Name: Misurazione del dolore allarticolazione temporo-mandibolare mediante forza del morso e saggi del filamento di Von Frey nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-13T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Impara a misurare il dolore all'articolazione temporo-mandibolare nei topi mediante forza del morso e saggi del filamento di Von Frey. Questo metodo standardizzato consente di valutare i meccanismi del dolore infiammatorio.

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Ringraziamo i colleghi del laboratorio Chen per le discussioni stimolanti. Apprezziamo il supporto di Thach-Vu Ho per l'aiuto con le immagini del mouse. Questo studio è stato supportato da una sovvenzione R01DE033511 (J.C.) del National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR).

Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) della University of Southern California. In questo studio sono stati utilizzati topi femmina C57BL/6 di otto settimane con peso corporeo compreso tra 19 e 20 g. I topi sono stati alloggiati in gabbie standard in condizioni ambientali con umidità regolata e cicli luce/buio di 12 ore. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Iniezione intra-articolare di CFA per indurre TMJOA
<ol>
	<li>Anestetizzare i topi con isoflurano utilizzando isoflurano al 3% per induzione e 1%-2% per il mantenimento (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Utilizzare una cono per l'intera procedura per mantenere l'anestesia. Eseguire un pizzicamento delle dita dei piedi per verificare una profondità anestesiologica sufficiente.</li>
	<li>Monitorare attentamente la respirazione dei topi per garantire il corretto stato respiratorio riducendo al minimo la loro esposizione all'anestesia. Applicare il gel per gli occhi per proteggere gli occhi durante la procedura. 
	NOTA: I topi non hanno potuto ricevere analgesia per il dolore post-chirurgico al fine di evitare effetti analgesici preventivi sullo sviluppo del dolore orofacciale e sulla misurazione del comportamento del dolore.</li>
	<li>Preparare una siringa da insulina sterile o un ago da 31 G per iniettare l'adiuvante di Freund completo (CFA) 5 mg/mL nell'ATM coprendo l'ago con una guaina in tubo di polietilene sterile, lasciando sporgere solo 2 mm della punta dell'ago, per evitare che venga inserita troppo in profondità.</li>
	<li>Rimuovere i peli e disinfettare la zona preauricolare con iodio povidone e alcol al 70% dopo l'anestesia.</li>
	<li>Identificare l'arco zigomatico palpando per localizzare il sito di iniezione dell'ATM. 
	NOTA: All'estremità posteriore dell'arco zigomatico, c'è un'area depressa a circa 2 mm davanti al condotto uditivo. Il sito di iniezione dell'ATM si trova intorno a quest'area e non dovrebbe estendersi oltre la linea immaginaria tracciata dal livello dell'occhio al condotto uditivo (Figura 1A,B).</li>
	<li>Inserire l'ago nel sito di iniezione, che si trova sotto l'estremità posteriore dell'arcata zigomatica. La punta dell'ago deve entrare in contatto con l'osso a una profondità di 2 mm (Figura 1A,E).</li>
	<li>Iniettare lentamente 10 μL di CFA nella capsula dell'ATM e attendere almeno 5 s prima di estrarre gradualmente l'ago. Iniettare la stessa quantità di PBS nell'ATM nei topi di controllo seguendo la stessa procedura.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 1.4-1.8 e iniettare CFA nell'ATM opposto. Osserva i topi sul termoforo fino a quando non si sono completamente ripresi. 
	NOTA: Il CFA è un'emulsione acqua-in-olio relativamente viscosa, pertanto l'iniezione di CFA e il ritiro dell'ago devono essere lenti per evitare perdite di CFA durante l'iniezione. Per garantire la precisione dell'iniezione, esercitarsi con l'iniezione somministrando 5 μL di colorante verde veloce seguito dalla dissezione del muscolo massetere per esaminare l'accuratezza dell'iniezione (Figura 1D,E). Dopo l'iniezione, il colorante verde veloce si diffonde rapidamente, rendendo necessaria una riduzione della quantità utilizzata. Questa riduzione non solo migliora la precisione dell'iniezione, ma previene anche la diffusione indesiderata nelle aree vicine. La quantità e la concentrazione di CFA somministrate per indurre TMJOA nei topi sono state determinate in base al protocollo stabilito in studi precedenti16,17.</li>
</ol>
2. Misurazione della forza del morso
<ol>
	<li>Acclimatare i topi all'ambiente di test posizionando il tubo progettato per trattenerli nella gabbia del topo per almeno 1 ora nella stanza comportamentale prima del test.</li>
	<li>Registrare la misurazione di base della forza del morso prima di iniziare a indurre l'infiammazione. Addestrare i topi a mordere all'interno dell'ambiente di test per 3 giorni prima dell'iniezione di CFA o PBS. Registrare i valori medi come valori di allenamento di base.</li>
	<li>Attivare il software compatibile per misurare la forza del morso utilizzando un trasduttore di forza del morso collegato al programma sul computer (Figura 2A,B).
	<ol>
		<li>Aprire il programma NBIT RSD-V2.6.3 per visualizzare l'oscillografo (Figura 2C).</li>
		<li>Selezionare le opzioni di comunicazione appropriate come segue: Modalità assistita: UDP (Figura 2E). Selezionare l'IP locale appropriato e cercare l'IP e la porta del dispositivo facendo clic su Cerca. Verranno visualizzati l'IP di destinazione e la porta di destinazione, quindi fare clic su Apri.</li>
