Quantificazione dei leucociti aderenti indotti dal diabete nella vascolarizzazione retinica

L'obiettivo della ricerca nel nostro laboratorio è quello di capire quali sono le cause della retinopatia nel diabete e come può essere prevenuta. Diversi laboratori hanno dimostrato che la leucostasi, l'accumulo eccessivo di globuli bianchi, nei piccoli vasi dell'occhio sta aumentando il diabete. E questo potrebbe contribuire all'occlusione e alla degenerazione dei vasi della retina nel diabete. Questa tecnica consente la visualizzazione e la quantificazione della gravità della leucostasi nel sistema vascolare retinico. E può essere utilizzato negli studi che vogliono valutare l'efficacia di diverse terapie, compresi i farmaci.

[Istruttore] Per impostare l'infusore a pressione, collegare in serie la sacca salina allo 0,9%. il set di cateteri endovenosi, una valvola del rubinetto a quattro vie e l'ago del gavage. Aprire il sistema di perfusione e lavare le linee e le porte con soluzione fisiologica per due minuti a una portata compresa tra 18 e 20 millilitri al minuto per rimuovere eventuali bolle d'aria. Posizionare il topo anestetizzato supino sul tavolino di perfusione. Identificare visivamente il processo xifoideo. Con l'emostatico nella mano dominante, fissare e bloccare la pelle. Quindi trasferire l'emostatico sulla mano non dominante e sollevare la pelle. Successivamente, usando le forbici, taglia una macchia di pelle con un angolo di 90 gradi rispetto alla colonna vertebrale per esporre la parete addominale esterna. Con il processo xifoideo e la gabbia toracica visibili, sezionare bilateralmente attraverso la parete addominale, evitando accuratamente qualsiasi organo o vaso principale. Ora, visualizza il cuore, i ventricoli e i polmoni attraverso il diaframma. Usando la punta delle forbici, praticare un'incisione nel diaframma su un lato vicino alla colonna vertebrale. Esporre il cuore nella cavità toracica dopo aver diviso in due lo sterno. Con il forcipe nella mano non dominante, afferra il cuore vicino al suo apice. Usando la mano dominante, tenere l'ago della sonda adesiva attaccato al catetere endovenoso e perforare l'apice del cuore. Assicurarsi che la punta sferica dell'ago della sonda sia leggermente sporgente dal sito di puntura per evitare di perforare completamente il ventricolo sinistro o di entrare nel sistema vascolare polmonare. Quindi, aprire il rubinetto per consentire il flusso di soluzione fisiologica allo 0,9%. Contemporaneamente, usa le forbici per aprire l'atrio destro. Continua la perfusione per due o tre minuti, muovendo delicatamente l'ago da un lato all'altro e su e giù per evitare che la vascolarizzazione si attorcigli e aumentare il drenaggio del sangue dal cuore. Dopo la perfusione, ruotare la maniglia del rubinetto per interrompere il flusso di soluzione salina e consentire il flusso dalla siringa all'ago del gavage. Quindi perfondere manualmente 10 millilitri di soluzione di concanavalina A entro 30-35 secondi. Dopo aver perfuso il cuore di un topo anestetizzato con una soluzione di concanavalina A, girare il mouse su un lato. Posizionare l'indice della mano non dominante sulla palpebra superiore e il pollice sulla palpebra inferiore. Ritrarre delicatamente le palpebre e la pelle circostante per proptosare l'occhio, lasciandolo sporgere parzialmente dall'orbita. Quindi, usando le forbici curve nella mano dominante, raccogli sotto l'occhio con un angolo di 45 gradi. Tagliare gli attacchi muscolari e il nervo ottico. Usando le forbici come una spatola, trasferisci l'occhio in un piccolo contenitore. Posizionare l'occhio sulla cera dentale per prepararsi all'apertura del globo. Al microscopio da dissezione, utilizzando una micro pinza, tenere la piega sclerale o i resti muscolari attaccati alla parte posteriore dell'occhio e orientare l'occhio in modo che la cornea sia rivolta da un lato. Praticare un'incisione dietro e parallelamente al limbus. Usa le micro forbici per separare il segmento anteriore dell'occhio, compresa la lente attorno al perimetro della conchiglia oculare, assicurandoti che la retina sia completamente staccata dalla sclera. Estrarre la retina dalla sclera con la micro spatola. Se la retina è ancora attaccata dal nervo ottico, inserire delle micro forbici tra la retina e la sclera per recidere il nervo ottico. Posizionare la retina non fissata su un vetrino con una goccia di PBS. Fai quattro o cinque tagli radiali nella retina, creando un motivo a foglia di trifoglio in modo che sia piatta. Osservare la retina montata piatta al microscopio con un ingrandimento di 100x utilizzando un obiettivo 10x. La microscopia a fluorescenza del sistema vascolare retinico ha mostrato che le retine diabetiche mostravano una lieve leucostasi con tipicamente da 3 a 12 leucociti per retina rispetto a 1-3 nei controlli non diabetici. Cluster leucocitari significativi sono stati osservati in modelli infiammatori con lipopolisaccaridi in contrasto con il clustering lieve nei campioni diabetici.