Name: Determinazione della stabilità sierica dellenzima adenosina deaminasi 1 umana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:25:00.000+00:00
Duration: 4 min 17 s
Description: Scopri come valutare la stabilità sierica degli enzimi per migliorare l'efficacia terapeutica dei biologici proteici nel trattamento del cancro. Questo metodo guida le strategie di ingegneria proteica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Incubazione del siero
<ol><li>Preparare una dose 10x di HsADA1 in 1x PBS pH 7,4 (1x PBS) a una concentrazione finale di 10 μM. Scongelare un'aliquota di 15 mL di siero umano aggregato e preriscaldarla a 37 °C. Preriscaldare un'aliquota da 50 mL di 1x PBS a 37 °C.</li>
	<li>Preparare le miscele di incubazione enzima-siero aggiungendo 100 μl del stock 10x HsADA1 a 900 μl di siero umano aggregato in una provetta da microcentrifuga a basso legame, denominata miscela enzima + siero. In una provetta da microcentrifuga separata a basso legame, aggiungere 100 μl del 10x HsADA1 stock a 900 μl di 1x PBS per il confronto con un controllo non sierico, indicato come miscela enzima + 1x PBS. La concentrazione finale di HsADA1 in ciascuna miscela sarà di 1 μM.</li>
	<li>Preparare un controllo aggiuntivo in una provetta da microcentrifuga a basso legame composta da 100 μl di 1x PBS miscelato con 900 μl di siero umano aggregato. Questo servirà come controllo non enzimatico per la miscela enzima + siero. Inoltre, effettuare un controllo composto da 1 ml di 1x PBS. Questo servirà come controllo non enzimatico per la miscela enzimatica + 1x PBS.</li>
	<li>Aliquotare 100 μl di ciascuna miscela dalla fase 1.2 in provette separate a basso legame e diluire 1:1 con 100 μl di glicerolo al 30% (v/v) in 1x PBS. Congelare con azoto liquido e conservare a -80 °C. Questi campioni saranno il punto temporale del Giorno 0 e la concentrazione di HsADA1 in essi sarà di 500 nM. Ripetere questo passaggio per le miscele di controllo non enzimatiche dal punto 1.3. Sigillare tutti gli enzimi e le miscele di controllo con una pellicola trasparente e metterle in un incubatore a 37 °C.</li>
	<li>Dopo 24 ore, aliquotare 100 μL di ciascun campione incubato e diluire 1:1 con 100 μL di glicerolo al 30% (v/v) in 1x PBS. Congelare con azoto liquido e conservare a -80 °C. Questi campioni saranno il punto temporale del giorno 1. Riportare tutte le miscele enzimatiche e di controllo nell'incubatore a 37 °C. Ripetere questo passaggio a 72 ore e 120 ore. NOTA: I campioni quotati in aliquote non devono necessariamente essere congelati all'istante. In alternativa, l'utente può eseguire il test basato su micropiastra immediatamente dopo il prelievo di ciascun campione, anche se ogni volta che viene testato un campione devono essere preparate nuove curve standard e stock di substrato di adenosina.</li>
</ol>2. Saggio basato su micropiastra
<ol><li>Preparare il lettore di micropiastre impostando un protocollo di lettura cinetica (Figura 2) per misurare l'assorbanza a 260 nm con l'intervallo di lettura più breve per 30 minuti e preriscaldare il lettore a un setpoint di 37 °C.</li>