		<li>Impostare l'asse Y facendo clic su 10 nell'intervallo Y. Quindi fare clic su Set (Figura 2F) . Fare clic su Acquisizione.</li>
		<li>Selezionare solo il canale 1 (Ch1) per il grafico blu e disattivare gli altri canali che non sono collegati al dispositivo (Figura 2D).</li>
		<li>Fare clic su Riproduci per avviare la registrazione della forza del morso (Figura 2F). 
		NOTA: Prima di fare clic su "Riproduci" per avviare la registrazione, il mouse deve essere già all'interno della siringa e pronto a registrare la forza del morso per ottenere un tempo di registrazione accurato.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Metti il mouse in una provetta di plastica da 50 mL, che è stata modificata per trattenere liberamente il mouse. Un'ampia apertura su un lato è progettata specificamente per consentire alla testa del mouse di muoversi comodamente.</li>
	<li>Spostare la piastra del morso verso la bocca. 
	NOTA: I topi inizieranno automaticamente a mordere una volta che la piastra del morso toccherà la loro bocca. Tuttavia, potrebbero essere necessari circa 30 secondi prima che i topi inizino a mordere nel primo addestramento. Dopo l'allenamento, i topi dovrebbero iniziare a mordere entro 10 s. Se i topi non iniziano a mordere entro 10 secondi dal terzo giorno di addestramento, saranno esclusi dall'esperimento. Pertanto, è importante addestrare i topi a familiarizzare con l'ambiente di test.</li>
	<li>Registrare il morso volontario per 2 minuti/sessione. Quindi, fai clic su Pausa per interrompere la registrazione e fai clic su Salva (Figura 2E). I risultati della registrazione della forza del morso verranno automaticamente esportati in un file Excel (File supplementare 1). 
	NOTA: Nel file Excel (File supplementare 1), i dati nella colonna di sinistra rappresentano il tempo di registrazione. La seconda colonna da sinistra è l'ampiezza della forza del morso in ogni punto temporale.</li>
	<li>Classificare i dati nella seconda colonna del file Excel dal massimo al minimo. Seleziona i primi cinque dell'ampiezza della forza del morso per ulteriori analisi. 
	NOTA: Le prime cinque ampiezze devono essere in punti temporali diversi, ad esempio ogni 20 s o 1000 del tempo di registrazione, per evitare di selezionare i dati dallo stesso evento di morso.</li>
	<li>Registrare il valore di Ch1 (Figura 2D) dal programma e sottrarre o aggiungere ai primi cinque valori dell'ampiezza della forza del morso per ottenere i valori relativi della forza del morso da questo test. Quindi, prendi una media di questi cinque valori per ottenere la forza del morso relativa media per un topo.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 2.3.5-2.8 per registrare la forza del morso per i topi successivi. 
	NOTA: Per valutare la forza del morso nella progressione del dolore all'ATM, i valori della forza del morso relativa vengono registrati durante l'allenamento di base e misurati in diversi punti temporali (come il giorno 1, 3, 5, 7e giorno 12) dopo l'iniezione di CFA.</li>
</ol>
3. Misurazione della soglia di prelievo della testa
<ol>
	<li>Metti una gabbia di rete metallica nella gabbia del topo e abitua i topi in una stanza comportamentale per almeno 1 ora prima delle procedure di test.</li>
	<li>Addestrare i topi all'interno dell'ambiente di test e registrare la soglia di astinenza della testa di base per 3 giorni prima dell'iniezione di CFA o PBS.</li>
	<li>Accendere la macchina di prova elettronica von Frey per misurare la soglia di estrazione della testa (Figura 3A,B).
	<ol>
		<li>Premere MAX e quindi impostare l'unità su 500 g, che è un'unità arbitraria impostata dalla macchina.</li>
		<li>Impostare zero per avviare la registrazione. Il valore della forza sullo schermo dovrebbe essere pari a zero (Figura 3C,D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Metti i topi nella gabbia di rete metallica (Figura 3B). Applicare il filamento von Frey perpendicolarmente all'area dell'ATM. 
	NOTA: L'area del test si trova a livello della connessione tra gli occhi e il condotto uditivo, a circa 2 mm davanti al condotto uditivo. La soglia di ritiro della testa è definita come la forza minima del filamento di von Frey, che può suscitare un riflesso di ritiro.</li>
	<li>Registra il valore della forza applicata dal filamento o l'intensità dello stimolo (g) che innesca le reazioni come primo test (Figura 3E).</li>
	<li>Impostare il valore della forza sullo schermo su Zero e attendere 10 s mentre il mouse è ancora all'interno della gabbia.</li>
	<li>Inizia ad applicare nuovamente il filamento e registra il valore.</li>
	<li>Ripetere la misurazione (passaggi 3.5-3.7) e registrare almeno cinque test per ciascun topo a un intervallo di 10 s.</li>
	<li>Prendi una media di questi cinque valori. Il valore medio è considerato come la soglia di prelievo della testa da un topo. 
	NOTA: La misurazione del filamento Von Frey verrà eseguita 5 volte per un topo. Se c'è una variazione robusta, la misurazione può essere ripetuta fino a 8 volte senza lesioni notevoli. La forza del morso o il test di von Frey possono iniziare per primi. Non vi è alcuna differenza significativa in termini di quale test inizia per primo in base alla nostra esperienza. Tuttavia, dovrebbe essere coerente durante l'intero esperimento. L'intervallo di tempo tra la forza del morso e von Frey è di almeno 30 minuti. Dopo il primo test, i topi sono stati rimessi nella gabbia. Lasciarli riposare per 30 minuti e iniziare il secondo test.</li>
</ol>

