Name: Caratterizzazione completa della mineralizzazione tissutale in un modello ex vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Scopri la caratterizzazione completa della mineralizzazione tissutale per la rigenerazione ossea utilizzando modelli ex vivo. Questo metodo multimodale con micro-CT e nanoindentazione aiuta a identificare candidati promettenti per terapie rigenerative.

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<meta charset="utf8"></head><body>Analisi multimodale della formazione ossea utilizzando modelli di espianto

<ol><li>Feroz, S., Cathro, P., Ivanovski, S., Muhammad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+bone+grafts+and+substitutes%3A+A+review+of+recent+advancements+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Adv%22%5BJournal%5D)">Biomimetic bone grafts and substitutes: A review of recent advancements and applications.</a> Biomed Eng Adv. 6, 100107(2023).</li>
<li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP2+activity%2C+although+dispensable+for+bone+formation%2C+is+required+for+the+initiation+of+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">BMP2 activity, although dispensable for bone formation, is required for the initiation of fracture healing.</a> Nat Genet. 38 (12), 1424-1429 (2006).</li>
<li>Hadjidakis, D. J., Androulakis, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boneremodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Boneremodeling.</a> Ann N Y Acad Sci. 1092, 385-396 (2006).</li>
<li>Boivin, G., Meunier, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+degree+of+mineralization+of+bone+tissue+measured+by+computerized+quantitative+contact+microradiography%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tiss+Int%22%5BJournal%5D)">The degree of mineralization of bone tissue measured by computerized quantitative contact microradiography.</a> Calcified Tiss Int. 70 (6), 503-511 (2002).</li>
<li>Boivin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+remodeling+on+the+mineralization+of+bone+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporo+Int%22%5BJournal%5D)">Influence of remodeling on the mineralization of bone tissue.</a> Osteoporo Int. 20 (6), 1023-1026 (2009).</li>
<li>Zanghellini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+analysis+and+comparison+of+stoichiometric+and+structural+characteristics+of+parosteal+and+conventional+osteosarcoma+with+massive+sclerosis+in+human+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Multimodal analysis and comparison of stoichiometric and structural characteristics of parosteal and conventional osteosarcoma with massive sclerosis in human bone.</a> J Str Biol. 216 (3), 108106(2024).</li>
<li>Trento, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((formation+around+two+titanium+implant+surfaces+placed+in+bone+defects+with+and+without+a+bone+substitute+material%3A+A+histological%2C+histomorphometric%2C+and+micro-computed+tomography+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Implant+Dent+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">formation around two titanium implant surfaces placed in bone defects with and without a bone substitute material: A histological, histomorphometric, and micro-computed tomography evaluation.</a> Clin Implant Dent Relat Res. 22 (2), 177-185 (2020).</li>
<li>Palmquist, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiscale+analytical+approach+to+evaluate+osseointegration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Sci+Mater+Med%22%5BJournal%5D)">A multiscale analytical approach to evaluate osseointegration.</a> J Mater Sci Mater Med. 29 (5), 60(2018).</li>
<li>Budán, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+radiomics+evaluation+of+bone+formation+utilizing+multimodal+%28SPECT%2FX-ray+CT%29+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Novel radiomics evaluation of bone formation utilizing multimodal (SPECT/X-ray CT) in vivo imaging.</a> PLoS ONE. 13 (9), e0204423(2018).</li>
<li>Hulsart-Billström, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surprisingly+poor+correlation+between+in+vitro+and+in+vivo+testing+of+biomaterials+for+bone+regeneration%3A+results+of+a+multicentre+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cells+Mater%22%5BJournal%5D)">A surprisingly poor correlation between in vitro and in vivo testing of biomaterials for bone regeneration: results of a multicentre analysis.</a> Eur Cells Mater. 31, 312-322 (2016).</li>
<li>Cramer, E. E. A., Ito, K., Hofmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+bone+models+and+their+potential+in+preclinical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Osteoporo+Rep%22%5BJournal%5D)">Ex vivo bone models and their potential in preclinical evaluation.</a> Curr Osteoporo Rep. 19 (1), 75-87 (2021).</li>
<li>Chan, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+trabecular+bone+explant+model+of+osteocyte-osteoblast+co-culture+for+bone+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A trabecular bone explant model of osteocyte-osteoblast co-culture for bone mechanobiology.</a> Cell Mol Bioeng. 2 (3), 405-415 (2009).</li>
<li>Doke, S. K., Dhawale, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatives+to+animal+testing%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+Pharma+J%22%5BJournal%5D)">Alternatives to animal testing: A review.</a> Saudi Pharma J. 23 (3), 223-229 (2015).</li>
<li>Moussi, H., et al. New formulation of injectable and degradable calcium phosphate/silanized hyaluronic acid composite foam: Investigation in a rabbit model of long bone defect. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoussi%2C+H+%22SSRN%22">SSRN</a>. , (2024).</li>
