Name: Isolamento e caratterizzazione di esosomi derivati da tessuti di milza di topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Impara un protocollo per isolare esosomi da tessuti di milza di topo usando collagenasi di tipo I e ultracentrifugazione differenziale. Questo metodo preserva l'integrità della membrana per studi sulle malattie cardiovascolari.

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I campioni sono stati ottenuti da topi, con l'approvazione etica concessa dal Comitato Etico della Guangdong Medical University. Descrizioni dettagliate dei materiali, delle attrezzature e del software utilizzati in questo protocollo sono fornite nella Tabella dei materiali. I dettagli della preparazione prima dell'estrazione sono illustrati nella Figura 1, mentre il processo di estrazione e arricchimento della milza-eso, è descritto nella Figura 2.
1. Preparazione
<ol>
	<li>Pre-raffreddare le centrifughe ad alta e altissima velocità a 4 °C e impostare la temperatura di un agitatore da tavolo a 37 °C.</li>
	<li>Preparare piastre per colture cellulari (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">100 mm), provette da centrifuga sterili da 50 mL, ghiaccio e filtro cellulare sterile (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">70 μm) come mostrato nella Figura 1A, B.</li>
	<li>Sterilizzare forbici e pinze utilizzando uno spray alcolico al 75%, seguito da sterilizzazione ad alta temperatura. Questi strumenti sono illustrati nella Figura 1C.</li>
	<li>Mettere il tessuto della milza in una capsula di Petri sterile <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">da 100 mm su ghiaccio e lavare via il sangue superficiale con 1 soluzione salina sterile con tampone di fosfato (PBS) ghiacciata. Asciugare i tessuti della milza con una garza sterile e pesarli dopo l'asciugatura. NOTA: Se il fazzoletto è congelato, scongelarlo in un piatto per 15 minuti con ghiaccio prima di procedere.</li>
	<li>Idratare il filtro cellulare (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">70 μm) versando 1 mL di PBS sterile nel filtro utilizzando una pipetta di trasferimento sterile.</li>
	<li>Preparare il tampone digestivo (0,1% di collagenasi di tipo I) utilizzando 1x PBS con un miscelatore a vortice. NOTA: Utilizzare 10 ml di tampone digestivo per ogni 100 mg di tessuto della milza. La concentrazione di collagenasi è stata scelta in questo studio in base alle istruzioni del prodotto. Per altri tipi di tessuto, i ricercatori potrebbero dover regolare questi parametri in base alla densità e alla composizione dei tessuti. Si raccomandano esperimenti preliminari con concentrazioni e tempi di digestione variabili per determinare le condizioni ottimali per ciascun tipo di tessuto.</li>
</ol>
2. Digestione dei tessuti
<ol>
	<li>Tagliare il tessuto in piccoli pezzi uniformi con le forbici in una piastra di coltura su ghiaccio (Figura 3A) e trasferirlo in una provetta da centrifuga da 50 ml con una pipetta di trasferimento sterile.</li>
	<li>Aggiungere il tampone di digestione alla provetta in base al peso del tessuto della milza come indicato sopra (Figura 3B), quindi agitare la provetta con un angolo di 45° su un agitatore orizzontale a 37 °C. Monitora l'andamento della digestione e ferma la digestione quando i pezzi di tessuto si sono dispersi e la maggior parte ha perso la sua forma. Il tempo di digestione dovrebbe variare tra i tessuti. Nelle condizioni sperimentali di questo studio, il tempo di digestione è di circa 30 minuti.</li>
	<li>Trasferire la miscela digerita in un colino cellulare (Ф70 μm) a temperatura ambiente (RT) per rimuovere i detriti fibrosi e di tessuto più grandi. NOTA: Completare la filtrazione subito dopo la digestione.</li>
	<li>Raccogliere il filtrato in una nuova provetta da centrifuga da 50 mL.</li>
</ol>
3. Isolamento degli esosomi mediante centrifugazione differenziale
<ol>
	<li>Centrifuga filtra a 500 x g per 10 minuti a 4 °C. Dopo la centrifugazione si può vedere un pellet contenente cellule residue, detriti cellulari e nuclei, come mostrato nella Figura 3C.</li>
	<li>Trasferire il surnatante in una nuova provetta e centrifugare a 3000 x g per 20 minuti a 4 °C. Dopo la centrifugazione si può vedere un pellet contenente corpi apoptotici e microsomi, come mostrato nella Figura 3D.</li>
	<li>Trasferire il surnatante in una nuova provetta e centrifugare a 10.000 x g per 30 minuti a 4 °C. Il pellet contenente microvescicole e la membrana plasmatica possono essere visti dopo la centrifugazione, come mostrato nella Figura 3E.</li>
