Name: Visualizzazione in tempo reale a singola molecola dello svolgimento del DNA mediante elicasi CMG (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Scopri la visualizzazione in tempo reale dello svolgimento del DNA mediante elicasi CMG usando microscopia TIRF a singola molecola. Questo metodo rivela la dinamica della replicazione eucariotica in vitro.

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<meta charset="utf8"></head><body>Svolgimento del DNA mediato da CMG osservato dalla crescita del tratto ssDNA-RPA

<ol><li>Bell, S. P., Labib, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+Duplication+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome Duplication in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).</li>
<li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+for+MCM2-7+helicase+activation+by+GINS+and+Cdc45%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The structural basis for MCM2-7 helicase activation by GINS and Cdc45.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (4), 471-477 (2011).</li>
<li>Jones, M. L., Baris, Y., Taylor, M. R. G., Yeeles, J. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+human+replisome+shows+the+organisation+and+interactions+of+a+DNA+replication+machine%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structure of a human replisome shows the organisation and interactions of a DNA replication machine.</a> EMBO J. 40 (23), e108819(2021).</li>
<li>Moyer, S. E., Lewis, P. W., Botchan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+Cdc45%2FMcm2-7%2FGINS+%28CMG%29+complex%2C+a+candidate+for+the+eukaryotic+DNA+replication+fork+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of the Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) complex, a candidate for the eukaryotic DNA replication fork helicase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (27), 10236-10241 (2006).</li>
<li>Douglas, M. E., Ali, F. A., Costa, A., Diffley, J. F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+CMG+helicase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic CMG helicase activation.</a> Nature. 555 (7695), 265-268 (2018).</li>
<li>Ilves, I., Petojevic, T., Pesavento, J. J., Botchan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+MCM2-7+helicase+by+association+with+Cdc45+and+GINS+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of the MCM2-7 helicase by association with Cdc45 and GINS proteins.</a> Mol Cell. 37 (2), 247-258 (2010).</li>
<li>Dewar, J. M., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA+replication+termination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA replication termination.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (8), 507-516 (2017).</li>
<li>Burnham, D. R., Kose, H. B., Hoyle, R. B., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+DNA+unwinding+by+the+eukaryotic+replicative+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The mechanism of DNA unwinding by the eukaryotic replicative helicase.</a> Nat Commun. 10 (1), 2159(2019).</li>
<li>Kose, H. B., Larsen, N. B., Duxin, J. P., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+eukaryotic+replicative+helicase+at+lagging-strand+protein+barriers+support+the+steric+exclusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the eukaryotic replicative helicase at lagging-strand protein barriers support the steric exclusion model.</a> Cell Rep. 26 (8), 2113-2125.e6 (2019).</li>
<li>Kose, H. B., Xie, S., Cameron, G., Strycharska, M. S., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplex+DNA+engagement+and+RPA+oppositely+regulate+the+DNA-unwinding+rate+of+CMG+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Duplex DNA engagement and RPA oppositely regulate the DNA-unwinding rate of CMG helicase.</a> Nat Commun. 11 (1), 3713(2020).</li>
<li>Tanner, N. A., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+DNA+replication+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Visualizing DNA replication at the single-molecule level.</a> Methods Enzymol. 475, 259-278 (2010).</li>
<li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+ph+drop+in+single-molecule+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li>
<li>Baris, Y., Taylor, M. R. G., Aria, V., Yeeles, J. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+efficient+DNA+replication+with+purified+human+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fast and efficient DNA replication with purified human proteins.</a> Nature. 606, 204-210 (2022).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunability+of+DNA+polymerase+stability+during+eukaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tunability of DNA polymerase stability during eukaryotic DNA replication.</a> Mol Cell. 77 (1), 17-25.e5 (2020).</li>
<li>Li, Z., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+the+mini-chromosome+maintenance+proteins+in+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of the mini-chromosome maintenance proteins in DNA replication.</a> Genes. 10 (5), 331(2019).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+replication+origin+melting+nucleated+by+CMG+helicase+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of replication origin melting nucleated by CMG helicase assembly.</a> Nature. 606 (7916), 1007-1014 (2022).</li>