Inflammatory TMJ Pain Mouse Model: Bite Force and Von Frey Filament Assessments

<ol><li>Han, M. D., Lieblich, S. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHan%2C+MD+%22Peterson%27s+principles+of+oral+and+maxillofacial+surgery%22">Peterson's principles of oral and maxillofacial surgery</a>. Miloro, M., Ghali, G. E., Larsen, P. E., Waite, P. , Springer International Publishing. Cham. 1535-1550 (2022).</li>
<li>Ferrillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pain+management+and+rehabilitation+for+central+sensitization+in+temporomandibular+disorders%3A+A+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Pain management and rehabilitation for central sensitization in temporomandibular disorders: A comprehensive review.</a> Int J Mol Sci. 23 (20), 12164(2022).</li>
<li>Schiffman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+criteria+for+temporomandibular+disorders+%28DC%2FTMD%29+for+clinical+and+research+applications%3A+Recommendations+of+the+international+RDC%2FTMD+consortium+network+and+orofacial+pain+special+interest+group%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oral+Facial+Pain+Headache%22%5BJournal%5D)">Diagnostic criteria for temporomandibular disorders (DC/TMD) for clinical and research applications: Recommendations of the international RDC/TMD consortium network and orofacial pain special interest group.</a> J Oral Facial Pain Headache. 28 (1), 6-27 (2014).</li>
<li>Kalladka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporomandibular+joint+osteoarthritis%3A+Diagnosis+and+long-term+conservative+management%3A+A+topic+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Indian+Prosthodont+Soc%22%5BJournal%5D)">Temporomandibular joint osteoarthritis: Diagnosis and long-term conservative management: A topic review.</a> J Indian Prosthodont Soc. 14 (1), 6-15 (2014).</li>
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<li>Kogawa, E. M., Calderon, P. S., Lauris, J. R., Araujo, C. R., Conti, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+maximal+bite+force+in+temporomandibular+disorders+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oral+Rehabil%22%5BJournal%5D)">Evaluation of maximal bite force in temporomandibular disorders patients.</a> J Oral Rehabil. 33 (8), 559-565 (2006).</li>
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<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+and+central+substance+p+expression+in+rat+cfa-induced+TMJ+synovitis+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pain%22%5BJournal%5D)">Peripheral and central substance p expression in rat cfa-induced TMJ synovitis pain.</a> Mol Pain. 15, 1744806919866340(2019).</li>
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<li>Ohrbach, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+orofacial+characteristics+associated+with+risk+of+first-onset+TMD%3A+The+oppera+prospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pain%22%5BJournal%5D)">Clinical orofacial characteristics associated with risk of first-onset TMD: The oppera prospective cohort study.</a> J Pain. 14 (12 Suppl), T33-T50 (2013).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano che non ci sono interessi finanziari concorrenti che potrebbero essere percepiti come influenzanti l'obiettività di questi studi.