	<li>Scongelare tutti i campioni raccolti sul ghiaccio. Diluire ogni campione scongelato 1:10 utilizzando 1x PBS preriscaldato a 37 °C come diluente in provette per microcentrifuga a basso legame. La nuova concentrazione di HsADA1 in questi campioni sarà di 50 nM.</li>
	<li>Effettuare una diluizione 10x in 1x PBS anche dal campione di controllo del siero non enzimatico. Inoltre, preparare un stock di adenosina da 5 mM aggiungendo 66,8 mg di adenosina a 50 mL di 1x PBS. Preparare una diluizione di 250 μM di adenosina aggiungendo 400 μL di adenosina stock a 7.600 μL di 1x PBS e preriscaldarla a 37 °C in un incubatore.</li>
	<li>A una micropiastra a 96 pozzetti compatibile con i raggi UV, aggiungere 160 μl di diluizione di adenosina da 250 μM e 40 μl di ciascun campione proteico diluito in triplicato per un volume totale di 200 μl. Ciò produrrà una concentrazione finale di adenosina di 200 μM e una concentrazione enzimatica finale di 10 nM.</li>
	<li>Ripetere la diluizione per i campioni di controllo aggiungendo 40 μl di siero diluito o 1x controlli PBS e 160 μl di diluizione di adenosina 250 μM in triplicato. Questo produrrà anche una concentrazione finale di adenosina di 200 μM ma senza enzima. NOTA: Può essere utile aggiungere prima tutti i campioni di enzima diluito e di controllo singolarmente alla micropiastra e poi aggiungere il substrato di adenosina con una micropipetta a 12 canali per ridurre il tempo di caricamento totale. Inoltre, in questa fase è necessario utilizzare piastre trasparenti ai raggi UV per evitare che la piastra stessa confonda il segnale di assorbanza misurato.</li>
	<li>Misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 260 nm per 30 minuti a 37 °C. Una volta terminato, esporta i dati in un foglio di calcolo per ulteriori analisi.</li>
</ol>3. Analisi dei dati del lettore di micropiastre
<ol><li>Determinare la pendenza della regione lineare dei dati di assorbanza in funzione del tempo per i primi minuti dei dati della micropiastra. Per i campioni diluiti con siero, questo corrispondeva ai primi ~120 s. Per i campioni diluiti con PBS 1x, questo corrispondeva ai primi ~270 s. Questa pendenza dei valori di assorbanza decrescenti avrà un valore numerico negativo e avrà unità di variazione in unità di assorbanza al secondo (ΔA260/s).</li>
	<li>Sottrarre la pendenza del controllo negativo costituito da siero umano aggregato dalla pendenza dei dati enzima + siero. Eseguire la stessa operazione sulle miscele enzimatica + 1x PBS sottraendo la pendenza del controllo 1x PBS.</li>
	<li>Normalizzare tutte le pendenze regolate alla pendenza originale a t=0 h per ottenere la frazione di attività rimanente utilizzando l'equazione 1. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67216/67216eq01.jpg" style="margin: auto;">Equazione 1</li>
	<li>Traccia la frazione di attività rimanente rispetto al tempo.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Valutazione della stabilità sierica di HsADA1: un approccio basato su micropiastre

