Name: Quantificazione della respirazione mitocondriale in cellule intere di lievito (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Impara a quantificare la respirazione mitocondriale in cellule intere di lievito per studiare la bioenergetica cellulare. Questo metodo rivela gli effetti dei polifenoli sul metabolismo energetico.

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<meta charset="utf8"></head><body>Misurazione della respirazione mitocondriale del lievito mantenendo il contesto cellulare

<ol><li>Jang, D. H., Seeger, S. C., Grady, M. E., Shofer, F. S., Eckmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+and+respiration+within+cells+with+increased+open+pore+cytoskeletal+meshes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics and respiration within cells with increased open pore cytoskeletal meshes.</a> Biol Open. 6 (12), 1831-1839 (2017).</li>
<li>Duvezin-Caubet, S., Caron, M., Giraud, M. F., Velours, J., di Rago, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+rotor+components+of+yeast+mitochondrial+ATP+synthase+are+mechanically+coupled+by+subunit+delta%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The two rotor components of yeast mitochondrial ATP synthase are mechanically coupled by subunit delta.</a> Proc Natl Acad Sci. 100 (23), 13235-13240 (2003).</li>
<li>Vakifahmetoglu-Norberg, H., Ouchida, A. T., Norberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondria+in+metabolism+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Comm%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondria in metabolism and cell death.</a> Biochem Biophys Res Comm. 482 (3), 426-431 (2017).</li>
<li>Matus-Ortega, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+complexes+containing+the+internal+alternative+NADH+dehydrogenase+%28Ndi1%29+in+mitochondria+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">New complexes containing the internal alternative NADH dehydrogenase (Ndi1) in mitochondria of Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 32 (10), 629-641 (2015).</li>
<li>Avéret, N., Jobin, M. L., Devin, A., Rigoulet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+pumping+complex+I+increases+growth+yield+in+Candida+utilis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys%22%5BJournal%5D)">Proton pumping complex I increases growth yield in Candida utilis.</a> Biochim Biophys. 1847 (10), 1320-1326 (2015).</li>
<li>Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Respiratory chain supercomplexes.</a> IUBMB Life. 52 (3-5), 119-128 (2001).</li>
<li>Lasserre, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+as+a+system+for+modeling+mitochondrial+disease+mechanisms+and+discovering+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Yeast as a system for modeling mitochondrial disease mechanisms and discovering therapies.</a> Dis Model Mech. 8 (6), 509-526 (2015).</li>
<li>Turina, P., Samoray, D., Gräber, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%2B%2FATP+ratio+of+proton+transport-coupled+ATP+synthesis+and+hydrolysis+catalysed+by+CF0F1-liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">H+/ATP ratio of proton transport-coupled ATP synthesis and hydrolysis catalysed by CF0F1-liposomes.</a> EMBO J. 22 (3), 418-426 (2003).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+energy+metabolism+in+cultured+cells%2C+including+human+pluripotent+stem+cells+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Prot%22%5BJournal%5D)">Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells.</a> Nat Prot. 7 (6), 1068-1085 (2012).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Javadov, S., Margreiter, R., Hagenbuchner, J., Ausserlechner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function%2C+structure%2C+and+intracellular+organization+in+situ+in+cardiomyocytes+and+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function, structure, and intracellular organization in situ in cardiomyocytes and skeletal muscles.</a> Int J Mol Sci. 23 (4), 2252(2022).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+for+the+analysis%2C+standardization+and+interpretation+of+oxygen+consumption+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements.</a> Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).</li>
