Caratterizzazione del trasferimento di elettroni extracellulari mediato nei batteri dell'acido lattico con un sistema bioelettrochimico a tre elettrodi e due camere

Nel nostro laboratorio, studiamo il trasferimento di elettroni extracellulari, o EET, in batteri come il lactiplantibacillus plantarum, che è un batterio fermentativo critico nelle industrie alimentari. Nell'EET, la cellula trasferisce elettroni a uno scettro elettronico extracellulare, come un elettrodo in un sistema chimico bioelettrico. Vogliamo comprendere e ingegnerizzare l'EET per applicazioni nel biorilevamento, nella biocatalisi e nella fermentazione alimentare.

Abbiamo scoperto che il tunnel alpino può acquistare corrente attraverso l'EET in presenza di chinone come il DHNA. Questo processo rigenera il NAD plus, accelera la perdita complessiva delle vie di fermentazione primarie e stimola la crescita cellulare. Inoltre, abbiamo scoperto che diversi derivati del chinone, oltre al DHNA, possono anche mediare l'EET in L plantarum.

Lo studio dell'EET mediato richiede configurazioni biochimiche specializzate. In particolare, utilizziamo un sistema bioelettrochimico a tre elettrodi e due camere per prevenire il cross-talking tra le reazioni anodiche e catodiche. Utilizziamo anche un campo di carbonio, un elettrodo funzionante che ha un'ampia superficie per migliorare il trasferimento di elettroni dai mediatori elettronici.

Il nostro lavoro che esplora le vie EET in L plantarum e come queste vie interagiscono con il metabolismo fermentativo potrebbe avere applicazioni utili nelle industrie alimentari. Sappiamo che l'EET e l'L plantarum alterano il flusso metabolico attraverso la fermentazione e che potrebbero essere manipolati per applicazioni utili e alterando i sapori degli alimenti e producendo preziose sostanze chimiche nell'elettrofermentazione. In futuro, continueremo ad aumentare le nostre conoscenze fondamentali sull'EET e a perseguire nuove applicazioni dell'EET in organismi come L plantarum.

Abbiamo in programma di ingegnerizzare le proteine nel percorso EET, che ci consentirà di controllare ulteriormente l'EET per applicazioni nell'elettrofermentazione e nel biorilevamento. Per iniziare, carteggiare fili di titanio pretagliati di un millimetro di diametro per la lavorazione in controelettrodi, con carta vetrata all'ossido di alluminio fino a renderli uniformemente lucidi. Usando una pinza, piega un'estremità di ciascun filo dell'elettrodo funzionante in un piccolo gancio.

Fai scorrere un tondo di feltro di carbonio di 16 centimetri quadrati su ciascun filo dell'elettrodo funzionante, intrecciando il filo dentro e fuori dal tondo di feltro di carbonio una volta e tirando il tondo lungo il filo fino a fissarlo sul gancio. Fissare gli elettrodi di lavoro nei cappucci GL 45 perforando il setto di gomma con il filo e tirandolo di alcuni centimetri. Per costruire reattori accoppiati, assemblare l'O-ring e posizionare una membrana a scambio cationico pretagliata, pre-imbevuta d'acqua nell'O-ring assemblato.

Posizionare l'O-ring con la membrana tra le grandi aperture inferiori di due flaconi di reattore accoppiati. Fissare le bottiglie di coppia del reattore e un anello con la membrana con un morsetto a snodo. Far cadere un'ancoretta magnetica in ciascuna camera anodica prima di chiudere tutte le piccole aperture nella parte superiore di ogni bottiglia con tappi GL14, dotati di setti in gomma.

Riempi ogni bottiglia del reattore con 110 millilitri di acqua deionizzata. Inserire i cappucci dotati di un elettrodo rotondo di lavoro in feltro di carbonio e premere delicatamente sulla parte superiore del tondo di feltro per tenerlo fissato al gancio. Chiudere i flaconi con l'apposito tappo GL45 montato sull'elettrodo.

Reattanze riempite d'acqua per autoclave e cappucci per elettrodi GL14. In condizioni sterili, raschiare la coltura di abasilisk plantarum lactoplant dalla parte superiore di una riserva di glicerolo e inoculare in tre millilitri di rugosa tagliente a richiesta commerciale, o terreno MRS. Incubare la coltura per una notte a 37 gradi Celsius, senza agitare.

Per iniziare, in una cappa di biosicurezza sterile, scartare l'acqua autoclavata dai reattori del sistema bioelettrochimico. Riempire le camere catodiche con 110 millilitri di terreno M9 autoclavato e le camere anodiche con 110 millilitri di MCDM appena preparato. Sostituire un tappo GL14 della camera anodica con un tappo GL14 per autoclave con un anello a soffitto in silicone.

Spruzzare gli elettrodi di riferimento preparati con etanolo al 70% prima di inserirlo attraverso il cappuccio dell'elettrodo in ciascuna camera anodica. Stringere tutti i cappucci e clamps per evitare perdite. Per collegare i reattori al sistema di pompaggio dell'acqua, posizionare innanzitutto ciascun reattore sulla piattaforma dell'ancoretta di combustione appropriata.

