Name: Quantificazione dei fenotipi oculari di Drosophila melanogaster : un approccio computazionale che integra ilastik e Flynotyper (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:35:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: Scopri un metodo computazionale per quantificare i fenotipi oculari di Drosophila melanogaster utilizzando ilastik e Flynotyper. Questo approccio riduce i bias della classificazione manuale e migliora l'accuratezza nella valutazione delle mutazioni genetiche.

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<meta charset="utf8"></head><body>Quantificazione imparziale degli ommatidi nei modelli oculari di Drosophila

<ol><li>Iyer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+eye+phenotypes+for+functional+genetic+studies+using+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of eye phenotypes for functional genetic studies using Drosophila melanogaster.</a> G3. 6 (5), 1427-1437 (2016).</li>
<li>Thomas, B. J., Wassarman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fly%27s+eye+view+of+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A fly's eye view of biology.</a> Trends Genet. 15 (5), 184-190 (1999).</li>
<li>Roignant, J. -Y., Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the Drosophila eye disc.</a> Int J Dev Biol. 53 (5-6), 795-804 (2009).</li>
<li>Diez-Hermano, S., Ganfornina, M. D., Vegas, E., Sanchez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+learning+representation+of+loss+of+eye+regularity+in+a+Drosophila+neurodegenerative+model%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Machine learning representation of loss of eye regularity in a Drosophila neurodegenerative model.</a> Front Neurosci. 14 (1), 1-14 (2020).</li>
<li>Appocher, C., Klima, R., Feiguin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+in+Drosophila+reveals+the+conserved+role+of+REEP1+in+promoting+stress+resistance+and+preventing+the+formation+of+Tau+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Functional screening in Drosophila reveals the conserved role of REEP1 in promoting stress resistance and preventing the formation of Tau aggregates.</a> Hum Mol Genet. 23 (25), 6762-6772 (2014).</li>
<li>Pandey, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+rescues+neurodegeneration+and+provides+an+essential+link+between+autophagy+and+the+UPS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HDAC6 rescues neurodegeneration and provides an essential link between autophagy and the UPS.</a> Nature. 447 (7146), 860-864 (2007).</li>
<li>Outa, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+Drosophila+model+of+wild-type+and+T315I+mutated+BCR-ABL1+in+chronic+myeloid+leukemia%3A+an+effective+platform+for+treatment+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Validation of a Drosophila model of wild-type and T315I mutated BCR-ABL1 in chronic myeloid leukemia: an effective platform for treatment screening.</a> Haematologica. 105 (2), 387-397 (2019).</li>
<li>Shirinian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+Drosophila+melanogaster+model+to+study+human+T-lymphotropic+virus+oncoprotein+Tax-1-driven+transformation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A transgenic Drosophila melanogaster model to study human T-lymphotropic virus oncoprotein Tax-1-driven transformation in vivo.</a> J Virol. 89 (15), 8092-8095 (2015).</li>
<li>Diez-Hermano, S., Valero, J., Rueda, C., Ganfornina, M. D., Sanchez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+image+analysis+method+to+measure+regularity+in+biological+patterns%3A+a+case+study+in+a+Drosophila+neurodegenerative+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">An automated image analysis method to measure regularity in biological patterns: a case study in a Drosophila neurodegenerative model.</a> Mol Neurodegener. 10 (1), 1-10 (2015).</li>
<li>Yusuff, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+of+pathogenic+copy-number+variant+genes+show+global+and+non-neuronal+defects+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila models of pathogenic copy-number variant genes show global and non-neuronal defects during development.</a> PLoS Genet. 16 (6), e1008792-e1008792 (2020).</li>
<li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ilastik%3A+interactive+machine+learning+for+%28bio%29image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nat Methods. 16, 1226-1232 (2019).</li>
<li>Chalmers, M. R., Kim, J., Kim, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eip74EF+is+a+dominant+modifier+for+ALS-FTD-linked+VCPR152H+phenotypes+in+the+Drosophila+eye+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Eip74EF is a dominant modifier for ALS-FTD-linked VCPR152H phenotypes in the Drosophila eye model.</a> BMC Res Notes. 16 (1), 1-5 (2023).</li>
<li>Baek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+and+PINK1+mediate+CHCHD10S59L+mutation-induced+defects+in+Drosophila+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">TDP-43 and PINK1 mediate CHCHD10S59L mutation-induced defects in Drosophila and in vitro.</a> Nat Commun. 12 (1), 1-20 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Specifiche del</td><td></td><td></td> computer <td>Ryzen 5, 16 GB di RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10</td></tr><tr><td>Flynotyper</td><td>Iyer, J. et al. (2016)</td><td>Scarica il software qui: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html</td><td>Software open source. Non utilizzare Flynotyper 2.0. Al momento della pubblicazione, la versione 2.0 era abbastanza nuova e questo protocollo è ottimizzato per la versione originale di Flynotyper.</td></tr><tr><td>ilastik</td><td>Berg, S. et al. (2019)</td><td>Scarica il software qui: https://www.ilastik.org/download.html</td><td>Software open source. Scarica la versione 1.4.0.post1 in Regular Builds corrispondenti al sistema operativo del tuo computer.</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>Scarica il software qui: https://imagej.net/ij/download.html</td><td>Software open source. Sono state utilizzate le versioni 1.53 e 1.54. 1.54 è la versione aggiornata ed è il download predefinito.</td></tr><tr><td>Leica Application Suite (LAS X)</td><td>Leica Microsystems</td><td>LASX Office 1.4.6 28433</td><td>Sistema e software utilizzati per l'acquisizione z-stack.</td></tr><tr><td>Microscopio Leica Z16 APO con fotocamera DMC2900</td><td>Leica Microsystems</td><td>10 447 173, 12 730 466</td><td>Nel testo viene indicato come microscopio Z-stack e fotocamera. Questo prodotto è ora archiviato.</td></tr></tbody></table>