<ol><li>Valero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum-stable+RNA+aptamer+specific+for+SARS-COV-2+neutralizes+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A serum-stable RNA aptamer specific for SARS-COV-2 neutralizes viral entry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (50), e2112942118(2021).</li>
<li>Iannuzo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+identifies+synthetic+peptides+with+antibacterial+activity+against+mycobacterium+abscessus+and+serum+stability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening identifies synthetic peptides with antibacterial activity against mycobacterium abscessus and serum stability.</a> ACS Omega. 7 (27), 23967-23977 (2022).</li>
<li>Ma, M. T., Jennings, M. R., Blazeck, J., Lieberman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytically+active+holo+homo+sapiens+adenosine+deaminase+i+adopts+a+closed+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallograph+Sect+D%22%5BJournal%5D)">Catalytically active holo homo sapiens adenosine deaminase i adopts a closed conformation.</a> Acta Crystallograph Sect D. 78 (1), 91-103 (2022).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+4+nucleosides+via+one+reference+compound+in+chinese+cordyceps+by+hplc-uv+at+equal+absorption+wavelength%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Prod+Comm%22%5BJournal%5D)">Determination of 4 nucleosides via one reference compound in chinese cordyceps by hplc-uv at equal absorption wavelength.</a> Natural Prod Comm. 18 (3), 1934578X231161410(2023).</li>
<li>Whitmore, K. V., Gaspar, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+deaminase+deficiency+-+more+than+just+an+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adenosine deaminase deficiency - more than just an immunodeficiency.</a> Front Immunol. 7, 314(2016).</li>
<li>Jennings, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+expression+and+purification+of+a+human+adenosine+deaminase+in+E.+coli+and+characterization+of+its+asp8asn+variant%5BTitle%5D)+AND+%22Prot+Express+Purificat%22%5BJournal%5D)">Optimized expression and purification of a human adenosine deaminase in E. coli and characterization of its asp8asn variant.</a> Prot Express Purificat. 213, 106362(2024).</li>
<li>Blazeck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bypassing+evolutionary+dead+ends+and+switching+the+rate-limiting+step+of+a+human+immunotherapeutic+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Catalysis%22%5BJournal%5D)">Bypassing evolutionary dead ends and switching the rate-limiting step of a human immunotherapeutic enzyme.</a> Nat Catalysis. 5 (10), 952-967 (2022).</li>
<li>Lu, J., Grenache, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rapid%2C+microplate-based+kinetic+assay+for+measuring+adenosine+deaminase+activity+in+body+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of a rapid, microplate-based kinetic assay for measuring adenosine deaminase activity in body fluids.</a> Clinica Chimica Acta. 413 (19), 1637-1640 (2012).</li>
<li>Maciel, L. G., Dos Anjos, J. V., Soares, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+low-cost+evaluation+of+hydroxykynurenine+activity%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Fast and low-cost evaluation of hydroxykynurenine activity.</a> MethodsX. 7, 100982(2020).</li>
<li>Bokman, A. H., Schweigert, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-hydroxyanthranilic+acid+metabolism.+Iv.+Spectrophotometric+evidence+for+the+formation+of+an+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">3-hydroxyanthranilic acid metabolism. Iv. Spectrophotometric evidence for the formation of an intermediate.</a> Arch Biochem Biophys. 33 (2), 270-276 (1951).</li>
<li>Tanford, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanford%2C+C+%22Advances+in+protein+chemistry%22">Advances in protein chemistry</a>. 23, Academic Press. 121-282 (1968).</li>
<li>Tritsch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validity+of+the+continuous+spectrophotometric+assay+of+kalckar+for+adenosine+deaminase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Validity of the continuous spectrophotometric assay of kalckar for adenosine deaminase activity.</a> Anal Biochem. 129 (1), 207-209 (1983).</li>