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<li>Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+intracellular+rates+of+glycolytic+and+oxidative+ATP+production+and+consumption+using+extracellular+flux+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements.</a> J Biol Chem. 292 (17), 7189-7207 (2017).</li>
<li>Rosenfeld, E., Beauvoit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+non-respiratory+pathways+in+the+utilization+of+molecular+oxygen+by+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen by Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).</li>
<li>Granados-Arvizu, J. A., Canizal-García, M., Madrigal-Pérez, L. A., González-Hernández, J. C., Regalado-González, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+alternative+respiration+system+of+Scheffersomyces+stipitis+and+effect+on+glucose+or+xylose+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of alternative respiration system of Scheffersomyces stipitis and effect on glucose or xylose fermentation.</a> FEMS Yeast Res. 21 (2), foab005(2021).</li>
<li>Carrillo-Garmendia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snf1p%2FHxk2p%2FMig1p+pathway+regulates+hexose+transporters+transcript+levels%2C+affecting+the+exponential+growth+and+mitochondrial+respiration+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%22%5BJournal%5D)">Snf1p/Hxk2p/Mig1p pathway regulates hexose transporters transcript levels, affecting the exponential growth and mitochondrial respiration of Saccharomyces cerevisiae.</a> Fungal Genet Biol. 161, 103701(2022).</li>
<li>Maslanka, R., Zadrag-Tecza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+potential+of+yeast+cells+depends+on+overall+action+of+interconnected+changes+in+central+carbon+metabolism%2C+cellular+biosynthetic+capacity%2C+and+proteostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Reproductive potential of yeast cells depends on overall action of interconnected changes in central carbon metabolism, cellular biosynthetic capacity, and proteostasis.</a> Int J Mol Sci. 21 (19), 7313(2020).</li>
<li>Olivares-Marin, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+carbon+and+nitrogen+sources+depend+on+RIM15+and+determine+fermentative+or+respiratory+growth+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 102 (10), 4535-4548 (2018).</li>
<li>Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiration+is+required+to+provide+amino+acids+during+fermentative+proliferation+of+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast.</a> EMBO Rep. 21 (11), e50845(2020).</li>
<li>Carrillo-Garmendia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+of+quercetin+is+related+to+mitochondrial+respiration+impairment+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity of quercetin is related to mitochondrial respiration impairment in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 39 (11-12), 617-628 (2022).</li>
<li>Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+yeast+short-term+Crabtree+effect+and+its+origin%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin.</a> FEBS J. 281 (21), 4805-4814 (2014).</li>
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<li>Madrigal-Perez, L. A., Nava, G. M., Gonzalez-Hernandez, J. C., Ramos-Gomez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+increases+glycolytic+flux+in+Saccharomyces+cerevisiae+via+a+SNF1-dependet+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerr+Biomemb%22%5BJournal%5D)">Resveratrol increases glycolytic flux in Saccharomyces cerevisiae via a SNF1-dependet mechanism.</a> J Bioenerr Biomemb. 47 (4), 331-336 (2015).</li>