quantificazione dei fenotipi oculari di drosophila melanogaster : un approccio computazionale che integra ilastik e flynotyper

Quantifying Drosophila melanogaster Eye Phenotypes: A Computational Approach Integrating ilastik and Flynotyper

In uno studio precedente, abbiamo utilizzato questo protocollo per determinare i modificatori genetici della proteina VCP mutante legata alla sclerosi laterale amiotrofica con demenza frontotemporale (ALS-FTD)12. Inoltre, questo metodo è stato utilizzato anche in un altro articolo per valutare la tossicità dell CHCHD10 ALS-FTD mediata daS59L, anche quando si utilizza un vecchio stereomicroscopio13. Per convalidare ulteriormente questi risultati, abbiamo utilizzato ilastik e Flynotyper nella stessa mutazione della malattia ALS-FTD di Baek et al.13; Tuttavia, un personale di laboratorio non addestrato ha eseguito l'esperimento e ha ottenuto risultati simili. Pertanto, la combinazione di ilastik e Flynotyper è un metodo robusto per valutare in modo imparziale la degenerazione della Drosophila ommatidia.
Preferiamo l'uso di una luce anulare perché consente migliori valutazioni qualitative (Figura 3). Tuttavia, l'uso di una luce anulare provoca un'ombra che Flynotyper non può analizzare direttamente. Per ovviare a questo problema, abbiamo pre-elaborato le immagini in ilastik prima di quantificare i P-Score con Flynotyper. Nel complesso, i punteggi P dell'occhio di mosca non degenerato (GMR-GAL4) erano significativamente più bassi rispetto a un occhio moderatamente degenerato (2x_S81L) e a un occhio gravemente degenerato (3x_S81L) (Figura 4A, B e Tabella 1). Questo è il risultato atteso, poiché P-Score più alti generati da Flynotyper indicano un occhio più degenerato1. Quando ilastik non è stato utilizzato, c'erano differenze trascurabili nei punteggi P tra un occhio non degenerato e un occhio moderatamente degenerato (Figura 4C e Tabella 1). Ciò suggerisce che Flynotyper fatica a identificare con precisione i modelli di ommatidi in condizioni di luce anulare senza utilizzare ilastik. Questo perché Flynotyper è progettato per utilizzare immagini scattate con una luce a doppio punto che viene convertita in scala di grigi con regolazioni aggiuntive per identificare il centro dell'ommatidiale1. Ilastik replica questo processo incorporando un punto al centro di ogni ommatidio, consentendo la quantificazione all'interno di Flynotyper.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig01.jpg"> Figura 1: Esempio di flusso di lavoro ilastik. (A) Creazione di un nuovo progetto in ilastik. (B) Scelta dell'immagine standard. (C) Selezione dei valori sigma in Selezione funzionalità. (D) Marcatura del primo piano degli ommatidi per la sensibilità. (E) Contrassegnare lo sfondo degli ommatidi per la sensibilità. (F) Selezione della modalità di esportazione dei file elaborati da parte del software. (G) Scegliere quali immagini sperimentali dell'occhio di mosca analizzare. (H) Mostrare quali immagini sperimentali dell'occhio di mosca saranno analizzate. (I) Prodotto finito dopo l'esecuzione del software. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig02.jpg"> Figura 2: Esempio di flusso di lavoro di Flynotyper. (A) Selezione solo dell'occhio della mosca per ulteriori analisi. (B) Apertura dell'immagine dell'occhio tagliato in una nuova finestra. (C) Selezione delle immagini tagliate da analizzare e dei parametri da controllare per l'analisi. (D) Risultati di esempio. I punteggi fenotipici sono presentati all'estrema destra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig03.jpg"> Figura 3: Immagini qualitative degli occhi di Drosophila . Lo stesso occhio di mosca preso con una luce anulare (a sinistra) e preso con una luce a doppio punto (a destra) in condizioni non degenerate (in alto) e degenerate (in basso). