppi poli, adatto per studi meccanicistici, modellazione di malattie e applicazioni di screening. Il protocollo è compatibile con fibroblasti di diversi organi e specie ed è esemplificato qui con fibroblasti cardiaci primari umani.

Tessuto connettivo ingegnerizzato umano derivato da fibroblasti per applicazioni di screening

Questo protocollo dimostra l'uso di un canale microfluidico con geometria variabile lungo la direzione del flusso del fluido per generare tensione estensionale (stretching) per allineare le fibre in un idrogel di collagene 3D (&lt;250 μm di spessore). L'allineamento risultante si estende su diversi millimetri ed è influenzato dalla velocità di deformazione estensionale.

Idrogel di collagene 3D di microingegneria con allineamento delle fibre a lungo raggio

Gli inserti per colture tissutali con membrane in plastica sono lo standard d'oro nei laboratori di coltura cellulare come supporti permeabili per stabilire strati cellulari e modelli di tessuti barriera. Qui, presentiamo un metodo semplice per sostituire la membrana di plastica con una membrana biologicamente più rilevante costituita da una proteina di seta di ragno funzionalizzata ricombinante.

Mimic della membrana basale nanofibrillare in seta di ragno funzionalizzata ricombinante in inserti di coltura tissutale su misura

Impara un metodo di estrusione a taglio per fabbricare idrogeli di collagene con fibrille nanostrutturate per l'ingegneria tissutale. Questa tecnica controlla l'allineamento delle fibrille per guidare le interazioni cellulari.

Produzione di collagene nanofibrillare per l'ingegneria tissutale

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