<li>Gracia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+catalytic+site+structural+gate+of+adenosine+deaminase+allosterically+modulates+ligand+binding+to+adenosine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The catalytic site structural gate of adenosine deaminase allosterically modulates ligand binding to adenosine receptors.</a> FASEB J. 27 (3), 1048-1061 (2013).</li>
<li>Kalckar, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+spectrophotometry+of+purine+compounds+by+means+of+specific+enzymes%3A+Iii.+Studies+of+the+enzymes+of+purine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential spectrophotometry of purine compounds by means of specific enzymes: Iii. Studies of the enzymes of purine metabolism.</a> J Bio Chem. 167 (2), 461-475 (1947).</li>
<li>Hartwick, R., Jeffries, A., Krstulovic, A., Brown, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+assay+for+adenosine+deaminase+using+reverse+phase+high+pressure+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatographic+Sci%22%5BJournal%5D)">An optimized assay for adenosine deaminase using reverse phase high pressure liquid chromatography.</a> J Chromatographic Sci. 16 (9), 427-435 (1978).</li>
<li>Paul, M. K., Grover, V., Mukhopadhyay, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merits+of+hplc-based+method+over+spectrophotometric+method+for+assessing+the+kinetics+and+inhibition+of+mammalian+adenosine+deaminase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Merits of hplc-based method over spectrophotometric method for assessing the kinetics and inhibition of mammalian adenosine deaminase.</a> J Chromatography B. 822 (1), 146-153 (2005).</li>
<li>Ubbink, J. B., Vermaak, W. J. H., Bissbort, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+liquid+chromatographic+assay+of+human+lymphocyte+kynureninase+activity+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatography+B%3A+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">High-performance liquid chromatographic assay of human lymphocyte kynureninase activity levels.</a> J Chromatography B: Biomed Sci Appl. 566 (2), 369-375 (1991).</li>
<li>Tsentalovich, Y. P., Snytnikova, O. A., Forbes, M. D. E., Chernyak, E. I., Morozov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemical+and+thermal+reactivity+of+kynurenine%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Photochemical and thermal reactivity of kynurenine.</a> Exp Eye Res. 83 (6), 1439-1445 (2006).</li>
<li>Demain, A. L., Vaishnav, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+proteins+by+microbes+and+higher+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms.</a> Biotechnol Adv. 27 (3), 297-306 (2009).</li>
<li>Gräslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Faber, M. S., Whitehead, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data-driven+engineering+of+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Data-driven engineering of protein therapeutics.</a> Curr Opin Biotechnol. 60, 104-110 (2019).</li>
<li>Das, S., Zhao, L., Elofson, K., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+stabilization+by+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme stabilization by virus-like particles.</a> Biochemistry. 59 (31), 2870-2881 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Adenosina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9251-25G</td><td>25 g</td></tr><tr>Lettore <td></td><td></td><td></td>di<td>micropiastre BioTek Synergy HT</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga Eppendorf LoBind: Proteine&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>13-698-795</td><td>2 ml di</td></tr><tr><td>glicerolo</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>G33-4</td><td>4 L</td></tr><tr><td>HsKYNase66-W102H-T333N</td> Siero umano <td>interno</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Pooled</td><td>MP Biomedicals</td><td>92931149</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Idrossi-chinurenina</td><td>Cayman Chemicals</td><td>27778</td><td></td></tr><tr><td>Inosina&nbsp;</td><td>TCI</td><td>I0037</td><td>25 g</td></tr><tr><td>PBS, 1x&nbsp; pH 7,4+/- 0,1</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Piridossale 5-fosfato monoidrato, 99%&nbsp;</td><td>Thermo Scientifc</td><td>228170010</td><td>1 g</td></tr><tr><td>MICROPIASTRA UV-STAR, 96 POZZETTI, COC, F-BOTTOM</td><td>Greiner Bio</td><td>&nbsp; </td><td></td>655801</tr><tr><td>Wildtype Adenosina Deaminasi Umana 1</td><td>In-house</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determinazione della stabilità sierica dell'enzima adenosina deaminasi 1 umana