	<li>Ultracentrifugare il surnatante risultante a 120.000 x g per 2 ore a 4 °C. Un pellet può essere visto sul fondo della provetta dopo la centrifugazione, come mostrato nella Figura 3F.</li>
	<li>Scartare il surnatante, lavare il pellet con PBS e centrifugare nuovamente a 120.000 x g per 2 ore a 4 °C per ottenere gli esosomi. Dopo la centrifugazione, è possibile vedere un pellet sul fondo della provetta, come mostrato nella Figura 3G.</li>
	<li>Sciogliere gli esosomi isolati con PBS sterile (200 μl per milza) e conservare gli esosomi isolati in una nuova provetta da centrifuga da 2 ml a -80 °C.</li>
</ol>
4. Caratterizzazione degli esosomi mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
NOTA: TEM è stato utilizzato per determinare se l'Exo estratto mostrava le caratteristiche delle vescicole. I campioni Exo identificati al microscopio elettronico devono essere campioni freschi o conservati brevemente a 4 °C per un breve periodo.
<ol>
	<li>Fissare gli esosomi (2-6 μg/μL) con paraformaldeide al 2% al microscopio elettronico (EM) a RT per 2 ore.</li>
	<li>Porre 10 μL di soluzione di esosoma su una rete di rame, incubare a RT per 10 minuti, sciacquare con acqua distillata sterile e tamponare il liquido in eccesso con carta assorbente.</li>
	<li>Colorare la rete di rame con acetato di uranile al 2% per 1 minuto, tamponare il liquido in eccesso con carta da filtro e asciugare sotto una lampada a incandescenza per 2 minuti.</li>
	<li>Osservare il campione preparato al microscopio elettronico a trasmissione a 80 kV.</li>
</ol>
5. Distribuzione dimensionale e misurazione della concentrazione di particelle degli esosomi
<ol>
	<li>Caricare le nanoparticelle standard di polistirene (250 nm) sul citometro a nanoflusso.</li>
	<li>Misurare la concentrazione proteica dei campioni Exo utilizzando un kit per il dosaggio delle proteine BCA. Diluire il campione Exo con PBS in base ai risultati del test delle proteine BCA (diluire gli esosomi a 1-10 ng/μL), quindi caricare i campioni Exo nel nanoflusso per misurare l'intensità di dispersione laterale (SSI).</li>
	<li>Calcolare Concentrazione di exo in base al rapporto tra SSI e concentrazione di particelle nelle nanoparticelle standard di polistirene. NOTA: Per la misurazione delle dimensioni, viene generata una curva standard caricando nanoparticelle di silice standard con dimensioni del gradiente (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) sul citometro a flusso nanometrico. Di seguito è riportato il caricamento dell'esempio Exo. La distribuzione dimensionale di Exo è stata calcolata secondo la cura standard.</li>
</ol>
6. Lisi e conferma dell'immunoblot delle proteine esosomiche
<ol>
	<li>Aggiungere 100 μl di tampone di lisi per test di radioimmunoprecipitazione (RIPA) al pellet dell'esosoma per l'analisi delle proteine.</li>
	<li>Agitare energicamente, coprire con parafilm, oscillare per 20 minuti a RT, quindi agitare di nuovo.</li>
	<li>Centrifugare brevemente a 1000 x g per 30-60 s per raccogliere il campione, trasferirlo in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e conservarlo a una temperatura compresa tra -20 °C e -80 °C fino all'analisi.</li>
	<li>Per l'immunoblot, mescolare i campioni con un tampone di caricamento 5x per ottenere una concentrazione 1x e prepararsi per l'elettroforesi su gel.</li>
	<li>Se si desidera controllare l'omogeneizzato dell'intero tessuto, utilizzare un tampone di lisi forte con un inibitore della proteasi per lisare il tessuto, come descritto sopra. Quindi, centrifugare i campioni a 10.000 x g per 10 minuti e scartare la matrice extracellulare rimanente, le cellule intere o i detriti cellulari intatti.</li>
	<li>Far bollire il tampone del campione contenente esosomi o omogeneizzato di tessuto a 95 °C per 5-10 minuti. Caricare la stessa quantità di proteine per corsia in un gel SDS-PAGE al 10%. Carico uguale proteina di tessuto omogenato come controllo.</li>
	<li>Procedere con l'elettroforesi su gel sotto una tensione di 80 V per circa 2 ore utilizzando il tampone per elettroforesi convenzionale. Eseguire l'analisi western blot per confermare l'espressione della proteina Exo nei lisati purificati e confrontare l'abbondanza relativa di Exo in frazioni.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Tecniche di affinamento per l'isolamento di esosomi derivati dalla milza murina