<li>Zeman, M. K., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of replication stress.</a> Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).</li>
<li>Sparks, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CMG+helicase+bypasses+DNA-protein+cross-links+to+facilitate+their+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The CMG helicase bypasses DNA-protein cross-links to facilitate their repair.</a> Cell. 176 (1-2), 167-181.e21 (2019).</li>
<li>Taylor, M. R. G., Yeeles, J. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initial+response+of+a+eukaryotic+replisome+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The initial response of a eukaryotic replisome to DNA damage.</a> Mol Cell. 70 (6), 1067-1080.e12 (2018).</li>
<li>Amunugama, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reversal+during+DNA+interstrand+crosslink+repair+requires+CMG+unloading%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Replication fork reversal during DNA interstrand crosslink repair requires CMG unloading.</a> Cell Rep. 23 (12), 3419-3428 (2018).</li>
<li>Wu, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRAIP+is+a+master+regulator+of+DNA+interstrand+crosslink+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRAIP is a master regulator of DNA interstrand crosslink repair.</a> Nature. 567 (7747), 267-272 (2019).</li>
<li>Vrtis, K. B., Dewar, J. M., Chistol, G., Wu, R. A., Graham, T. G. W., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-strand+DNA+breaks+cause+replisome+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-strand DNA breaks cause replisome disassembly.</a> Mol Cell. 81 (6), 1309-1318.e6 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione acrilammide / Bis 40%&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610148</td><td></td></tr><tr><td>Agarose UltraPure&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td>Usato per preparare Tris Buffer (pH 8)</td></tr><tr><td>&Auml; KTA Pure&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>-</td><td>Utilizzato con il Collettore di Frazioni F9-C; Sistema di purificazione proteica</td></tr><tr><td>Gel di affinità ANTI-FLAG M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>APS 10%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>ATP (200 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699-5G</td><td></td></tr><tr><td>ATP-g-s (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11162306001</td><td></td></tr><tr><td>Copertura biotina-PEG</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Preparato come descritto: https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2012.03.033</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-digossigeninico biotinilato&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Blu Tack</td><td>Bostik</td><td>N/A</td><td>Stucco adesivo</td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B/3800/53</td><td></td></tr><tr><td>BSA; 33 mg/mL</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A3858-10G</td><td>Diluito dal calcio</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>CaptoHiRes Q (5/50)</td><td>Cytiva</td><td>29275878</td><td>Collegato al sistema di purificazione delle proteine AKTA; Colonna della cromatografia a scambio ionico ad alta risoluzione</td></tr><tr><td>Caseina (5% in acqua, 50 mg/mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4765-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Sistema ChemiDoc</td><td>Bio-Rad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Clip</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tagliere</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tubi per dialisi (3,5 kDa)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11425859</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenina-11-dUTP</td><td>Roche</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>Colorante di carico di DNA 6x&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 10 mM</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Nastro a doppia faccia (spesso 0,14 mm)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fluorochem Limited</td><td>M02712-10G</td><td></td></tr><tr><td>DYKDDDDK peptide&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Sintetizzato dalla STP di biologia chimica del Francis Crick Institute</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D/0700/68</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-RPA&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Purificato come descritto in ' 'Analisi a singola molecola', Series Methods in Molecular Biology, Vol. 783 (2011), Peterman, E. J. G. e Wuite G. J. L. a cura di Humana. Informazioni sulle proteine: 2 mM, umana, espressa in E. coli.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03779-10G</td><td></td></tr><tr><td>Epossidica - 5 minuti</td><td>Devcon</td><td>20845</td><td></td></tr><tr><td>Fujifilm FLA-5000&nbsp;</td><td>Fujifilm</td><td>&nbsp; FLA-5000&nbsp;</td><td>Analizzatore di immagini fluorescenti</td></tr><tr><td>Colorazione con acidi nucleici GelRed; 10000x</td><td>Cambridge Bioscience</td><td>41003-BT</td><td>Esempio di colorazione per acidi nucleici, che rappresenta un'alternativa più sicura al bromuro di etio.</td></tr><tr><td>Slide in vetro o quarzo con fori per tubi &nbsp;</td><td>Dremel Modello 395</td><td></td><td>Slide spesso 1 mm, tagliato a 2,4 cm x 1 cm, due fori forati a 1,4 mm di distanza. I fori dovrebbero essere forati di dimensioni diverse per adattarsi a tubi differenti a ciascuna estremità.