Un TMJOA indotto da infiammazione nei topi funge da modello animale per studiare i meccanismi del dolore in TMJOA poiché l'iniezione intra-articolare di CFA può indurre dolore e infiammazione, con conseguente sinovite, perdita ossea e rimodellamento della cartilagine. Queste condizioni assomigliano in una certa misura alla patologia osservata nell'uomo e contribuiscono alle principali caratteristiche della TMJOA, come il dolore articolare e l'infiammazione nei pazienti13,18. I sintomi dolorosi associati alla TMJOA sono il motivo principale per cui i pazienti cercano assistenza medica. Essere in grado di rilevare la presenza e la gravità del dolore nei modelli animali offre l'opportunità di studiare la patogenesi del dolore e potenziali nuovi trattamenti. Questo rapporto ha descritto il metodo per valutare il comportamento del dolore dell'ATM attraverso misurazioni della forza del morso e della soglia di ritiro della testa. L'ATM è una delle strutture chiave coinvolte in tutti i movimenti della mascella, tra cui l'apertura-chiusura della bocca, il morso e la masticazione. Inoltre, la manifestazione clinica dominante dell'ATM è il dolore associato alla masticazione o alla masticazione. I pazienti con TMD con dolore all'ATM hanno in genere una forza del morso ridotta rispetto agli individui sani 9,19. Coerentemente con gli studi clinici, l'iniezione intra-articolare di CFA in modelli murini può portare a una significativa diminuzione della forza del morso che potrebbe essere considerata equivalente ai sintomi correlati al dolore e alla disfunzione dell'ATM nell'uomo11.
La diagnosi clinica del dolore all'ATM prevede la palpazione dell'ATM e la registrazione della gravità del dolore in base al referto del paziente. Questa procedura è simile al test del filamento von Frey, che misura la forza di soglia più bassa che porta al comportamento di estrazione della testa. Il ritiro della testa indica una risposta al dolore e uno stato di iperalgesia della regione orofacciale20. Una soglia di ritiro della testa ridotta può indicare dolorabilità articolare e una soglia del dolore da pressione più bassa nei pazienti con dolore all'ATM 18,19,21. Di conseguenza, il test del filamento von Frey è utile per valutare la soglia del dolore da pressione per TMD. Nel modello murino TMJOA indotto da CFA, la misurazione della forza del morso e della soglia di ritiro della testa è stata convalidata come metodo affidabile per valutare il comportamento del dolore22.
La maggior parte dei risultati comportamentali sono in qualche modo soggettivi. Come molti altri test comportamentali, la variazione è sempre una preoccupazione quando si misura il dolore orofacciale. Per raggiungere l'obiettivo di misurazioni affidabili, riproducibili e sensibili del dolore dell'ATM, è importante notare i limiti e le potenziali soluzioni nella nostra progettazione sperimentale, esecuzione e interpretazione dei risultati. Un avvertimento è che la riduzione della forza del morso potrebbe essere causata da una disfunzione dell'ATM che non è necessaria per il dolore articolare. Ad esempio, i muscoli svolgono un ruolo cruciale nel movimento dell'ATM e nel mordere. La riduzione della forza del morso potrebbe essere dovuta a una disfunzione muscolare piuttosto che a dolori articolari. Tuttavia, i risultati radiografici e istologici possono essere utilizzati per differenziare il dolore dell'ATM indotto da CFA dal dolore muscolare. Il dolore all'ATM dovuto all'iniezione di CFA porterà successivamente alla perdita di cartilagine e osso, mentre il dolore muscolare indotto da CFA ha meno probabilità di causare perdita ossea16.