<ol><li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Curr Biol. 28 (8), R435-R444 (2018).</li>
<li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).</li>
<li>Crescitelli, R., Lasser, C., Lotvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicle+subpopulations+from+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues.</a> Nat Protoc. 16 (3), 1548-1580 (2021).</li>
<li>de Jong, B., Barros, E. R., Hoenderop, J. G. J., Rigalli, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+extracellular+vesicles+as+drug+delivery+systems+and+their+potential+in+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Recent advances in extracellular vesicles as drug delivery systems and their potential in precision medicine.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1006(2020).</li>
<li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpopulations+of+extracellular+vesicles+from+human+metastatic+melanoma+tissue+identified+by+quantitative+proteomics+after+optimized+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.</a> J Extracell Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).</li>
<li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Front Mol Biosci. 7, 33(2020).</li>
<li>Leung, L. L., Riaz, M. K., Qu, X., Chan, J., Meehan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+extracellular+vesicles+in+oral+cancer%2C+from+transcriptomics+to+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Profiling of extracellular vesicles in oral cancer, from transcriptomics to proteomics.</a> Semin Cancer Biol. 74, 3-23 (2021).</li>
<li>Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+extracellular+vesicles+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating extracellular vesicles in human disease.</a> N Engl J Med. 379 (10), 958-966 (2018).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enrichment+method+for+small+extracellular+vesicles+derived+from+liver+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue.</a> J Vis Exp. (192), e64499(2023).</li>
<li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> J Extracell Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).</li>
<li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+and+particle+biomarkers+define+multiple+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle and particle biomarkers define multiple human cancers.</a> Cell. 182 (4), 1044-1061.e18 (2020).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yiwei+decoction+promotes+apoptosis+of+gastric+cancer+cells+through+spleen-derived+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Yiwei decoction promotes apoptosis of gastric cancer cells through spleen-derived exosomes.</a> Front Pharmacol. 14, 1144955(2023).</li>
<li>Useckaite, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+paired+human+liver+homogenate+and+tissue-derived+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of paired human liver homogenate and tissue-derived extracellular vesicles.</a> Proteomics. 24 (11), e2300025(2023).</li>
<li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+enrichment+of+whole+brain-derived+extracellular+vesicles+reveals+insight+into+neurodegenerative+processes+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci Methods. 307, 210-220 (2018).</li>
<li>Lai, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+processing+and+characterization+approaches+for+research+and+technology+development%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Exosome processing and characterization approaches for research and technology development.</a> Adv Sci (Weinh). 9 (15), e2103222(2022).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome%3A+A+review+of+its+classification%2C+isolation+techniques%2C+storage%2C+diagnostic+and+targeted+therapy+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications.</a> Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).</li>
<li>Roh, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+exosomes+alleviate+particulate+matter-induced+inflammatory+response+and+skin+barrier+damage+in+atopic+dermatitis-like+triple-cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived exosomes alleviate particulate matter-induced inflammatory response and skin barrier damage in atopic dermatitis-like triple-cell model.</a> PLoS One. 19 (1), e0292050(2024).</li>
<li>Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+extracellular+vesicles+from+tissues+of+the+central+nervous+system+by+PROSPR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR.</a> Mol Neurodegener. 11 (1), 41(2016).</li>