<li>Gueguen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+directly+binds+to+mitochondrial+complex+I+and+increases+oxidative+stress+in+brain+mitochondria+of+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Resveratrol directly binds to mitochondrial complex I and increases oxidative stress in brain mitochondria of aged mice.</a> PloS One. 10 (12), e0144290(2015).</li>
<li>Lagoa, R., Graziani, I., Lopez-Sanchez, C., Garcia-Martinez, V., Gutierrez-Merino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+I+and+cytochrome+c+are+molecular+targets+of+flavonoids+that+inhibit+hydrogen+peroxide+production+by+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Complex I and cytochrome c are molecular targets of flavonoids that inhibit hydrogen peroxide production by mitochondria.</a> Biochim Biophys Acta. 1807 (12), 1562-1572 (2011).</li>
<li>de Oliveira, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quercetin+and+the+mitochondria%3A+A+mechanistic+view%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Quercetin and the mitochondria: A mechanistic view.</a> Biotechnol Adv. 34 (5), 532-549 (2016).</li>
<li>Carrillo-Garmendia, A., Madrigal-Perez, L. A., Regalado-Gonzalez, C. The multifaceted role of quercetin derived from its mitochondrial mechanism. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarrillo-Garmendia%2C+A+%22Mol+Cell+Biochem%22">Mol Cell Biochem</a>. , (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2- thenoiltrifluoroacetone (TTFA)</td><td>Merck</td><td>T27006</td><td>Complesso inibitore II</td></tr><tr><td>3-clorofenilidrazone cianuro di carbonile (CCCP)</td><td>Merck</td><td>C2759</td><td>Disaccoppiatore di respirazione mitocondriale&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Absolut ethanol</td><td>Merck</td><td>107017</td><td>Per sciogliere la quercetina&nbsp;</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Merck</td><td>A1296</td><td>YPD agar preparazione</td></tr><tr><td>Solfato di ammonio granulare (NH4)2SO4</td><td>J.T. Baker</td><td>0792-05</td><td>SC preparazione del brodo</td></tr><tr><td>Antimicina A (AA)</td><td>Merck</td><td>A8674</td><td>Complesso inibitore III</td></tr><tr><td>aYSI5300A</td><td>----</td><td>----</td><td>Monitor&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Hermle</td><td>Z 206 A</td><td>Per centrifugazione cellulare</td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>----</td><td>----</td><td>Electrode&nbsp;</td></tr><tr><td>Computer</td><td>----</td><td>----</td><td>Per l'acquisizione dei dati&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosfato dipotassico K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3252-05</td><td>SC preparazione del brodo</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td></td><td>Merck G7021</td><td>YPD preparazione del brodo</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Merck</td><td>G5516</td><td>Substrato media integrazione&nbsp;</td></tr><tr><td>Substrato</td><td>di lattato Merck</td><td>L1250</td><td>media integrazione&nbsp;</td></tr><tr><td>Oligomicina da Streptomyces diastatochromogenes</td><td>Merck</td><td>O4876</td><td>Inibizione dell'ATP sintasi mitocondriale</td></tr><tr><td>Agitatore orbitale</td><td>Thermo Fisher</td><td>SHKE6000</td><td>Incubazione dell'inoculo in tubi di vetro e pallone</td></tr><tr><td>Peptone da caseina, digestato enzimatico</td><td>Merck</td><td>82303</td><td>YPD preparazione del brodo</td></tr><tr><td>Quercetina&nbsp;</td><td>Merck</td><td>337951</td><td>Per diminuire la respirazione mitocondriale</td></tr><tr><td>Uracillo&nbsp;</td><td>Merck</td><td>U0750</td><td>SC preparazione del brodo</td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Merck</td><td>Y1625</td><td>YPD preparazione del brodo</td></tr><tr><td>Lievito base azotata senza aminoacidi e solfato di ammonio</td><td>Merck</td><td>Y1251</td><td>SC preparazione del brodo</td></tr><tr><td>Lievito Sintetico Drop-out integratori di terreni senza uracile</td><td>Merck</td><td>Y1501</td><td>SC preparazione del brodo</td></tr></tbody></table>

