Quantificazione della respirazione mitocondriale in cellule intere di lievito

La respirazione mitocondriale è un principale generatore di energia cellulare nella maggior parte delle circostanze e un importante indicatore del metabolismo e della fitness cellulare. Pertanto, le funzioni mitocondriali delineano lo stato cellulare bioenergetico. Questo protocollo descrive una tecnica per quantificare la respirazione mitocondriale nelle cellule viventi G come parametro bioenergetico.

La tecnica descritta in questo protocollo ci aiuta a definire il meccanismo bioenergetico di alcuni polifenoli, come il resveratrolo e il coircitene. Serve anche come strumento per misurare il metabolismo del pentoso, anche dei PTSPT e spiega i cambiamenti bioenergetici dietro l'albero della cabina e gli effetti del lavoro a terra. Siamo interessati a decifrare come le cellule acquisiscono alcuni fenotipi, come l'albero di cabina e gli effetti del lavoro a terra, con cambiamenti significativi nella bioenergetica cellulare.

La respirazione mitocondriale è uno strumento essenziale per chiarire i meccanismi molecolari alla base di questo fenomeno metabolico. Per iniziare, inoculare una provetta di vetro da 10 millilitri contenente tre millilitri di terreno YPD con 250 microlitri di cellule di lievito conservate in glicerolo. Incubare la provetta per una notte a 30 gradi Celsius con agitazione costante a 200 giri al minuto.

Quindi, utilizzando un anello sterile, striare una coclea YPD con le cellule di lievito coltivate nella provetta di vetro da 10 millilitri. Incubare la capsula di Petri a 30 gradi Celsius fino a quando non compaiono colonie isolate. Per preparare un pre-inoculo, inoculare tre millilitri di terreno YPD al 2% di glucosio con due o tre colonie di lievito isolate e incubare.

Quindi ottenere 100 millilitri di terreno sintetico sterile completo in un pallone di Erlenmeyer da 500 millilitri. Inoculare il terreno con la coltura di lievito pre-inoculo durante la notte a una densità ottica iniziale di 0,1 a 600 nanometri. Aggiungi la sfida chimica come il resveratrolo 100 micromolare per testare la respirazione mitocondriale.

Quindi, versare le celle della fase log centrale in una provetta conica vuota e pre-pesata da 15 millilitri e centrifugare le celle a 4.000 g per cinque minuti. Dopo aver scartato il surnatante, lavare il pellet tre volte con 25 millilitri di acqua deionizzata. Pesare il tubo conico contenente il pellet lavato per ottenere il peso umido sottraendo il peso del tubo vuoto.

Quindi risospendere il pellet lavato in due millilitri di acqua deionizzata. Per iniziare, procurati le cellule di lievito trattate con farmaci appropriati, come il resveratrolo. Posizionare cinque millilitri di tampone MES-TEA da 10 millimolari e 50 milligrammi di cellule umide nella camera di innesto polare.

Posizionare delicatamente l'elettrodo di ossigeno di tipo Clark, assicurandosi che non si formino bolle. Accendere il monitor YSI 5300A e il computer di acquisizione dati. Selezionare la manopola di impostazione del canale uno per la messa in onda e regolare il canale uno al 100% con la manopola di calibrazione del canale uno.

Inizia a registrare i dati e inizia a misurare il tempo utilizzando un cronometro. Utilizzando una siringa per cromatografia, aggiungere il substrato ossidabile a una concentrazione finale di 10 millimolari e mantenere la camera chiusa con agitazione costante. Quindi, utilizzando una siringa per cromatografia, aggiungere oligomicina per ottenere una concentrazione finale di 0,01 millimolari nella camera dell'ossimetro e registrare la percentuale di consumo dell'aria.

Allo stesso modo, aggiungere CCCP a una concentrazione finale di 0,015 millimolari nella camera dell'ossimetro per determinare la capacità respiratoria massima. Successivamente, aggiungere gli inibitori della catena di trasporto degli elettroni, il triflurositone dei denti e dell'olio, o TTFA, a un millimolare, seguito dall'antimicina A a un milligrammo per millilitro. Lavare la camera tre volte ciascuna con etanolo al 70%, seguita da acqua deionizzata, prima di procedere alla fonte di carbonio successiva.

Per iniziare, eseguire un saggio del consumo di ossigeno con cellule di lievito, utilizzando varie fonti di carbonio e controlli. Creare un nuovo file di progetto nel software statistico e scegliere XY nella sezione di creazione. Quindi seleziona Invio o importa i dati in una nuova tabella nella sezione della tabella dati.

Nella sezione delle opzioni, seleziona i numeri nella sottosezione X e nella sottosezione Y. Fare clic su inserisci tre valori replicati in sottocolonne affiancate. Inserire i dati temporali nelle colonne X e inserire i dati della percentuale d'aria nelle colonne Y.

Per eseguire un'analisi di regressione lineare, fare clic su Analizza nella barra dei menu e in Analisi, selezionare Regressione lineare semplice su Analisi XY, quindi fare clic su OK. Ottenere il valore della pendenza dalla sezione dei risultati nelle tabelle dati. Copiare i valori di pendenza calcolati in un foglio dati.

Sottrarre il valore di pendenza ottenuto dalla miscela di inibitori respiratori Mix da quelli del substrato ossidabile, dell'oligomicina e della CCCP per scartare altre fonti di consumo di ossigeno. Ora, moltiplica i valori di pendenza per 237 micromolari di ossigeno, che rappresenta la solubilità dell'ossigeno in quella condizione, e tampona. Converti i valori in micromolari di ossigeno al minuto, regolandoli in base al tempo per tracciato.

Dividi i risultati per 50, che rappresenta i milligrammi di cellule utilizzate nell'esperimento. Infine, il consumo di ossigeno è espresso come micromolare di ossigeno per milligrammo di cellule al minuto. Le cellule cresciute con glucosio allo 0,5% hanno mostrato un consumo di ossigeno significativamente più elevato nella respirazione basale, nella respirazione legata all'ATP e nella capacità respiratoria massima, rispetto a quelle cresciute con glucosio al 5%.

La quercetina ha ridotto significativamente la respirazione mitocondriale nelle cellule coltivate con lo 0,5% di glucosio, influenzando la respirazione basale, legata all'ATP e massimale. D'altra parte, la quercetina non ha influenzato in modo significativo la respirazione mitocondriale nelle cellule, cresciute con il 5% di glucosio.