<li>Kurian, T. K., Banik, S., Gopal, D., Chakrabarti, S., Mazumder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+methods+for+isolation+and+quantification+of+exosomes%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Elucidating methods for isolation and quantification of exosomes: A review.</a> Mol Biotechnol. 63 (4), 249-266 (2021).</li>
<li>Menu, E., Vanderkerken, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+multiple+myeloma%3A+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Exosomes in multiple myeloma: from bench to bedside.</a> Blood. 140 (23), 2429-2442 (2022).</li>
<li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+lysate%2Ftissue+storage+at+-80+degrees+C+on+subsequently+extracted+EVs+of+epithelial+ovarian+cancer+tissue+origins%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Effects of lysate/tissue storage at -80 degrees C on subsequently extracted EVs of epithelial ovarian cancer tissue origins.</a> iScience. 26 (4), 106521(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>70 &micro; m Cell Strainer</td><td>Biologix Group Co., Ltd.USA</td><td>15-1070</td><td></td></tr><tr><td>Anti CD9 anticorpo</td><td>Cell Signaling Technology, Inc (CST), USA</td><td>983275</td><td></td></tr><tr><td>Anti GM130 anticorpo</td><td>Proteintech Group, Inc.China&nbsp;</td><td>66662-1-lg</td><td></td></tr><tr><td>Anti TSG101 anticorpo</td><td>Abcam Plc, Regno Unito</td><td>125011</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, Cina</td><td>704001</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per centrifuga</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, Cina</td><td>788211</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo I</td><td>Sigma-Aldrich Corp., USA</td><td>C2674</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore</td> <td>termostatico da tavoloShanghai bluepard instruments Co., Ltd., Cina</td><td>THZ-100</td><td></td></tr><tr><td>tampone per elettroforesi</td><td>Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Cina</td>Kit di analisi della proteina BCA potenziato <td>G2081-1L</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Cina&nbsp;</td><td>P0010S</td><td></td></tr><tr><td>Flow NanoAnalyzer</td><td>NanoFCM Inc., Cina</td><td>N30E</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di imaging a fluorescenza/chemiluminescenza.</td><td>Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., Cina</td><td>GelView 6000Plus</td><td></td></tr><tr><td>HRP Capra anti-Topo IgG</td><td>Proteintech Group, Inc.China&nbsp;</td><td>15014</td><td></td></tr><tr><td>HRP capra anti-coniglio IgG Proteintech</td><td>Group, Inc.Cina&nbsp;</td><td>15015</td><td></td></tr><tr><td>lettore di micropiastre</td><td>Molecular Devices, USA</td><td>CMax Plus</td><td></td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>Shanghai&nbsp; Medico&nbsp; Strumenti (gruppo)&nbsp;Co., Ltd.,Cina</td><td>WA1010</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette microscopiche</td><td>Shanghai&nbsp; Medico&nbsp; Strumenti (gruppo)&nbsp;Co., Ltd.,China</td><td>WA3010</td><td></td></tr><tr><td>Multifuge X1R Pro centrifuga</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>75009750</td><td></td></tr><tr><td>Forbici oftalmiche</td><td>Shanghai&nbsp; Medico&nbsp; Strumenti (gruppo)&nbsp;Co., Ltd.,Cina</td><td>Y00030</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette oftalmiche</td><td>Shanghai&nbsp; Medico&nbsp; Strumenti (Gruppo)&nbsp;Co., Ltd., Cina&nbsp;</td><td>JD1060</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-100 Centrifuga di ultrafiltrazione</td><td>Beckman Coulter, USA</td><td>A94469</td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Cina</td> tampone di lisi <td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>RIPA (forte, senza inibitori)</td><td>Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Cina&nbsp;</td><td>P0013K</td><td></td></tr><tr><td>Righello</td><td>Deli&nbsp; Produzione&nbsp; Azienda, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Buffer di caricamento del campione, 5x</td><td>Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Cina&nbsp;</td><td>P0015</td><td></td></tr><tr><td>Trasferimento Pipet</td><td>Biologix Group Co., Ltd.USA</td><td>30-0238A1</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a trasmissione</td><td>Hitachi, Giappone</td><td>H-7650</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per ultracentrifugazione</td><td>Beckman Coulter, USA</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td>Western Transfer Buffer&nbsp;</td><td>Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Cina&nbsp;</td><td>G2028-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e caratterizzazione di esosomi derivati da tessuti di milza di topo

