Name: Impostazione di uno smistamento di successo per lisolamento delle vescicole extracellulari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Impara a isolare vescicole extracellulari ad alta purezza da cellule stromali mesenchimali mediante tecnologia di cell sorting. Questo protocollo preserva l'integrità delle vescicole e facilita la loro caratterizzazione per applicazioni cliniche.

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<meta charset="utf8"></head><body>Smistamento basato sulla fluorescenza di vescicole extracellulari di derivazione adiposa

<ol><li>Welsh, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+%28misev2023%29%3A+From+basic+to+advanced+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches.</a> J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).</li>
<li>Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+isolation+and+characterization%3A+Toward+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle isolation and characterization: Toward clinical application.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1152-1162 (2016).</li>
<li>Dixson, A. C., Dawson, T. R., Di Vizio, D., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-specific+regulation+of+extracellular+vesicle+biogenesis+and+cargo+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Context-specific regulation of extracellular vesicle biogenesis and cargo selection.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (7), 454-476 (2023).</li>
<li>Witwer, K. W., Wolfram, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+versus+synthetic+nanoparticles+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mater%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles versus synthetic nanoparticles for drug delivery.</a> Nat Rev Mater. 6 (2), 103-106 (2021).</li>
<li>Cheng, L., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutically+harnessing+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Therapeutically harnessing extracellular vesicles.</a> Nat Rev Drug Discov. 21 (5), 379-399 (2022).</li>
<li>Du, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+A+rising+star+for+therapeutics+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: A rising star for therapeutics and drug delivery.</a> J Nanobiotechnology. 21 (1), 231(2023).</li>
<li>Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles%3A+Novel+frontiers+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Novel frontiers in regenerative medicine.</a> Stem Cell Res Ther. 9 (1), 63(2018).</li>
<li>Orbay, H., Tobita, M., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+isolated+from+adipose+and+other+tissues%3A+Basic+biological+properties+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells isolated from adipose and other tissues: Basic biological properties and clinical applications.</a> Stem Cells Int. 2012, 461718(2012).</li>
<li>Caplan, A. I., Dennis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+as+trophic+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells as trophic mediators.</a> J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).</li>
<li>Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles%3A+Toward+cell-free+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications.</a> Mol Ther. 23 (5), 812-823 (2015).</li>
<li>Galipeau, J., Sensébé, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells%3A+Clinical+challenges+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells: Clinical challenges and therapeutic opportunities.</a> Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+extracellular+vesicles+isolation+and+separation%3A+Current+techniques%2C+pending+questions+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications.</a> Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).</li>
<li>Ohnuma, K., Yomo, T., Asashima, M., Kaneko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+of+cells+of+the+same+size%2C+shape%2C+and+cell+cycle+stage+for+a+single+cell+level+assay+without+staining%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sorting of cells of the same size, shape, and cell cycle stage for a single cell level assay without staining.</a> BMC Cell Biol. 7, 25(2006).</li>
<li>Morales-Kastresana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+detection+and+sorting+of+nanoscale+vesicles+in+viral+disease+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">High-fidelity detection and sorting of nanoscale vesicles in viral disease and cancer.</a> J Extracell Vesicles. 8 (1), 1597603(2019).</li>