Determining the Serum Stability of Human Adenosine Deaminase 1 Enzyme

Le cifre mostrano i risultati dell'esecuzione del test quando condotto con HsADA1 wildtype. Le figure 3A, B illustrano le curve di declino dell'assorbanza a 260 nm dei campioni originati dalle miscele 1x PBS/siero-enzima per HsADA1 wildtype dopo l'aggiunta di adenosina. Questa diminuzione dell'assorbanza in funzione dei dati temporali è ciò che l'utente può aspettarsi dopo aver completato con successo il test basato su micropiastra ed è simile ai dati di assorbanza che si verificherebbero dopo l'aggiunta di quantità sufficienti di HsADA1 funzionale all'adenosina. La Figura 3C,D illustra le curve di assorbanza dei controlli negativi testati, che non contengono enzimi dopo l'aggiunta di adenosina. Rispetto ai campioni enzimatici effettivi, la variazione di assorbanza di questi controlli negativi è quasi trascurabile. Dalla Figura 3, si può vedere che le pendenze delle curve enzimatiche cambiano in funzione del tempo di incubazione. Ad esempio, la pendenza del punto temporale del giorno 0 è notevolmente più ripida rispetto al punto temporale del giorno 5.
La Figura 4 illustra la frazione di attività mantenuta da HsADA1 wildtype in funzione del tempo quando incubato in 1x PBS o in siero umano aggregato a 37 °C. In particolare, le pendenze di tutte le curve di declino dell'assorbanza nella Figura 3A, B sono normalizzate alle pendenze del giorno 0 dei rispettivi gruppi. Come si può vedere nella Figura 4, c'è una divergenza nell'attività mantenuta per HsADA1 wildtype in 1x PBS rispetto al siero umano aggregato. In particolare, l'enzima perde la sua attività più velocemente nel siero umano raggruppato, con l'enzima che mantiene circa il 10% della sua attività originale al giorno 5. Una perdita di attività è ancora rilevabile quando HsADA1 è incubato in 1x PBS, sebbene l'enzima mantenga circa il 75% della sua attività. Ciò è congruente con i risultati di Jennings et al., che riportano anche una diminuzione dell'attività dopo l'incubazione con siero a 37 °C di quasi il 40% dopo 48 ore6. Lu et al. hanno anche dimostrato che l'attività di HsADA1 diminuisce nei fluidi corporei pleurici, peritoneali e cerebrospinali a temperatura ambiente (25 °C)8.
Per dimostrare la flessibilità di questo protocollo, lo abbiamo utilizzato per testare la stabilità sierica di un altro enzima di origine umana, una variante ingegnerizzata della chinurenina umana precedentemente soprannominata HsKYNase66-W102H-T333N7. HsKYNase66_W102H-T333N catalizza efficacemente la conversione di OH-Kyn in OH-AA, in modo simile all'enzima HsKYNase wildtype, sebbene sia in realtà un mutante di reversione di due aminoacidi di una variante ingegnerizzata della chinurenina umana con alterata specificità del substrato, cioè che degrada efficacemente la chinurenina in acido antranilico7. OH-Kyn assorbe fortemente a 379 nm, mentre OH-AA no, con conseguente calo dell'assorbanza misurabile dopo l'aggiunta della nostra variante ingegnerizzata HsKYNasi a OH-kyn 9,10. La Figura 5A,B illustra le curve di declino dell'assorbanza a 379 nm dei campioni originati dalle miscele 1x PBS/siero-enzima per HsKYNasi dopo l'aggiunta di OH-Kyn. La Figura 5C,D illustra le curve di assorbanza dei controlli testati che non contengono enzimi. Come si è visto con HsADA1, c'è una chiara differenza nelle pendenze delle curve di assorbanza tra i campioni. Ciò è particolarmente evidente nella Figura 5A, poiché la pendenza del punto temporale 0 ore è molto più ripida rispetto ai punti temporali 3 ore e 24 ore. La Figura 6 illustra la corrispondente frazione di attività mantenuta per la HsKYNasi testata in funzione del tempo. Come HsADA1, HsKYNase66-W102H-T333N perde attività nel siero più rapidamente che nella PBS (~85% di attività persa rispetto a ~40% nel corso di 24 ore). Sebbene la stabilità sierica di questa variante enzimatica non sia stata precedentemente testata, segue la tendenza generale di altre varianti di HsKYNase, che hanno perso la maggior parte della loro attività entro 24 ore nel siero a 37 °C7. 
