Tecnica ottimizzata e semplificata per la produzione e la coltura di fette di fegato tagliate con precisione

I protocolli per la produzione e la coltura di fette di fegato tagliate con precisione, o PCLS, possono variare drasticamente. Lo svantaggio principale dei PCLS è la loro breve emivita, ma qui dimostriamo che la produzione e la coltura di PCLS possono essere ottenute in condizioni di laboratorio standard con accesso al vibratomo garantendo al contempo un'emivita di almeno quattro giorni. PCLS, un modello interessante che colma le lacune tra i modelli in vitro e in vivo, ma sono spesso trascurati a causa della loro emivita relativamente breve. Tuttavia, contengono tutti i tipi di cellule e un'architettura conservata, essenziale per la sommatoria metabolica, e quindi assomigliano a un mini modello dell'intero organo, consentendo lo studio e il trattamento di tessuti vivi mentre replicano i loro fenotipi complessi. Le fette continue sono un processo molto semplice ma tecnicamente impegnativo. Per facilitare questo, il nostro protocollo si concentra su passaggi chiave, come l'orientamento del taglio e l'inclusione del tessuto, ma anche l'importanza di un volume di mini modello per la coltura e di un sistema dinamico per aumentare la loro emivita.

[Narratore] Prima del raccolto, preparare un litro di tampone Krebs-Henseleit, un vassoio di Vibratomo disinfettato e raffreddato, lame di Vibratomo autoclavate e agarosio a basso punto di fusione al 4%. Il giorno della raccolta, conservare l'agarosio sciolto a bagnomaria a 37 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Quindi, preparare le piastre di coltura aggiungendo 2,6, 1,5 e 0,7 millilitri di terreno completo per pozzetto rispettivamente in piastre a sei, 12 e 24 pozzetti. Inserire inserti porosi da otto micrometri in ogni pozzetto. Metti le piastre in un'incubatrice umidificata impostata a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e il 21% di ossigeno. Sterilizzare tutti gli strumenti necessari per la raccolta utilizzando metodi di sterilizzazione appropriati. Spruzzare l'addome del topo soppresso con etanolo al 70% per disinfettare l'area. Usando pinze e forbici sterili, taglia la pelle e il peritoneo dal centro dell'addome per aprire la cavità addominale. Sezionare delicatamente il fegato dagli organi o dai vasi circostanti evitando danni ai lobi. Quindi, conservare immediatamente l'intero fegato nel tampone Krebs ghiacciato. Usando una pinza smussata e un coltello o forbici affilati e sterili, separa ogni lobo individualmente per evitare di danneggiare i lobi durante la separazione. Usando un coltello affilato e sterile, taglia tutti i bordi del lobo scelto per creare bordi dritti e maneggevoli per l'incorporamento. Successivamente, versare l'agarosio a basso punto di fusione al 4% in una capsula di Petri di tre centimetri posta su ghiaccio umido per raffreddare uniformemente ed evitare che il lobo affondi. Lasciare raffreddare l'agarosio per altri 30 secondi e posizionare il lobo tagliato al centro dell'agarosio, lasciandolo depositare al centro del blocco. Quindi, tagliare i bordi esterni del blocco di agarosio e rimuovere il blocco di agarosio dal piatto. Assicurarsi che il lato superiore e il lato incollato alla piattaforma del vibratomo siano paralleli al bordo superiore del lobo. Inizia impostando il vibratomo per tagliare a uno spessore di 250 micrometri con una velocità di cinque e una frequenza di sette hertz. Dopo aver sterilizzato il Vibratomo e posizionato il vassoio sul Vibratomo, circondarlo con ghiaccio per mantenere l'ambiente freddo. Impostare le lame a un angolo di 10 gradi verso il basso rispetto al piano orizzontale. Quindi, riempi il serbatoio del Vibratome con un tampone Krebs ghiacciato. Applicare un sottile strato di colla cianoacrilica sulla piattaforma per prepararla al montaggio del blocco di agarosio. Successivamente, asciugare il bordo del blocco di agarosio che verrà incollato sulla piattaforma utilizzando un panno assorbente sterile. Ora, posiziona il blocco di agarosio sulla piattaforma rimovibile del Vibratome. Posizionare il lobo del fegato in posizione verticale per consentire tagli trasversali, il che riduce la pressione sul lobo e facilita un taglio più fluido. Attendere un minuto che la colla si solidifichi e immergere la piattaforma nel serbatoio del vibratomo, assicurandosi che il blocco di agarosio sia completamente coperto con tampone Krebs. Per programmare il Vibratomo per il taglio, impostare le posizioni di avvio e di arresto. Quindi, inizia a tagliare le fette fino a raggiungere il lobo del fegato. Usa una spatola per raccogliere le fette di fegato, in quanto ciò evita danni, a differenza delle pinze o delle spazzole. Raccogli le fette nel tampone Krebs ghiacciato fino a quando non sono pronte per la coltura. Usando una spatola, trasferire le fette di fegato nei pozzetti preparati contenenti terreni e inserti. Quindi, posizionare le piastre su un agitatore orbitale impostato a 130 giri/min e incubarle in un incubatore per colture cellulari convenzionale a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e il 21% di ossigeno.