<li>Mortati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+extracellular+vesicles+migration+in+cartilage-derived+osteoarthritis+samples+using+real-time+quantitative+multimodal+nonlinear+optics+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging.</a> Pharmaceutics. 12 (8), 734(2020).</li>
<li>Andreu, Z., Yanez-Mo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraspanins+in+extracellular+vesicle+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tetraspanins in extracellular vesicle formation and function.</a> Front Immunol. 5, 442(2014).</li>
<li>Mildmay-White, A., Khan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+markers+on+adipose-derived+stem+cells%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Cell surface markers on adipose-derived stem cells: A systematic review.</a> Curr Stem Cell Res Ther. 12 (6), 484-492 (2017).</li>
<li>Welsh, J. A., Tang, V. A., Van Der Pol, E., Gorgens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIFlowCyt-EV%3A+The+next+chapter+in+the+reporting+and+reliability+of+single+extracellular+vesicle+flow+cytometry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">MIFlowCyt-EV: The next chapter in the reporting and reliability of single extracellular vesicle flow cytometry experiments.</a> Cytometry A. 99 (4), 365-368 (2021).</li>
<li>Maia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Employing+flow+cytometry+to+extracellular+vesicles+sample+microvolume+analysis+and+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Employing flow cytometry to extracellular vesicles sample microvolume analysis and quality control.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 593750(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>5(6)-Carbossifluoresceina diacetato&nbsp; N-succinimidil estere</td><td>Merck</td><td>150347-59-4</td><td></td></tr><tr><td>Cellule stromali mesenchimali adipose</td><td>Wepredic, Parc d'affaires, 35760 Saint-Gr&eacute; goire, Francia</td><td></td><td>Cellule utilizzate in questo studio</td></tr><tr><td>Alexa 488 anti-Caveolina</td><td>R & D Systems</td><td>IC5736G</td><td>Anticorpo per citometria a flusso</td></tr><tr><td>APC anti-umano CD44 BioLegend</td><td></td><td>338805</td><td>Anticorpo per citometria a flusso</td></tr><tr><td>APC anti-umano CD63</td><td>BioLegend</td><td>353007</td><td>Anticorpo per citometria a flusso</td></tr><tr><td>APC anti-umano CD81 (TAPA-1)</td><td>BioLegend</td><td>349509</td><td>Anticorpo per citometria a flusso</td></tr><tr><td>APC anti-umano CD9</td><td>BioLegend</td><td>312107</td><td>Citometria a flusso anticorpo</td></tr><tr><td>BC CytoFLEX S</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>BC CytoFLEX S dotato di 3 laser, Blu, Rosso e Viola</td></tr><tr><td>Flow-Check Pro Fluorosfere</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63493</td><td>Perle di controllo fluorescenti per MoFLO Software Astrios EQ</td></tr><tr><td>FlowJo (versione 10.8.1)</td><td>BD</td><td>versione 10.8.1</td><td>Software di analisi</td></tr><tr><td>Kit IntraSure</td><td>BD Biosciences</td><td>641776</td><td>Fissazione e permeabilizzazione per colorazione intracellulare</td></tr><tr><td>Megamix-Plus FSC</td><td>BioCytex</td><td>7802</td><td>FSC perle di polistirene&nbsp;</td></tr><tr><td>MoFLO Astrios EQ</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>MoFLO Astrios EQ dotato di 4 laser, blu, giallo - verde, viola e rosso</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-FLOT1 del topo</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610820</td><td>Anticorpo Western Blot</td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Calnexina di coniglio</td><td>Origene</td><td>TA336279</td><td>Anticorpo</td></tr> <tr><td>Western BlotAnticorpo anti-CD9 e CD81 di coniglio (kit di anticorpi ExoAb)</td><td>Sistema Biosciences</td><td>EXOAB-KIT-1</td><td>Anticorpi Western Blot</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-TSG101 di coniglio</td><td>Merck</td><td>HPA006161</td><td>Western Blot anticorpo</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr> Ultra <tr><td>Rainbow Fluorescent Particles</td><td>Spherotech</td><td>URFP-30-2</td><td></td></tr><tr><td>Ultracel 100 kDa MWCO</td><td>Merck</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>VER01 - Verity Shells</td><td>Exometry</td><td></td><td>Perle di silice organica per la calibrazione della dispersione</td></tr></tbody></table>