In generale, gli enzimi potrebbero perdere attività nel tempo a causa di una serie di fattori, tra cui il pH, la concentrazione di sale, la temperatura e altroancora 11. Pertanto, un risultato che non segue questo andamento potrebbe essere considerato anormale. Ad esempio, se l'attività enzimatica aumenta drasticamente nel tempo, ciò potrebbe indicare che i risultati non sono validi. Questo supponendo che le condizioni enzimatiche non vengano modificate, e stiamo parlando strettamente in senso temporale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig01.jpg"> Figura 1: Diagramma di flusso che descrive in dettaglio i passaggi del protocollo per HsADA1. La figura mostra i passaggi seguiti in questo protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig02.jpg"> Figura 2: Impostazioni di lettura cinetica del lettore di micropiastre. È stato creato un protocollo di lettura cinetica per misurare l'assorbanza a 260 nm per 30 minuti a 37 °C con l'intervallo minimo. La figura illustra le impostazioni scelte per impostare questo protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig03.jpg"> Figura 3: Curve di assorbanza rispetto al tempo per HsADA1 dopo l'aggiunta di 200 μM di adenosina. (A) Curve di assorbanza rispetto al tempo per HsADA1 incubato nel siero dopo l'aggiunta di 200 μM di adenosina. (B) 1x HsADA1 incubato con PBS. (C) Controllo sierico negativo. (D) 1x controllo negativo PBS (n =3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig04.jpg"> Figura 4: Ritenzione dell'attività di HsADA1. L'attività è valutata in 1x PBS rispetto al siero umano aggregato a 37 °C. È stata determinata la frazione di attività originale mantenuta per HsADA1 incubato in 1x PBS rispetto al siero umano aggregato nel corso di 5 giorni (barre = media ± SD, n=3). È stato utilizzato un test t non accoppiato a due code *p&lt;0,05, **p &lt; 0,01 e ***p &lt; 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig05.jpg"> Figura 5: Curve di assorbanza rispetto al tempo per HsKYNase66-W102H-T333N dopo l'aggiunta di 400 μM di OH-Kyn. (A) Curve di assorbanza rispetto al tempo per HsKYNasi incubata nel siero dopo l'aggiunta di 400 μM di OH-Kyn. (B) 1x HsKYNasi incubata con PBS. (C) Controllo sierico negativo. (D) 1x controllo negativo PBS (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig06.jpg"> Figura 6: Ritenzione dell'attività di HsKYNase66-W102H-T333N. L'attività è valutata in 1x PBS rispetto al siero umano aggregato a 37 °C. È stata determinata la frazione di attività originale mantenuta per HsKYNase66-W102H-T333N incubata in 1x PBS rispetto al siero umano aggregato nel corso di 24 ore (barre = media ± SD, n=3). È stato utilizzato un t-test non accoppiato a due code; p &lt; 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura 1 supplementare: Curva standard di adenosina e inosina. Il grafico è stato disegnato per 0-200 μM. L'adenosina o l'inosina sono state aggiunte a 1x PBS alle concentrazioni indicate, quindi è stata misurata l'assorbanza a 260 nm. (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura 2 supplementare: Curva standard di OH-Kyn. Il grafico è stato disegnato per 0-400 μM. OH-Kyn è stato aggiunto a 1x PBS alle concentrazioni indicate, quindi è stata misurata l'assorbanza a 379 nm. (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%202.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura 3 supplementare: Curve di assorbanza rispetto al tempo a 260 nm con concentrazioni crescenti di HsADA1 dopo l'aggiunta di 200 μM di adenosina. (A) Curve di reazione per concentrazioni variabili di HsADA1. (B) Variazione di piegatura della pendenza della regione lineare delle curve di assorbanza in relazione a un controllo PBS 1x (barre = media ± SD, n=3). È stato utilizzato un test t non accoppiato a due code **p &lt; 0,01 e ****p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%203.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura 4 supplementare: Curve di assorbanza rispetto al tempo a 379 nm con concentrazioni crescenti di HsKYNasi ingegnerizzata dopo l'aggiunta di 400 μM di OH-Kyn. (A) Curve di reazione per concentrazioni variabili di HsKYNasi ingegnerizzata. (B) Variazione di piegatura della pendenza della regione lineare delle curve di assorbanza in relazione a un controllo PBS 1x (barre = media ± SD, n=3). È stato utilizzato il t-test non accoppiato a due code ****p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%204.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura 5 supplementare: Curve di assorbanza rispetto al tempo a 379 nm utilizzando l'enzima disattivato termicamente in 400 μM di OH-Kyn. L'enzima HsKYNasi deattivato a caldo è stato aggiunto a 400 μM di OH-Kyn in 1x PBS, quindi è stata misurata l'assorbanza a 379 nm. (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%205.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Determinazione della stabilità sierica dell'enzima adenosina deaminasi 1 umana