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig04.jpg"> Figura 4: Utilizzo di ilastik prima di Flynotyper per una quantificazione accurata del fenotipo dell'occhio ruvido in Drosophila. (A) Immagini rappresentative dell'occhio di Drosophila di un occhio non degenerato (GMR-GAL4), di un occhio moderatamente degenerato (2x_S81L) e di un occhio gravemente degenerato (3x_S81L). (B) Risultati della quantificazione da Flynotyper dopo l'uso di ilastik. I valori P di un test t di permutazione a due lati sono stati calcolati per facilitare l'interpretazione dei risultati (GMR-GAL4 vs 2x_S81L: p = 0, GMR-GAL4 vs 3x_S81L: p = 0) (C) Risultati di quantificazione da Flynotyper senza l'uso di ilastik. I valori P di un test t di permutazione a due facce sono stati calcolati per facilitare l'interpretazione dei risultati (GMR-GAL4 vs 2x_S81L: p = 0,597, GMR-GAL4 vs 3x_S81L: p = 0,687). N = 3 per ogni gruppo. I punti dati sono jitter o impilati sull'asse x per una maggiore chiarezza visiva. La linea orizzontale continua rappresenta la media. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">GMR-GAL4</td>
			<td colspan="2">2x_S81L</td>
			<td colspan="2">3x_S81L</td>
		</tr><tr><td>Con ilastik</td>
			<td>Senza ilastik</td>
			<td>Con ilastik</td>
			<td>Senza ilastik</td>
			<td>Con ilastik</td>
			<td>Senza ilastik</td>
		</tr><tr><td>26.7</td>
			<td>55.7</td>
			<td>52.5</td>
			<td>51.2</td>
			<td>59.9</td>
			<td>55.6</td>
		</tr><tr><td>17.4</td>
			<td>53.5</td>
			<td>50</td>
			<td>54.9</td>
			<td>60.7</td>
			<td>52</td>
		</tr><tr><td>22.8</td>
			<td>55.5</td>
			<td>56.8</td>
			<td>55.2</td>
			<td>60.1</td>
			<td>55.1</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Punteggi P quando si utilizza Flynotyper con ilastik e quando si utilizza Flynotyper da solo. 
Figura S1 supplementare: Montatura a testa volante configurata per l'acquisizione dell'immagine. Questo è un esempio di come impostare l'acquisizione di immagini utilizzando più fogli di carta. Tuttavia, è possibile utilizzare qualsiasi metodo che garantisca il corretto orientamento della testa e dell'occhio della mosca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/Publication%20JoVE%20Sup%20Fig%201.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare S2: Risultati quantitativi di ilastik e Flynotyper quando si utilizza un valore sigma di 2,5 nella selezione delle funzionalità. L'utilizzo di un valore sigma diverso da 5.0 nella selezione delle funzioni in ilastik può comportare una quantificazione imprecisa. In particolare, un valore sigma di 2,5 comporta una perdita di sensibilità. I valori P di un t-test di permutazione a due facce sono stati calcolati per facilitare l'interpretazione dei risultati (GMR-GAL4 vs 2x_S81L: p = 0,192, GMR-GAL4 vs 3x_S81L: p = 0). N = 3 per ogni gruppo. I punti dati sono jitter o impilati sull'asse x per una maggiore chiarezza visiva. La linea orizzontale continua rappresenta la media. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/Publication%20JoVE%20Sup%20Fig%202.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare S3: Perdita di sensibilità e P-Score imprecisi a causa di chiazze necrotiche. Le frecce bianche indicano segmenti di macchie necrotiche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/Publication%20JoVE%20Sup%20Fig%203.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Tabella supplementare S1: Punteggi P quando si utilizza un valore sigma di 2,5 nella selezione delle funzioni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219_Supp%20Table%201.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Quantificazione dei fenotipi oculari di Drosophila melanogaster : un approccio computazionale che integra ilastik e Flynotyper

The Drosophila melanogaster compound eye is a well-structured and comprehensive array of around 800 ommatidia, exhibiting a symmetrical and hexagonal ...

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