impostazione di uno smistamento di successo per l'isolamento delle vescicole extracellulari

Setting a Successful Sorting for Extracellular Vesicle Isolation

Le perle di polistirene FSC sono state selezionate per convalidare la configurazione dello strumento e le condizioni di smistamento. Le perle di polistirene FSC sono un mix di perle fluorescenti che vanno da 100 nm, 300 nm, 500 nm e 900 nm e sono visibili sul canale FITC. La Figura 7A mostra la scala logaritmica SSC rispetto al dot plot della scala logaritmica FITC con le quattro popolazioni di perline prima dell'ordinamento. Le popolazioni fluorescenti di 100 nm, 300 nm e 500 nm sono state gated e ordinate. Le perle selezionate sono state analizzate per verificarne la purezza e l'arricchimento come prova iniziale del concetto (Figura 7B). Tutte le popolazioni erano pure dopo la cernita. Il rumore di fondo di riferimento è sempre visibile nei grafici a punti prima e dopo l'ordinamento.
Al fine di soddisfare i requisiti elencati nel MISEV2018/2023 e di dimostrare la natura delle vescicole e il loro grado di purezza, sono stati condotti esperimenti per analizzare i marcatori presenti o assenti sulle vescicole extracellulari. Le EV sono positive per alcuni specifici marcatori di superficie15: CD9, CD63, CD81 e CD44. CD9, CD63 e CD81 appartengono alla famiglia delle tetraspanine e sono i marcatori più comuni per identificare gli esosomi16. CD44 è un marcatore altamente espresso dalle MSC e dalle ASC17.
Le EV sono positive anche per la proteina citosolica Caveolina, come dimostrato dall'esperimento di citometria a flusso intracellulare. Inoltre, il western blot conferma la positività per CD9, CD81, TSG101, Flotillin e la negatività per Calnexin (Figura 2).
Successivamente, gli ASC-EV marcati con CFSE sono stati ordinati come riportato nel protocollo. Questa procedura di smistamento è stata ripetuta quattro volte, mantenendo esattamente le stesse condizioni per la preparazione, la colorazione e lo smistamento del campione (Tabella 1). In questo modo, è stata dimostrata la ripetibilità del protocollo.
È stata eseguita una serie di esperimenti per analizzare la popolazione di ASC-EV selezionata con CFSE e per dimostrare che le loro caratteristiche non sono cambiate con lo smistamento. In particolare, l'espressione di CD9, CD63, CD81 e CD44 non cambia dopo l'ordinamento (Figura 6A).
Un altro punto critico riguarda le dimensioni dei veicoli elettrici e il modo in cui possono cambiare dopo la procedura di selezione a causa dello stress indotto dalla pressione. L'analisi post-smistamento è stata difficile da eseguire a causa della piccola quantità di campione, ma l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle dimostra che la distribuzione dei due campioni ASC-EV (pre e post smistamento) era la stessa (Figura 6B). Infine, l'analisi delle vescicole extracellulari attraverso la TEM dimostra che la loro morfologia non sembra significativamente alterata in seguito allo smistamento (Figura 6C).
Da notare, come suggerito dalle linee guida del quadro MIFlowCyt-EV18, è stata osservata una riduzione della quantità di EV CFSE-positive dopo il trattamento con campione Triton X-100 allo 0,1%, supportando così la loro origine vescicolare (Figura 8).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67232/67232fig07.jpg"> 
Figura 7: Smistamento delle perle di polistirene FSC. (A) Grafico a punti SSC/FITC delle perline prima della cernita. Grafico a punti SSC/FITC delle perle rianalizzate dopo l'ordinamento: (B) perle ordinate da 100 nm, (C) perle ordinate da 300 nm e (D) perle ordinate da 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67232/67232fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67232/67232fig08.jpg"> 
Figura 8: Degradazione della membrana EV in presenza di Triton X-100. Triton X-100 alla concentrazione dello 0,1% è stato aggiunto al campione per 15 minuti a temperatura ambiente. Vengono riportati grafici a dispersione rappresentativi di tre esperimenti indipendenti di campioni non trattati (a sinistra) e trattati (a destra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67232/67232fig08large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rsperimento</td>
			<td>Numero di veicoli elettrici ordinati</td>
			<td>Numero di veicoli elettrici selezionati CFSE+</td>
			<td>Pressione (psi)</td>
			<td>Ugello mm</td>
			<td>Frequenza (Hz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>74 x 106</td>
			<td>4,8 x 106</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>44 x 106</td>
			<td>7 x 106</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>38 x 106</td>
			<td>3 x 106</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>16 x 106</td>
			<td>2 x 106</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Ripetibilità della procedura di cernita

Impostazione di uno smistamento di successo per l'isolamento delle vescicole extracellulari

Extracellular vesicles (EVs) released by mesenchymal stromal cells (MSCs) contain a set of microRNAs with regenerative and anti-inflammatory roles. ...

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