The concept of enzyme stability is typically used to refer to an enzyme's thermostability - its ability to retain structure and activity as temperature ...

determining-the-serum-stability-of-human-adenosine-deaminase-1-enzyme

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Un metodo per la determinazione dell'attività acetato chinasi è descritto. Questo test utilizza una reazione diretta per determinare l'attività enzimatica e la cinetica di acetato chinasi in acetato che formano direzione con diversi accettori fosforil. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per il saggio altro acetil fosfato o acetil-CoA che utilizzano enzimi.

Rilevazione diretta della acetato di formazione Attività di acetato enzima chinasi

Questo articolo descrive la procedura di sintesi di un enzima modificato in modo idrofobo membrana Nafion immobilizzazione e come immobilizzare proteine ​​e / o enzimi all'interno della membrana e verificare la loro attività specifica.

Idrofobo Salt-modificato Nafion per l&#39;immobilizzazione degli enzimi e la stabilizzazione

Questo video spiega un metodo di cromatografia liquida quantitativa ad alte prestazioni in fase inversa (RP-HPLC) per misurare il metabolismo dell'adenosina e delle purine associate generato dal consumo di AMP nell'ambiente extracellulare delle cellule tumorali leucemiche. Il protocollo descrive un test RP-HPLC sensibile, specifico, affidabile e riproducibile, sviluppato e convalidato per la quantificazione di nucleotidi purinici extracellulari e nucleosidi prodotti da cellule di leucemia...

Metabolismo extracellulare delle purine: un test basato sull'HPLC per misurare la generazione e il metabolismo dell'adenosina nelle cellule leucemiche

Radicale a base chimica biomimetica è stato applicato alla costruzione-up librerie necessarie per lo sviluppo di biomarker.

I radicali liberi in Chemical Biology: da comportamento chimico a sviluppo Biomarker

PAD4 è un enzima responsabile della conversione della peptidil-arginina in peptidil-citrullina. La disregolazione di PAD4 è stata implicata in numerose malattie umane. Viene descritto un saggio PAD4 basato sulla fluorescenza facile e compatibile ad alto rendimento.

Basato sulla fluorescenza Monitoraggio dei PAD4 attività tramite un substrato Analog Pro-fluorescenza

Il protocollo qui descritto rappresenta un metodo semplice e riproducibile che impiega la cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa (RP-HPLC) per misurare il metabolismo delle purine su cellule di leucemia linfatica cronica (LLC) coltivate in diverse condizioni.

HPLC-based test per monitorare extracellulare Nucleotide / nucleosidici metabolismo in cronica cellule umane leucemia linfocitica

La stabilità termica dell'attività enzimatica è prontamente misurata tramite calorimetria isotermica di titolazione (ITC). La maggior parte delle analisi di stabilità di proteina attualmente utilizzato misura proteina sta svolgendo, ma non forniscono informazioni sull'attività enzimatica. ITC consente la determinazione diretta dell'effetto di modifiche di enzima sulla stabilità dell'attività enzimatica.

Misura di stabilità enzimatica di calorimetria isotermica di titolazione

Un saggio ATPase accoppiato a nicotinamide (NADH) è stato adattato allo screening semi-alto flusso di inibitori della miosina. Questo saggio cinetico viene eseguito in un formato a microplacca 384 pozzetti con volumi di reazione totali di soli 20 l per pozzo. La piattaforma dovrebbe essere applicabile praticamente a qualsiasi enzima che produce ADP.

Adattamento semi-alto/throughput del saggio ATPase accoppiato NADH per lo screening degli inibitori delle piccole molecole

L'ossidazione fotochimica rapida delle proteine è una tecnica emergente per la caratterizzazione strutturale delle proteine. Diversi additivi solventi e ligand hanno varie proprietà di scavenging radicale idrossile. Per confrontare la struttura della proteina in diverse condizioni, è necessaria una compensazione in tempo reale dei radicali idrossili generati nella reazione per normalizzare le condizioni di reazione.

Abilitazione della compensazione in tempo reale nelle ossidazioni fotochimiche veloci delle proteine per la determinazione dei cambiamenti della topografia proteica

Questo protocollo descrive un metodo colorimetrico per valutare in modo affidabile l'influenza delle sostanze chimiche sull'attività della Deiodinasi 1 (DIO1) nei microsomi epatici umani utilizzando la reazione di Sandell-Kolthoff. Include criteri di accettazione predefiniti e metriche statistiche di performance e supporta gli sforzi continui per l'inclusione nelle linee guida dei test OCSE.

Valutazione colorimetrica dell'attività della Deiodinasi 1 nei microsomi epatici umani utilizzando la reazione di Sandell-Kolthoff

Scopri come valutare la stabilità sierica degli enzimi per migliorare l'efficacia terapeutica dei biologici proteici nel trattamento del cancro. Questo metodo guida le strategie di ingegneria proteica.

Determinazione della stabilità sierica dell'enzima adenosina deaminasi 1 umana

Esplora altri video