Va notato che questo studio ha utilizzato l'elettronica von Frey per misurare la soglia di ritiro della testa su una scala continua, che può ridurre al minimo il numero di applicazioni di forza e quindi prevenire lesioni alla pelle del viso nell'area di prova23. È stato riportato che ci sono notevoli differenze nei valori di soglia di prelievo ottenuti da von Frey manuale ed elettronico. Tipicamente, la soglia di prelievo misurata con von Frey elettronico tende ad essere superiore a quella misurata con von Frey manuale 8,10. La punta in plastica del nostro von Frey elettronico non è affilata per evitare lesioni alla pelle del viso, che potrebbero portare a valori diversi dai filamenti von Frey manuali. Inoltre, l'unità "g" nel test elettronico di von Frey non è una forza effettiva, ma un'unità arbitraria impostata dalla macchina. Inoltre, per ridurre al minimo il dolore cutaneo, i peli sono stati rimossi dal sito di iniezione prima di iniziare l'allenamento di base. Questo approccio dovrebbe ridurre i fattori confondenti del dolore e della sensibilità cutanea e prevenire la potenziale contaminazione da infezione. Nel frattempo, il PBS è stato iniettato anche nel gruppo sham con la stessa procedura per escludere al massimo gli effetti confondenti del dolore cutaneo e per garantire che la misurazione provenga dal dolore articolare. Sebbene l'iniezione intra-articolare di CFA sia specifica per l'area dell'ATM, l'infiammazione tissutale indotta da CFA probabilmente non è limitata all'articolazione stessa, il che potenzialmente contribuisce ad una certa risposta al dolore, tra cui la riduzione della forza del morso e la diminuzione della soglia di ritiro della testa. Nel complesso, riconosciamo che non possiamo escludere completamente l'effetto secondario del dolore cutaneo o muscolare derivato dall'infiammazione dell'ATM, che potrebbe contribuire al risultato complessivo.
I valori della forza di morso e della soglia di prelievo della testa ottenuti da ciascuno strumento potrebbero essere diversi poiché hanno unità, parametri e protocolli diversi che sono specificamente impostati per i singoli saggi. Sebbene in questo studio siano stati utilizzati topi femmine, i maschi possono essere utilizzati anche per studiare la TMJOA dolorosa. Tuttavia, esiste un dimorfismo sessuale nelle soglie nocicettive basali dei roditori. Maschi e femmine hanno mostrato varie esperienze di dolore, che possono essere caratterizzate da risposte fisiologiche e comportamentali distinte a stimoli dolorosi 24,25,26. Inoltre, i topi maschi tendono ad avere una soglia di ritiro della testa e una forza del morso più elevate rispetto alle femmine. Anche l'età e il peso corporeo influenzano i valori della forza del morso 11,16,27. Uno studio precedente ha riportato che c'era una correlazione positiva tra la forza del morso e il peso corporeo durante le prime due settimane di osservazione11. I valori della forza del morso per le femmine di topo C57BL/6 a 8 settimane di età al basale in questo studio variavano da 4,5 a 5,5 N (Figura 4A). Dopo l'iniezione di CFA, la riduzione della forza del morso a 2-3 N nella fase iniziale è coerente con gli studi precedenti che prevedevano l'induzione di TMJOA utilizzando la sostanza infiammatoria MIA6. Tuttavia, l'utilizzo della variazione percentuale della forza del morso può servire come mezzo per convalidare la coerenza dei risultati con altri studi precedenti poiché ogni laboratorio potrebbe avere strumenti e protocolli diversi, con conseguenti valori diversi27,28.
Per ridurre la variazione nella misurazione del comportamento del dolore, il passaggio critico consiste nel convalidare e garantire la coerenza nell'addestramento dei topi al basale. La variazione può derivare da differenze di sesso, peso corporeo ed età, che possono influenzare le misurazioni della forza del morso e della soglia di ritiro della testa. Ad esempio, i topi femmina di 8 settimane pesano in genere circa 19-20 g; I valori relativi della forza del morso di solito rientrano nell'intervallo di 4,5-5,5 N in base ai dati dell'allenamento di base. Pertanto, i topi con valori medi di forza del morso al di fuori degli intervalli di allenamento di base dovrebbero essere esclusi dall'esperimento. Allo stesso modo, la soglia di ritiro della testa durante l'allenamento di base varia tra 22 e 35 g. I topi con una soglia di ritiro della testa al di fuori di questo intervallo dovrebbero essere esclusi dall'esperimento. Nel complesso, è importante stabilire il punto di riferimento della forza del morso e della soglia di ritiro della testa durante l'addestramento degli animali prima dei test comportamentali formali.