</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>G/0650/17</td><td></td></tr><tr><td>Glicina HCl, pH 3,5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Hamilton, serie 1000 GASTIGHT, blocco PTFE Luer 1010TLL, blocco Luer PTFE (con scanalature), volume 10 mL</td><td>Merck</td><td>26211-U</td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7,5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>I-CeuI</td><td>NEB</td><td>R0699L</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/4280/53</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2545</td><td></td></tr><tr><td>Kit di dialisi Maxi GeBaFlex a tube; MWCO 14 kDa&nbsp;</td><td>Generon</td><td>D055</td><td></td></tr><tr><td>Spatola metallica</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette di metallo</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP (filtri a siringa) 0.22 & micro; m&nbsp;</td><td>Merck</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Ago</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>NEB</td><td>R3189L</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4%&ndash; Geli proteici bis-tris al 12%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10247002;</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Esecuzione del buffer&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Riscaldatore obiettivo</td><td>Okolab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mix PCR - 2x</td><td></td><td></td><td>Preparato da Phusion DNA polimerasi (20 & micro; L), 10 mM dNTP (40 & micro; L), 5x Phusion HF buffer (400 & micro; L) e acqua (540 & micro; L).</td></tr><tr><td>Peptide NH2-CHHHHHHHHHHLPETGG-COOH, marcato con LD655-MAL&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>il peptide NH2-CHHHHHHHHHHLPETGG-COOH, marcato con LD655-MAL (Lumidyne Technologies) sul residuo di cisteina, è stato sintetizzato e purificato dal chimica peptidica STP del Francis Crick Institute</td></tr><tr><td>Plasmide pGC261</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.10.053</td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette di plastica</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in polietilene PE20 (diametro interno 0,015", diametro esterno 0,043")</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in polietilene PE60 (diametro interno 0,03", diametro esterno 0,048")</td><td>Becton Dickinson</td><td>427416</td><td></td></tr><tr><td>Colonne per Cromatografia Poly-Prep; 10 ml e 20 ml&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550</td><td></td></tr><tr><td>Glutammato di potassio (L-glutammico acido monoidrato di sale di potassio)</td><td>Sigma</td><td>G1501-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi (cOmplete, senza EDTA)</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Pump 11 Elite Infusione/Prelievo Programmabile Singola Siringa</td><td>Apparato di Harvard</td><td>70-4504</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione QIAquick per PCR</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Lametta di rasoio</td><td>VWR International Ltd</td><td>233-0156</td><td></td></tr><tr><td>Buffer rCutSmart; 10x</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S/2120/53</td><td></td></tr><tr><td>Sortasi (pentamutante)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Purificato basandosi su: https://doi.org/10.1073/pnas.1101046108</td></tr><tr><td>filtri a tubo centrifuga Spin-X; 0,22 & micro; Acetato di cellulosa M &nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>10310361</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi sterile</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di filtrazione usa e getta azionato a vuoto Steritop; 0,22 um; PES; &nbsp;</td><td>Millipore</td><td>S2GPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina (1 mg/mL) in 1x PBS buffer</td><td>Sigma</td><td>S4762-10MG</td><td>20 & micro; L aliquote</td></tr><tr><td>SYBR Oro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11494</td><td>Colorazione altamente sensibile per acidi nucleici che abbiamo usato per visualizzare il substrato a forca del DNA.</td></tr><tr><td>SYTOX arancione; 5 & micro; M in DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Ligasi del DNA T4</td><td>NEB</td><td>M0202M</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligasin Reaction Buffer &nbsp;</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-25ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TEV proteasi (1 mg/mL); EZCut&nbsp;</td><td>Biovision</td><td>7847-10000</td><td></td></tr><tr><td>Molatori di tessuti, tipo Dounce (40 mL, Wheaton)</td><td>DWK Scienze della Vita</td><td>432-1273</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Usato per preparare Tris Buffer (pH 8)</td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Preadolescente-20</td><td>Promega UK Ltd</td><td>H5152</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzazione in tempo reale a singola molecola dello svolgimento del dna mediante elicasi cmg

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Visualizzazione in tempo reale a singola molecola dello svolgimento del DNA mediante elicasi CMG

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

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