Isolation and Characterization of Exosomes Derived from Mouse Spleen Tissues

Isolamento e purificazione di esosomi derivati dalla milza Per isolare gli esosomi dal tessuto della milza di topo, abbiamo impiegato una combinazione di digestione della collagenasi e ultracentrifugazione differenziale (Figura 2). Le fasi iniziali prevedevano il pretrattamento del tessuto della milza per rimuovere il sangue superficiale, seguito dalla digestione con collagenasi di tipo I. Questo trattamento enzimatico ha facilitato la rottura dei componenti della matrice extracellulare, liberando così gli esosomi preservandone l'integrità. Dopo la digestione, sono state impiegate una serie di fasi di centrifugazione per rimuovere in sequenza i detriti cellulari, i corpi apoptotici e le vescicole più grandi, culminando nell'ultracentrifugazione del surnatante a 120.000 x g per pellettare gli esosomi. Le successive procedure di isolamento hanno prodotto pellet solubili in PBS arricchiti con Exo derivato dalla milza, come mostrato nella Figura 3G.
Risultati TEM La morfologia degli esosomi isolati è stata esaminata utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione, un metodo gold standard per studiare la caratterizzazione degli esosomi. La TEM è comunemente usata per convalidare la presenza di esosomi, valutare la qualità degli esosomi e osservare la morfologia degli esosomi. Le immagini TEM (Figura 4A) hanno rivelato la presenza di vescicole a forma di coppa, caratteristiche degli esosomi. Queste vescicole hanno mostrato una chiara struttura a doppio strato lipidico, confermando il successo dell'isolamento degli esosomi dal tessuto della milza.
Distribuzione delle dimensioni di Spleen-Exo La distribuzione dimensionale e la concentrazione degli esosomi sono state determinate utilizzando un citometro a nanoflusso. I risultati (Figura 4B) hanno indicato che il diametro degli esosomi isolati variava da 30 a 150 nm, con una concentrazione di picco a circa 60 nm. Il diametro delle particelle isolate era prevalentemente compreso tra 50 e 80 nm, con una concentrazione media di particelle di 4,6 x 109 particelle/mL. Questo intervallo di dimensioni è coerente con le caratteristiche precedentemente riportate degli esosomi, convalidando ulteriormente il protocollo di isolamento.
Analisi del western blot Per confermare la presenza di marcatori esosomiali, abbiamo eseguito un'analisi western blot. I marcatori esosomiali TSG101 e CD9 sono stati rilevati nei campioni di Spleen-Exo, mentre GM130, una proteina della matrice di Golgi utilizzata come controllo negativo, non è stata rilevata (Figura 4C). In confronto, la proteina di questi marcatori era espressa nei tessuti della milza di topo (Spleen-T). Ciò indica l'elevata purezza degli esosomi isolati, in quanto privi di contaminanti cellulari.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig01.jpg"> 
Figura 1: Preparazione dell'alimentazione. (A) Provette da centrifuga da 50 mL, piastre di coltura, ghiaccio e strumenti chirurgici sono stati collocati in una cabina di biosicurezza. (B) Un filtro cellulare sterile (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">70 μm). (C) Strumenti chirurgici sterilizzati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig02.jpg"> 
Figura 2: Procedura di isolamento Spleen-Exo. Preparare il tessuto della milza e tagliarlo a pezzetti in PBS ghiacciato, seguito dalla digestione con collagenasi di tipo I e dalla centrifugazione come indicato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig03.jpg"> 
Figura 3: Immagini rappresentative dell'isolamento milza-eso. (A) Piccoli blocchi di milza pronti per la successiva digestione. (B) Blocchi di tessuto della milza con tampone per la digestione. (C) Pellet dopo centrifugazione 500 x g . (D) Pellet dopo 3.000 x g di centrifugazione. (E) Pellet dopo 10.000 x g di centrifugazione. (F) Pellet dopo 120.000 x g di centrifugazione. (G) Pellet di esosomi dopo centrifugazione 120.000 x g . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig04.jpg"> 
Figura 4: Identificazione di Spleen-Exo. (A) I risultati TEM mostrano particelle isolate come vescicole membranose rotonde o ovali con morfologia a coppa. Barra della scala = 200 nm e 50 nm, rispettivamente. (B) L'analisi della distribuzione dimensionale mediante Flow Nano Analyzer ha mostrato che il diametro di Spleen-Exo variava prevalentemente da 50 nm a 80 nm, con una concentrazione media di particelle di 4,6 × 109 particelle/mL. (C) Analisi Western blot che mostra l'espressione di proteine marcatrici specifiche per gli esosomi (TSG101 e CD9) in Spleen-Exo, con espressione negativa di GM130. Questi marcatori erano rilevabili in campioni proteici estratti dalla milza di topo (gruppo Milza-T). Sono state mostrate le immagini rappresentative del western blot (n = 6 tessuti). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Isolamento e caratterizzazione di esosomi derivati da tessuti di milza di topo

Exosomes (Exo) are lipid-bilayer structures secreted by various cells, including those of animals, plants, and prokaryotes. Previous studies have revealed ...