I disturbi temporo-mandibolari (TMD) si riferiscono al dolore e alla disfunzione delle strutture muscoloscheletriche e neuromuscolari che colpiscono le articolazioni temporo-mandibolari (ATM), i muscoli masticatori e le strutture associate. L'ATM è l'articolazione sinoviale più frequentemente utilizzata nella vita quotidiana. Circa l'80% dei pazienti con TMD mostra segni e sintomi di malattie dell'ATM, che possono avere un impatto significativo sulla loro qualità di vita1,2,3. Inoltre, l'osteoartrite dell'ATM (TMJOA) è un importante sottotipo di TMD ed è definita come una malattia degenerativa progressiva delle articolazioni. I pazienti con TMJOA presentano spesso dolore articolare. L'ATM dolorosa è uno dei motivi principali per cui i pazienti cercano un trattamento4,5. Tuttavia, esiste un bisogno medico insoddisfatto di trattamenti più efficaci per alleviare la dolorosa TMJOA. La comprensione del TMJOA doloroso è fondamentale per lo sviluppo di farmaci per l'OA modificante la malattia (DMOAD).
Poiché ottenere campioni clinici da pazienti con dolore TMJOA è difficile, i modelli animali sono diventati strumenti essenziali per studiare le patologie TMJOA6,7. L'integrazione della valutazione del comportamento del dolore può fornire preziose informazioni sui suoi meccanismi sottostanti e sui potenziali nuovi interventi terapeutici. La misurazione del dolore nei modelli animali è impegnativa a causa della natura soggettiva della percezione e dell'espressione del dolore nei soggetti non umani6,8. Relativamente pochi studi hanno utilizzato saggi comportamentali del dolore nell'ATM rispetto alle articolazioni non craniofacciali. Pertanto, è importante definire metodi per valutare il comportamento del dolore per catturare in modo affidabile l'esperienza del dolore nei modelli animali di TMJOA.
In questo articolo, abbiamo illustrato due metodi distinti progettati per valutare il dolore nei modelli murini di TMJOA: la misurazione della forza del morso e il test del filamento di von Frey. La coordinazione della mascella e dei muscoli è essenziale per la funzione masticatoria e il dolore associato all'ATM e alla funzione muscolare può ridurre la forza del morso nei pazienti con TMD3,9. Pertanto, il comportamento correlato al dolore secondario alla funzione masticatoria può essere valutato utilizzando la misurazione della forza del morso, che riflette efficacemente la funzione dell'ATM correlata al dolore articolare. Inoltre, il test del filamento von Frey misura la soglia di ritiro della testa per valutare la sensibilità meccanica. In questo metodo, i filamenti di von Frey con forza crescente vengono applicati sulla pelle dei topi fino a quando non si osserva una risposta di ritiro. La forza che innesca la risposta di estrazione della testa viene registrata come soglia di estrazione della testa. Questa tecnica è ampiamente utilizzata per valutare l'allodinia meccanica, indicando la sensibilizzazione periferica dei nocicettori associata al dolore orofacciale8,10,11.
Sebbene studi precedenti abbiano utilizzato questi metodi per misurare il comportamento del dolore, nessuno ha fornito protocolli dettagliati per l'implementazione diretta o combinato questi metodi per valutare il dolore dell'ATM indotto dall'iniezione intra-articolare di CFA12,13,14,15. Pertanto, questi metodi sono sviluppati e convalidati per dimostrare la loro sensibilità e riproducibilità nella misurazione della gravità e della progressione del dolore. Questi due approcci complementari forniscono una convalida incrociata per la valutazione del comportamento del dolore. È importante sottolineare che gli esiti comportamentali del dolore di queste tecniche possono essere correlati con le caratteristiche istologiche e patologiche nei topi TMJOA dolorosi14,16. Inoltre, la misurazione della forza del morso fornisce dati preziosi per valutare la funzione della mascella, mentre il test di von Frey misura la nocicezione meccanica8. Pertanto, questi protocolli possono essere applicati per valutare il comportamento del dolore in varie condizioni di dolore orofacciale, tra cui dolore odontogeno, dolore all'ATM, dolore muscolare e dolore neuropatico.