quantificazione della respirazione mitocondriale in cellule intere di lievito

Mitochondrial Respiration Quantification in Yeast Whole Cells

Questa tecnica di respirazione mitocondriale può essere utilizzata per specie di lievito diverse da S. cerevisiae, come Scheffersomyces stipitis15 e K. marxianus16. Tuttavia, a scopo rappresentativo, presentiamo solo i risultati di S. cerevisiae. È noto che S. cerevisiae presenta un metabolismo respiratorio predominante a basse concentrazioni di glucosio (inferiori a 0,8 mM)17,18. Pertanto, per corroborare il fenotipo respiratorio di S. cerevisiae, è stato coltivato in due concentrazioni di glucosio per stimolare (0,5% glucosio) e limitare (5% glucosio) la respirazione mitocondriale18,19. Come previsto, i risultati ottenuti nella respirazione basale (substrato ossidabile), nella respirazione legata all'ATP (oligomicina) e nella capacità respiratoria massima (CCCP) convalidano il caratteristico metabolismo energetico di S. cerevisiae (Figura 2). Abbiamo osservato valori più elevati di consumo di ossigeno (respirazione basale, respirazione legata all'ATP e capacità respiratoria massima) nelle cellule cresciute con lo 0,5% di glucosio rispetto ai valori ottenuti nelle cellule cresciute con il 5% di glucosio (Figura 2).
Inoltre, i saggi hanno utilizzato tre substrati: glucosio, glicerolo e L-lattato. L'obiettivo dell'impiego di diversi substrati è quello di valutare diverse parti della catena respiratoria mitocondriale. In queste condizioni, la respirazione mitocondriale non ha mostrato cambiamenti significativi dipendenti dal substrato poiché non è stato aggiunto alcun trattamento per disturbare la catena respiratoria (Figura 2).
Abbiamo usato la quercetina per valutare la capacità della tecnica, un composto che influenza negativamente la respirazione mitocondriale20. I dati ottenuti hanno mostrato che la quercetina riduce significativamente la respirazione mitocondriale nelle cellule coltivate in terreni integrati con glucosio allo 0,5% (Figura 3). D'altra parte, le cellule coltivate in terreni integrati con glucosio al 5% non hanno presentato un'influenza negativa significativa della quercetina (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67186/67186fig01.jpg"> 
Figura 1: Curva rappresentativa del consumo di ossigeno. Curva del consumo di ossigeno ottenuta in cellule di S. cerevisiae coltivate in terreni SC (0,5% glucosio). I colori rappresentano le diverse pendenze ottenute al substrato, ai disaccoppiatori e all'integrazione di inibitori. Verde: il substrato utilizzava glucosio e respirazione basale corrispondente alla pendenza. Blu: oligomicina, inibitore dell'ATP sintasi, pendenza impiegata per la determinazione della respirazione legata all'ATP. Giallo: CCCP, disaccoppiatore, pendenza utilizzata per valutare la respirazione massimale. Grigio e rosso: complesso inibitore II e III, rispettivamente; Pendenza impiegata per determinare il consumo di ossigeno non dipendente dai mitocondri. Abbreviazioni: CCCP = 3-clorofenilidrazone cianuro di carbonile; TTFA = 2- tenosiltrifluoroacetone; AA = antimicina A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67186/67186fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67186/67186fig02.jpg"> 
Figura 2: Saggi di consumo di ossigeno in cellule di S. cerevisiae cresciute allo 0,5% e al 5% di glucosio. La respirazione mitocondriale viene valutata attraverso il consumo di ossigeno misurato alla respirazione basale, la capacità respiratoria massima e la respirazione legata all'ATP nelle cellule di S. cerevisiae coltivate in SC integrate con glucosio allo 0,5% e al 5%. Per valutare la loro influenza specifica sulla catena di trasporto degli elettroni sono stati utilizzati tre substrati: glucosio (NADH deidrogenasi), glicerolo (pool di ubichinone) e L-lattato (citocromo c). (A) Respirazione basale al 5% e allo 0,5% di glucosio con glucosio, glicerolo e L-lattato come substrati; (B) respirazione massimale al 5% e allo 0,5% di glucosio con glucosio, glicerolo e L-lattato come substrati; (C) Respirazione legata all'ATP al 5% e allo 0,5% di glucosio con glucosio, glicerolo e L-lattato come substrato. I risultati sono presentati come media ± S.D. da tre esperimenti indipendenti, con ogni esperimento che ha due ripetizioni tecniche. ANOVA unidirezionale seguita dal test di Tukey (p ≤ 0,05; lettere diverse: differenza significativa, stesse lettere: nessuna differenza significativa) per l'analisi statistica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67186/67186fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67186/67186fig03_.jpg"> 
Figura 3: La quercetina limita la respirazione mitocondriale a basse concentrazioni di glucosio nelle cellule di S. cerevisiae cresciute. La misurazione del consumo di ossigeno è stata eseguita alla respirazione basale, alla capacità respiratoria massima e alla respirazione legata all'ATP in cellule di S. cerevisiae coltivate in terreni SC (0,5% di glucosio) integrati con quercetina (100 μM). L'etanolo è stato utilizzato per sciogliere la soluzione di quercetina. I risultati sono presentati come media ± S.D. da tre esperimenti indipendenti, con ogni esperimento che ha due ripetizioni tecniche. Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando un test t di Student accoppiato (*, ** p ≤ 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67186/67186fig03_large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67186/67186fig04_.jpg"> 
Figura 4: La quercetina non influenza la respirazione mitocondriale in presenza di alte concentrazioni di glucosio in S. cerevisiae. Il consumo di ossigeno è stato misurato alla respirazione basale, alla capacità respiratoria massima e alla respirazione legata all'ATP in cellule di S. cerevisiae coltivate in terreni SC (5% di glucosio) integrati con quercetina (100 μM). L'etanolo viene utilizzato per sciogliere la soluzione di quercetina. I risultati mostrano una media ± S.D. da tre esperimenti indipendenti, ciascuno con due ripetizioni tecniche. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il test t di Student accoppiato (p ≤ 0,05; ns: non significativo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67186/67186fig04_large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Quantificazione della respirazione mitocondriale in cellule intere di lievito

Metabolism is mainly coordinated by cellular energy availability and environmental conditions. Assays for knowing how cells adapt energetic metabolism to ...

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