Quindi collegare i raccordi della camicia d'acqua di ciascun reattore al successivo con un tubo di gomma, collegando i reattori terminali ai tubi di afflusso e deflusso della pompa dell'acqua. Riempi la pompa con acqua e aggiungi da quattro a sei gocce di condizionatore d'acqua. Accendere il sistema di pompaggio e impostare la temperatura a 30 gradi Celsius.

Avviare la pompa e osservare il flusso d'acqua attraverso tutte le camicie d'acqua del reattore, confermando che non ci siano perdite. Accendere le piattaforme di agitazione e impostarle sull'agitazione continua a 220 giri/min. Per collegare i reattori alle linee del gas a risparmio di azoto, in primo luogo, collegare un filtro dell'aria a un ago calibro 22 e inserire l'ago attraverso il setto superiore di una camera anodica del reattore nel fluido.

Inserire un ago calibro 18 nel setto superiore di una camera anodica del reattore, quindi collegare la linea del gas da una fonte di azoto al filtro dell'aria e aprire la valvola per consentire al gas di gorgogliare delicatamente attraverso il reattore. Per collegare i bioreattori ai cavi del potenziostato, collegare il contatore di lavoro e i cavi a coccodrillo dell'elettrodo di riferimento dal potenziostato agli elettrodi corrispondenti. Dopo aver inserito tutti i parametri, premere il triangolo di avvio verde per iniziare la corsa.

Osservare le tracce di tensione a circuito aperto per alcuni minuti per assicurarsi che tutti i reattori leggano positivamente. e chiudere insieme con un segnale costante. In condizioni sterili, sottocoltura la coltura di L plantarum precedentemente coltivata da uno a 200 in 50 millilitri di MMRS.

Far crescere le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius, senza agitare. Per iniziare, rimuovere dall'incubatrice la coltura di L plantarum coltivata in MMRS. Trasferire la coltura in una provetta conica da 50 millilitri in condizioni sterili e posizionare la provetta sul ghiaccio.

Centrifugare la coltura a 4.000 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante prima di risospendere il pellet in 50 millilitri di PBS. Dopo il secondo lavaggio, risospendere le cellule in PBS freddo a densità ottica a 600 nanometri di 11.

Caricare due millilitri di cellule risospese in una siringa da tre millilitri, dotata di ago. Alla stazione del reattore, dechiudere una siringa cellulare e inserire l'ago nella parte superiore di una camera anodica del reattore. Una volta posizionate tutte le siringhe, premere gli stantuffi per iniettare le cellule.

Registrare il tempo di iniezione dal tracciato cronoamperometrico. Lasciare che la corrente si stabilizzi sulla traccia per due o quattro ore. Nel sistema bioelettrochimico, etichettare i reattori sperimentali come più DHNA e i reattori di controllo del solvente come meno DHNA.

Decapsulare una siringa caricata con 110 microlitri di 20 milligrammi per millilitro di DHNA e inserirla nella parte superiore della camera anodica, designata come DHNA plus. Inserire una siringa caricata con 110 microlitri di DMSO nella camera anodica, designata come meno DHNA. Utilizzando una siringa da tre millilitri dotata di un ago calibro 21, rimuovere due millilitri di terreno da ciascuna camera anodica attraverso il setto a tappo piccolo inutilizzato.

Trasferire i campioni in una piastra profonda 24 pozzetti per misurare il pH per il punto temporale dell'ora zero. Premere gli stantuffi delle siringhe DHNA e DMSO per iniettare nei reattori. Registrare il tempo di iniezione dal tracciato cronoamperometrico.

Gettare tutte le siringhe e gli aghi. Dopo 24 ore, rimuovere due millilitri di terreno da ciascuna camera anodica come descritto in precedenza e trasferirlo in una piastra profonda 24 pozzetti per misure di pH 24 ore. Eseguire la voltammetria ciclica per il punto temporale di 24 ore.

Misurare e registrare il pH per i campioni delle 24 ore di ciascun reattore. La densità di corrente dovuta al trasferimento extracellulare di elettroni ha raggiunto un picco di circa 132 microampere per centimetro quadrato, otto ore dopo l'iniezione di DHNA. Al contrario, l'iniezione di DMSO ha portato a una densità di corrente trascurabile.

I dati della voltammetria ciclica hanno mostrato un netto aumento della corrente ossidativa a 50 millivolt in presenza di L plantarum con DHNA, rispetto a L plantarum con DMSO e un aumento del 256% della densità di corrente a 300 millivolt, rispetto alla traccia abiotica di DHNA. Il trasferimento extracellulare di elettroni ha portato a un notevole calo del pH a una media di 3,33 in 24 ore nei campioni con L plantarum e DHNA, mentre i campioni con L plantarum e DMSO avevano un pH medio di 6,50.