<table><tbody><tr><td>Trasduttore di forza del morso&nbsp;</td><td>Nanjing Shen-yuan-sheng Tecnologia intelligente Co</td><td>NBIT-YFM-1-100</td><td>0&ndash; 100 N, un trasduttore di forza del morso collegato al programma NB IT RSD-V2.6.3 (NST2000 raccoglitore di dati) da Nanjing Shen-yuan-sheng Intelligent Technology Co., PR. Cina&nbsp;</td></tr><tr><td>Coadiuvante completo di Freund (CFA)</td><td>Chondrex Inc</td><td>7023</td><td>CFA 5mg/mL</td></tr><tr><td>Isofluorano</td><td>Fluoriso</td><td>MWI501017</td><td></td></tr><tr><td>programma NBIT RSD-V2.6.3</td><td>Nanjing Shen-yuan-sheng Intelligent Technology Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo in polietilene</td><td>Scientific Commodities Inc</td><td>NC0923369</td><td>Tubo in PE 0,38 x 1,09 mm 100 Ft</td></tr><tr><td>Analgesiometro Von Frey</td><td>Bioseb</td><td>BIO-EVF4</td><td>elettrico Von Frey</td></tr></tbody></table>

misurazione del dolore all'articolazione temporo-mandibolare mediante forza del morso e saggi del filamento di von frey nei topi

Temporomandibular Joint Pain Measurement by Bite Force and Von Frey Filament Assays in Mice

Il dolore all'articolazione temporo-mandibolare (ATM) e l'osteoartrite (OA) sono disturbi comuni e debilitanti che compromettono la qualità della vita dei pazienti. I meccanismi che guidano il dolore correlato alle malattie sono poco conosciuti e i trattamenti attuali non riescono a fornire effetti terapeutici efficaci ea lungo termine. Inoltre, la valutazione del dolore nella ricerca, in particolare il dolore orofacciale, pone diverse sfide che complicano gli studi sia in ambito clinico che scientifico di base. Pertanto, abbiamo stabilito un modello murino di dolore infiammatorio dell'ATM tramite iniezione intra-articolare di CFA (Complete Freund's Adjuvant) e valutato i comportamenti del dolore mediante la misurazione della forza del morso e il test del filamento di von Frey. I topi con iniezione di CFA hanno mostrato comportamenti di dolore orofacciale rispetto all'iniezione di PBS, tra cui una riduzione della forza del morso e della soglia di ritiro della testa nel test del filamento di von Frey. Questi metodi sono relativamente facili da eseguire per avere risultati riproducibili e possono essere potenzialmente estesi agli studi sul dolore per altri modelli di malattia correlati ai disturbi dell'ATM. Insieme, la forza del morso e i test del filamento di von Frey sono affidabili nella misurazione del dolore orofacciale, come dimostrato nei modelli murini di TMJOA dolorosi indotti dall'iniezione di CFA.