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Questo video descrive un semplice, di risparmiare tempo tecnica per la dissociazione dei tessuti automatizzato mediante il dissociatore gentleMACS per preparare cella singola sospensioni di splenociti mouse.

Preparazione di Single-Cell Sospensioni da Spleen mouse con il dissociatore gentleMACS

In questo documento vengono utilizzati dei metodi per la purificazione isolamento, e la rilevazione di esosomi, nonché le tecniche per l'analisi del loro contenuto molecolare. Questi metodi sono adattabili per l'isolamento exosome da supporti sia la cultura di cellule e fluidi biologici, e può al di là di analisi del contenuto molecolare essere utile anche per studi funzionali.

Isolamento e caratterizzazione di RNA contenenti esosomi

In questo articolo dimostriamo l'isolamento di cellule staminali murine residente polmone mesenchimali (MSC polmone), la loro espansione, caratterizzazione e analisi delle proprietà immunomodulanti.

Isolamento e caratterizzazione di Hoechst Basso CD45 Negativo Mouse cellule staminali mesenchimali del polmone

La presenza di microRNA stabili (miRNA) in exosomes ha generato enorme interesse come un romanzo modalità di comunicazione intercellulare, per la loro potenziale utilità come biomarcatori e come via per l'intervento terapeutico. Qui mostriamo purificazione exosome dal sangue e cultura mediatica seguita da PCR quantitativa per identificare miRNA trasportati.

Purificazione e microRNA profiling di Exosomes derivati ​​dal sangue e cultura dei media

Vengono descritte le tecniche che descrivono una procedura a gradiente per separare gli esosomi dalle particelle del virus dell'immunodeficienza umana (HIV). Questa procedura è stata utilizzata per isolare gli esosomi dalle particelle di HIV nel plasma umano da individui infetti da HIV. Gli esosomi isolati sono stati analizzati per il contenuto di citochine/chemochine.

Isolamento di esosomi dal plasma di HIV-1 individui positivi

Il fluido biliare è una preziosa fonte di vescicole/esosomi extracellulari che contengono biomarcatori potenzialmente importanti. Questo protocollo rappresenta un metodo robusto per isolare gli esosomi dalla bile umana per ulteriori analisi, tra cui la profilazione dei miRNA.

Isolamento e Profiling di MicroRNA contenenti Esosomi da bile umana

Qui, presentiamo un protocollo per isolare le cellule dendritiche da murine milze di ordinamento magnetico delle cellule e successivo trasferimento adottivo in topi ingenuo. Il modello delle cellule dendritiche attivate di alto-sale è stato scelto per spiegare le procedure dettagliate di trasferimento adottivo e citometria a flusso.

Isolamento e trasferimento adottivo di sale alta trattati cellule dendritiche presentanti l'antigene

Questo protocollo illustra 1) l'isolamento e la coltura di fibroblasti primari dal muscolo gastrocnemio di topo adulto e 2) la purificazione e la caratterizzazione degli esosomi utilizzando un metodo di ultracentrifugazione differenziale combinato con gradienti di densità del saccarosio seguito da analisi western blot.

Isolamento e caratterizzazione di esosomi da fibroblasti muscolari scheletrici

Qui delineiamo e dimostriamo un protocollo per l'isolamento primario delle cellule endoteliali sinusoidali epatiche del topo (LSEC). Il protocollo si basa sulla perfusione di collagenasi epatica, sulla purificazione delle cellule non parenchimali mediante centrifugazione a bassa velocità e sulla selezione magnetica delle perline CD146. Abbiamo anche fenotipo e caratterizzato questi LSECs isolati utilizzando la citometria a flusso e la microscopia elettronica a scansione.

Isolamento e caratterizzazione di cellule endoteliali sinusoidali primarie del fegato di topo

Questo studio utilizza la citometria a flusso e due diverse strategie di gating su plessi coroidi cerebrali di topi perfusi isolati; questo protocollo identifica i principali sottoinsiemi di cellule immunitarie che popolano questa struttura cerebrale.

Isolamento e caratterizzazione delle cellule immunitarie da plessi coroidi di topo microsezionati

Impara un protocollo per isolare esosomi da tessuti di milza di topo usando collagenasi di tipo I e ultracentrifugazione differenziale. Questo metodo preserva l'integrità della membrana per studi sulle malattie cardiovascolari.

Isolamento e caratterizzazione di esosomi derivati da tessuti di milza di topo

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