Name: Tecnica ottimizzata e semplificata per la produzione e la coltura di fette di fegato tagliate con precisione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Scopri un protocollo ottimizzato per produrre e coltivare fette di fegato tagliate con precisione (PCLS) da topi. Questo metodo garantisce la sopravvivenza delle fette per almeno quattro giorni, mantenendo l'architettura tissutale e la funzionalità metabolica.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocollo standardizzato per la coltura di fette di fegato in ambienti di laboratorio di base

<table><tbody><tr><td>Piastra di Petri da 3 cm</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td>Qualsiasi adatto per colture cellulari</td></tr><tr><td>Piastra di coltura a 6, 12, 24 pozzetti</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td>Qualsiasi Adatto per colture cellulari</td></tr><tr><td>Super colla cianoacrilato</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Gibco</td><td>A24940</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Merck</td><td>HT110316</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>ThermoFisher</td><td>26400044</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Merck</td><td>51275</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Gibco</td><td></td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>inserti 8um, per piastre a 12 pozzetti</td><td>Strastedt</td><td>83.3931.800</td><td></td></tr><tr><td>inserti 8um, per piastre a 24 pozzetti</td><td>Strastedt</td><td>83.3932.800</td><td></td></tr><tr><td>inserti 8um, per piastre a 6 pozzetti</td><td>Strastedt</td><td>83.3930.800</td><td></td></tr><tr><td>KREBS</td><td>Merck</td><td>K3753</td><td></td></tr><tr><td>Cappa a flusso laminare Hepa</td><td></td><td></td><td>filtrazione dell'aria</td></tr><tr><td>Agarosio a basso punto di fusione&nbsp;</td><td>Reagente tetrazolio ThermoFisher</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>MTS&nbsp;</td><td>Lettore</td> di piastre multipozzetto Abcam <td>ab197010</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pastiglia PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Lama per bisturi</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pinza chirurgica</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td>con punta quadrata piatta</td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratomo</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>William' s Medium E con GlutaMAX (WME)</td><td>ThermoFisher</td><td>W4125</td><td></td></tr></tbody></table>

tecnica ottimizzata e semplificata per la produzione e la coltura di fette di fegato tagliate con precisione

Optimized and Simplified Technique for the Production and Culture of Precision-Cut Liver Slices