Il dolore da OA-TMJ indotto da infiammazione viene provocato iniettando CFA nell'ATM. Poiché l'ATM sinistro e destro devono coordinarsi durante il movimento della mandibola, CFA viene iniettato in entrambe le articolazioni per valutare il dolore all'ATM. Il gruppo sham riceverà iniezioni di PBS come controllo. La media ± SEM e il t-test di Student vengono utilizzati per analizzare statisticamente le differenze nel comportamento doloroso tra i gruppi CFA e sham.
Le misurazioni della forza del morso e della soglia di ritrazione della testa vengono utilizzate per verificare se i topi provano dolore all'articolazione temporo-mandibolare (ATM). I topi trattati con CFA hanno mostrato riduzioni significative sia nei livelli di forza del morso sia nella soglia di ritrazione della testa al primo giorno successivo all'iniezione di CFA rispetto ai livelli basali, con aumenti graduali osservati in successivi punti temporali. Al contrario, il gruppo di controllo iniettato con PBS non ha mostrato variazioni significative nella forza del morso né nelle risposte ai test con filamenti von Frey rispetto all'addestramento basale (Figura 4A-D). Questi risultati suggeriscono che i topi sottoposti a iniezioni di CFA hanno provato dolore all'ATM con allodinia meccanica e compromissione della funzione masticatoria.
<img alt="Diagrams di dissezione del cranio di ratto; arco zigomatico, muscolo massetere, condotto uditivo; studio anatomico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67203/67203fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Iniezione intra-articolare nell'ATM in un modello murino. (A) Il topo è stato anestetizzato con isoflurano utilizzando un cono nasale. La linea gialla indica la linea immaginaria dal livello dell'occhio al condotto uditivo. (B) Punto di repère anatomico per l'iniezione. La linea tratteggiata nera indica l'arco zigomatico, palpabile attraverso la cute. L'area depressa corrispondente al sito di iniezione è indicata con un segno rosso. (C) La testa del condilo dell'ATM è visibile dopo la rimozione del muscolo massetere. (D,E) È stato iniettato un colorante verde brillante per evidenziare la testa del condilo dell'ATM. Barra della scala: 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67203/67203fig01large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Impostazione della spettroscopia con interfaccia per computer, grafico dei dati del segnale e opzioni di analisi per lo studio dell'emissione." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67203/67203fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figura 2"> 
Figura 2: Registrazione della misurazione della forza del morso. (A,B) Macchina per la misurazione della forza del morso e computer per la registrazione dei dati. (C) Ampiezza della registrazione della forza del morso durante la misurazione. (D-F) Parametri nel programma per la registrazione della forza del morso. (D'-F') Ingrandimenti di ciascuna sezione dei parametri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67203/67203fig02large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Impostazione per la misurazione del dolore; filamento di Von Frey, display del dinamometro digitale; analisi dell'equilibrio statico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67203/67203fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Analgesiometro elettronico di Von Frey. (A,B) Strumenti con filamento di Von Frey. (C) Schermo visualizzato all'accensione dell'apparecchio. (D) Impostare lo strumento a zero per iniziare la registrazione. (E) Quantità di forza applicata da Von Frey per innescare la risposta di ritrazione della testa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67203/67203fig03large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Grafici dell&#x27;analisi della forza del morso e della soglia di ritrazione dopo iniezione di CFA e PBS; risultati comparativi nei diversi punti temporali." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67203/67203fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figura 4"> 
Figura 4Valutazione del comportamento legato al dolore nell'artrosi infiammatoria della TMJ indotta da CFA rispetto al gruppo controllo con PBS. (A, B) Misurazione della forza del morso e percentuale di variazione dei valori della forza del morso rispetto alla baseline.C,DMisura della soglia di ritrazione della testa mediante il test con filamenti di von Frey e variazione percentuale della soglia di ritrazione della testa rispetto al valore basale. I valori rappresentano la media ± SEM, test t di Student t-test. *p &lt; 0.05, **p &lt; 0.01, ***p &lt; 0.001, ****p &lt; 0,0001. n = 6 topi per il gruppo PBS, n = 8 topi per il gruppo CFA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67203/67203fig04large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
File Supplementare 1: Misurazione e analisi della forza del morso. La Colonna A indica il punto temporale di ciascun evento di morso, mentre la Colonna B registra l'ampiezza o il valore della forza del morso. Questa tabella presenta i dati organizzati in base al valore assoluto massimo della forza del morso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67203/Bite%20force%20measurement%20and%20analysisv2.zip" target="_blank">Cliccare qui per scaricare questo file.</a>

Questo protocollo descrive come la misurazione della forza del morso e della soglia di ritiro della testa può catturare il comportamento del dolore nel dolore infiammatorio dell'articolazione temporo-mandibolare (ATM) indotto da Complete Freund Adjuvant (CFA).

Misurazione del dolore all'articolazione temporo-mandibolare mediante forza del morso e saggi del filamento di Von Frey nei topi

Temporomandibular joint (TMJ) pain and osteoarthritis (OA) are common and debilitating disorders that impair patients' quality of life. The mechanisms ...

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