Isolamento e caratterizzazione di esosomi derivati da tessuti di milza di topo

Gli esosomi derivati dai tessuti hanno attirato una crescente attenzione grazie alla loro capacità di riflettere accuratamente la specificità dei tessuti e il microambiente. La nostra ricerca si è concentrata sulla comprensione dei ruoli di base e traslazionali degli esosomi derivati dalla milza nelle malattie cardiovascolari. In questo studio, sviluppiamo un protocollo pratico per isolare gli esosomi dai tessuti della milza dei topi, fornendo una tecnica riproducibile per successive analisi di identificazione e studi funzionali.

Utilizziamo una collagenasi di tipo I per la digestione, seguita da filtrazione attraverso ultracentrifugazione differenziale per produrre esosomi di milza di alta qualità. A differenza di quanto riportato in precedenza, utilizzando l'omogeneizzazione tissutale per ottenere la sospensione tissutale, il nostro approccio preserva l'integrità della membrana delle cellule nei tessuti. Questa tecnica potrebbe essere particolarmente utile nello studio del ruolo dell'esosoma nelle risposte immunitarie.

Data la funzione critica della milza nel sistema immunitario, studi futuri potrebbero adattare questo protocollo ai tessuti umani, consentendo l'estrazione di esosomi clinicamente rilevanti per scopi diagnostici e terapeutici. Per iniziare, preraffreddare le centrifughe ad alta e altissima velocità a quattro gradi Celsius e impostare la temperatura dell'agitatore da tavolo a 37 gradi Celsius. Preparare i piatti di coltura cellulare, con un diametro di 100 millimetri.

Quindi, disporre provette da centrifuga sterili da 50 millilitri, ghiaccio e filtri cellulari sterili con un diametro di 70 micrometri. Spruzzare il 75% di alcol per sterilizzare le forbici e le pinze e riscaldarle ad alta temperatura per sterilizzarle ulteriormente. Quindi, posizionare il tessuto della milza in una capsula di Petri sterile da 100 millimetri su ghiaccio e lavare via il sangue superficiale con 1X PBS freddo.

Asciugare accuratamente la milza con una garza sterile prima di pesare i fazzoletti. Quindi, utilizzando una pipetta di trasferimento sterile, aggiungere un millilitro di PBS a un colino cellulare da 70 micrometri per inumidirlo. Infine, preparare la collagenasi di tipo I allo 0,1% in 1X PBS con un miscelatore a vortice per ottenere il tampone di digestione.

Per iniziare, preparare i reagenti e gli strumenti sterili per il trattamento dei tessuti. Con le forbici, tagliare il tessuto della milza in pezzi piccoli e uniformi in una capsula di coltura su ghiaccio e trasferirli in una provetta da centrifuga da 50 millilitri utilizzando una pipetta di trasferimento sterile. Quindi, aggiungere il tampone di digestione al tubo in base al peso del tessuto della milza e agitare il tubo a un angolo di 45 gradi su uno shaker orizzontale impostato a 37 gradi Celsius.

Interrompere la digestione quando i pezzi di tessuto si sono dispersi e la maggior parte dei pezzi ha perso la sua forma. Trasferire la miscela digerita attraverso un colino cellulare da 70 micrometri a temperatura ambiente per rimuovere i detriti fibrosi e di tessuto più grandi. Raccogliere il filtrato in una nuova provetta da centrifuga da 50 millilitri.

Centrifugare il filtrato a 500 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, trasferire il surnatante in una nuova provetta e ripetere la fase di centrifugazione a velocità appropriate. Dopo l'ultracentrifugazione, scartare il surnatante e lavare il pellet con PBS.

Ultracentrifugare nuovamente a 120.000 G per due ore a quattro gradi Celsius per isolare gli esosomi. Infine, sciogliere gli esosomi isolati in 200 microlitri di PBS sterile per milza e conservarli in una provetta da centrifuga da due millilitri a meno 80 gradi Celsius. Le immagini al microscopio elettronico a trasmissione hanno rivelato la presenza di vescicole a forma di coppa con un doppio strato lipidico, caratteristico degli esosomi.

Le dimensioni degli esosomi variavano da 30 a 150 nanometri con una concentrazione di picco a 60 nanometri, come mostrato dal grafico della distribuzione dimensionale. L'analisi Western blot ha confermato la presenza di marcatori esosomiali, TSG101 e CD9, mentre GM130 e il controllo negativo non sono stati rilevati.