Screening di frammenti covalenti mediante il saggio di tethering quantitativo irreversibile

Lavoriamo tra i dipartimenti di chimica e scienze della vita, sviluppando nuovi ligandi covalenti reattivi per una serie di bersagli farmacologici antitumorali. Si spera che queste molecole vengano utilizzate in futuro, sia come terapie che possibilmente come sonde chimiche. Quindi esistono diverse tecnologie per lo screening dei ligandi covalenti.

Questi possono essere ampiamente suddivisi in tecniche proteomiche in cui i composti vengono incubati con cellule in coltura e spettrometria di massa utilizzata per determinare quali proteine etichettano le molecole e metodi basati su bersagli in cui librerie di elettrofili vengono incubate con singole proteine. Una sfida sperimentale significativa riguarda la reattività dei ligandi covalenti. Le molecole eccessivamente reattive appaiono spesso come risultati durante i saggi di screening, ma non sono adatte in quanto etichettano in modo non selettivo molte proteine diverse nella cellula.

L'insieme dell'attività è, quindi, cruciale da considerare in ogni fase della scoperta di farmaci covalenti. Così i gruppi di Mann e Armstrong dell'Imperial hanno sviluppato un nuovo metodo di screening degli elettrofili contro un bersaglio proteico chiamato tethering quantitativo irreversibile o saggio qIT. Il nostro protocollo fornisce un nuovo metodo di screening degli elettrofili rispetto a un bersaglio proteico, che è scalabile, non richiede spettrometria di massa e controlla la reattività intrinseca del composto.

Per iniziare, preparare tutte le soluzioni madre necessarie e lasciarle a temperatura ambiente per due ore prima dell'esperimento. Degassare il tampone di saggio quantitativo, irreversibile o qIT con gas argon per circa 30 minuti. Per uno scambio di tampone efficiente, diluire la soluzione proteica in eccesso rispetto al tampone del saggio qIT degassato in un'unità di centrifugazione e centrifugare a 4.000 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius per concentrare la proteina.

Quindi diluire la soluzione proteica target a una concentrazione di 15 micromolari nel tampone del saggio qIT degassato per preparare nove millilitri di soluzione. Erogare la soluzione di TCEP-agraosio, il tampone qIT e il brodo di glutatione nei pozzetti appropriati delle piastre da 384 pozzetti. Trasferire 1,8 microlitri da ciascun pozzetto corrispondente della piastra della libreria di frammenti per creare una piastra di diluizione del composto diluendo ciascun composto a 1,5 millimolari in tampone di saggio qIT, più il 3% di DMSO.

Utilizzare una stazione di pipettaggio 384 per trasferire 20 microlitri di soluzione composta da ciascun pozzetto della piastra di diluizione del composto in entrambe le piastre di reazione. Per iniziare, impostare il test di tethering irreversibile quantitativo o qIT con la proteina e il glutatione desiderati. Erogare 500 micromolari CPM in aliquote da 111,2 microlitri in provette per microcentrifuga e conservarle a 20 gradi Celsius.

Dopo aver scongelato il brodo CPM, aggiungerlo a 40 millilitri di tampone di quench del saggio qIT per preparare una soluzione da 1,4 micromolari Erogare 27 microlitri di soluzione di Quench CPM in ciascun pozzetto di due piastre fresche da 384 pozzetti. Centrifugare la piastra di reazione proteica a 200 g per tre minuti per pellettare TCEP-agarosio. In momenti predeterminati, utilizzare una stazione di pipettaggio 384 per trasferire tre microlitri di campione da ogni pozzetto della piastra di reazione proteica alla piastra di quench CPM.

Rimuovere il campione dalla parte superiore del pozzetto evitando di aspirare il TCEP-agarosio sul fondo. Incubare le piastre di quench CPM a temperatura ambiente per un'ora e misurare l'intensità della fluorescenza con un'eccitazione a 384 nanometri e un'emissione a 470 nanometri. Per iniziare, eseguire il tethering quantitativo-irreversibile o il test qIT con la proteina desiderata e spegnere i campioni in una piastra CPM.

Per ogni quench, calcolare Z prime come misura della qualità del saggio. Calcolare quindi i valori medi di fluorescenza per i pozzetti di controllo negativo nelle colonne uno e due e per i pozzetti di controllo positivo nelle colonne 23 e 24. Normalizzare bene ogni reazione ai valori medi di fluorescenza dei controlli positivi e negativi e tracciare separatamente la percentuale di modifica in funzione del tempo per ciascun composto che reagisce con il glutatione e con la proteina bersaglio.

Utilizzando GraphPad, adattate i dati normalizzati della percentuale di modifiche rispetto al tempo a un modello di decadimento esponenziale monofase per entrambe le reazioni utilizzando l'equazione, AE alla potenza di KT C.Utilizzare la velocità con cui i frammenti reagiscono con proteine e glutatione per calcolare il fattore di miglioramento della velocità o il valore REF per ciascun frammento. Infine, per selezionare i frammenti di hit, impostare una soglia REF, una percentuale di hit arbitraria o selezionare frammenti con REF tre deviazioni standard maggiori della media geometrica. Il composto uno ha reagito con il residuo di cisteina sulla proteina bersaglio a una velocità sei volte maggiore rispetto al glutatione, soddisfacendo il criterio Hit di REF maggiore di tre.

Il composto due non ha mostrato una velocità di reazione accelerata con il residuo di cisteina bersaglio rispetto al glutatione, indicando una mancanza di interazioni produttive non covalenti e quindi non è stato selezionato come hit.