Al momento del prelievo, la perfusione dell'animale viene volutamente omessa per garantire una rapida elaborazione dell'organo e prevenire danni agli organi. Il fegato viene estratto rapidamente dopo l'incisione e immediatamente posto in un tampone protettivo per organi ghiacciato, ad esempio il tampone Krebs24,29. Sebbene l'affettatura del tessuto epatico fresco senza inclusione sia stata precedentemente descritta1, l'inclusione del fegato nell'agarosio30 a basso punto di fusione (Figura 1) combinata con un tampone protettivo per organi consentirà condizioni di taglio ottimali sul vibratomo, riducendo il danno tissutale e aumentando la riproducibilità nello spessore della sezione. Lo spessore dei tessuti è fondamentale in quanto le sezioni sottili consentono a più strati cellulari di accedere ai nutrienti e all'ossigeno31 e riducono la morte cellulare. Tuttavia, le sezioni troppo sottili diventano difficili da tagliare in modo omogeneo. Al contrario, fette più spesse di 400 μm mostreranno un tasso di penetrazione inferiore dei nutrienti. Le sezioni sono state incubate in un'interfaccia liquido-aria utilizzando un inserto (Figura 1) e incubate con il 5% di CO2 e il 21% di O2 a 37 °C su un agitatore. Le sezioni devono essere incubate in un terreno di coltura entro 3 ore dalla raccolta, dopodiché la morte cellulare avviene rapidamente32.
Per determinare la vitalità del PCLS, la vitalità cellulare è stata valutata mediante il saggio 4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carbossimetossifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (MTS), che richiede NAD(P)H-dipendenti deidrogenasi, cioè cellule metabolicamente attive, per ridurre l'MTS. I valori di MTS sono stati normalizzati al rispettivo peso della fetta. Per ottimizzare la vitalità del PCLS, un volume minimo di terreno di coltura era essenziale per sostenere la vitalità dopo 24 ore di incubazione. Un volume di 0,7 mL in piastre a 24 pozzetti ha mostrato una significativa riduzione della vitalità mediante saggio TMS (p = 0,02) rispetto a 1,5 mL in piastre a 12 pozzetti e 2,6 mL in piastre a 6 pozzetti (Figura 2A). Questi volumi sono stati scelti per consentire una leggera copertura delle sezioni, ma potrebbero richiedere una regolazione a seconda del tipo di inserti e piastre utilizzate. Come le altrepiastre da 33 e 12 pozzetti sono utilizzate come il miglior compromesso per una sopravvivenza ottimale all'interno di un volume inferiore di terreno di coltura.
L'agitazione è essenziale e aumenta la vitalità del PCLS del 50% a 24 ore dopo l'incubazione rispetto a una coltura statica (Figura 2B). L'agitazione crea un'interfaccia aria-liquido critica, ottimizzata con l'uso di pozzetti trans, consentendo l'accesso ai nutrienti e all'ossigeno su entrambe le facce della sezione. L'assorbimento di ossigeno e sostanze nutritive è aumentato anche dal flusso costante creato dal movimento di scuotimento, che passa anche attraverso la membrana del pozzetto.
Il test MTS è stato valutato da 1 ora di incubazione fino al giorno 6 di incubazione. La vitalità cellulare è rimasta costante dal giorno 0 al giorno 4 dopo l'incubazione prima di osservare una diminuzione significativa (p = 0,05) al giorno 6 (Figura 2C). La morfologia PCLS valutata mediante colorazione con ematossilina ed eosina (H&amp;E) non ha mostrato alcun cambiamento dei dotti biliari e dell'architettura fino a 5 giorni dopo l'incubazione (Figura 3A-D). Rispetto al giorno 0 (Figura 3A), la PCLS non ha mostrato differenze istologiche al giorno 1 (Figura 3B) e al giorno 2 (Figura 3C) dopo l'incubazione, con ipercrostia nucleare, lieve infiltrato infiammatorio, vacuolizzazione a favore di un moderato processo di morte cellulare al giorno 5 dopo l'incubazione (Figura 3D). Nel complesso, questo protocollo di coltura PCLS consente la vitalità per almeno 4 giorni, in linea con gli studi che utilizzano fette in condizioni simili31.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig01.jpg"> 
Figura 1: Schema riassuntivo del protocollo per la generazione di PCLS. Questa cifra è stata modificata da34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig02.jpg"> 
Figura 2: Il protocollo ottimizzato della coltura PCLS mostra una vitalità soddisfacente per 5 giorni. (A) Effetto della dimensione del pozzetto sulla proliferazione cellulare (n=3). (B) Effetto dello scuotimento sulla proliferazione cellulare (n=6 per condizione). (C) Saggio di proliferazione cellulare MTS da sezioni di fegato da d0 a d6 giorni di incubazione (n=5 per punto temporale). Unità arbitraria OD, normalizzata per affettare il peso fresco. Il grafico mostra la media ± SD. Test t dello studente a 2 code non accoppiato, ns = non significativo, *p&lt;0.05, **p&lt;0.01. Questa cifra è stata modificata da34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig03.jpg"> 
Figura 3: Risultati istologici. (A-D) Immagini rappresentative dell'istologia del PCLS epatico dopo la colorazione H&amp;E. Barra di scala = 100 μM. Questa cifra è stata modificata da34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Tecnica ottimizzata e semplificata per la produzione e la coltura di fette di fegato tagliate con precisione

This protocol presents a simple system for the creation and culture of Precision-cut Liver Slices (PCLS). PCLS contains all cells in an intact environment ...

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Biologia

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lesioni al fegato sono accompagnate da espansione di cellule progenitrici che rappresenta una popolazione cellulare eterogenea. Classificazione Novel di questo compartimento cellulare consente di distintivo più sottoinsiemi. Il metodo qui descritto illustra l'analisi citofluorimetrica ed elevato isolamento purezza vari sottogruppi che possono essere utilizzati per ulteriori analisi.

L&#39;isolamento e arricchimento di fegato progenitrici sottoinsiemi identificati da un marcatore combinazione romanzo di superficie

Questo protocollo fornisce un metodo semplice e affidabile per la produzione di fette di fegato tagliate di precisione dai topi. I campioni di tessuto ex vivo possono essere mantenuti in condizioni di coltura dei tessuti di laboratorio per più giorni, fornendo un modello flessibile per esaminare la patobiologia epatica.

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Tecnica ottimizzata e semplificata per la produzione e la coltura di fette di fegato tagliate con precisione

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