<li>Paré, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+and+axially+vascularized+calcium+phosphate-based+implants+for+segmental+mandibular+defects%3A+A+promising+proof+of+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Standardized and axially vascularized calcium phosphate-based implants for segmental mandibular defects: A promising proof of concept.</a> Acta Biomater. 154, 626-640 (2022).</li>
<li>Roschger, P., Fratzl, P., Eschberger, J., Klaushofer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+quantitative+backscattered+electron+imaging+for+the+measurement+of+mineral+density+distribution+in+human+bone+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Validation of quantitative backscattered electron imaging for the measurement of mineral density distribution in human bone biopsies.</a> Bone. 23 (4), 319-326 (1998).</li>
<li>Roschger, P., Plenk, H., Klaushofer, K., Eschberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+scanning+electron+microscopy+approach+to+the+quantification+of+bone+mineral+distribution%3A+backscattered+electron+image+grey-levels+correlated+to+calcium+K+alpha-line+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Micro%22%5BJournal%5D)">A new scanning electron microscopy approach to the quantification of bone mineral distribution: backscattered electron image grey-levels correlated to calcium K alpha-line intensities.</a> Scanning Micro. 9 (1), 75-86 (1995).</li>
<li>Porter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+and+inexpensive+paraffin-embedding+method+for+dynamic+bone+formation+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quick and inexpensive paraffin-embedding method for dynamic bone formation analyses.</a> Sci Rep. 7, 42505(2017).</li>
<li>Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Undecalcified+bone+preparation+for+histology%2C+histomorphometry+and+fluorochrome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis.</a> J Vis Exp. (35), e1707(2010).</li>
<li>Kazanci, M., Roschger, P., Paschalis, E. P., Klaushofer, K., Fratzl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+osteonal+tissues+by+Raman+spectral+mapping%3A+Orientation-composition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Bone osteonal tissues by Raman spectral mapping: Orientation-composition.</a> J Str Biol. 156 (3), 489-496 (2006).</li>
<li>Unal, M., Ahmed, R., Mahadevan-Jansen, A., Nyman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+assessment+of+bone+by+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Compositional assessment of bone by Raman spectroscopy.</a> Analyst. 146 (24), 7464-7490 (2021).</li>
<li>Oliver, W. C., Pharr, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+technique+for+determining+hardness+and+elastic+modulus+using+load+and+displacement+sensing+indentation+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">An improved technique for determining hardness and elastic modulus using load and displacement sensing indentation experiments.</a> J Mater Res. 7 (6), 1564-1583 (1992).</li>
<li>Proffen, B. L., McElfresh, M., Fleming, B. C., Murray, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+anatomical+study+of+the+human+knee+and+six+animal+species%5BTitle%5D)+AND+%22Knee%22%5BJournal%5D)">A comparative anatomical study of the human knee and six animal species.</a> Knee. 19 (4), 493-499 (2012).</li>
<li>Allen, M. J., Houlton, J. E. F., Adams, S. B., Rushton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surgical+anatomy+of+the+stifle+joint+in+Sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Surg%22%5BJournal%5D)">The surgical anatomy of the stifle joint in Sheep.</a> Vet Surg. 27 (6), 596-605 (1998).</li>
<li>Kleuskens, M. W. A., van Donkelaar, C. C., Kock, L. M., Janssen, R. P. A., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+human+osteochondral+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ortho+Res%22%5BJournal%5D)">An ex vivo human osteochondral culture model.</a> J Ortho Res. 39 (4), 871-879 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.20 filtri</td><td>VWR&nbsp;</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>Ago da 18 G (1,2x40 mm)</td><td>Siringa Sterican</td><td>4665120</td><td></td></tr><tr><td>3 mL</td><td>HENKE-JECT</td><td>8300005762</td><td></td></tr><tr><td>acido cloridrico al 37%&nbsp;</td><td>VWR</td><td>1.00317.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico (glaciale)&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A6283&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Acetone&nbsp;</td><td>VWR</td><td>20063-365&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>VWR</td><td></td><td></td>361186</tr><tr><td>Idrossido di ammonio</td><td>VWR&nbsp;</td><td></td><td></td>318612</tr><tr><td>Fosfato tricalcico apatitico&nbsp;</td><td>Centro di Ingegneria Biomedica e Sanitaria (Miniere di Saint Etienne, Francia)</td><td>TV26U&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Azophloxine</td><td>Sigma</td><td></td><td></td>210633</tr><tr><td>Perossido di benzoile</td><td>Sigma</td><td>8.01641.0250</td><td></td></tr><tr><td>BMP2</td><td>Medtronic&nbsp;</td><td>InductOs 1,5 mg/mL</td><td></td></tr><tr><td>Crocein brillante&nbsp;</td><td>Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>2107507</tr><tr><td>CTVox&nbsp;</td><td>Bruker-DataViewer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Skyscan-Disco</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>diamantato</td><td>Struers</td><td>MOD13</td><td></td></tr><tr><td>Sega diamantata</td><td>Struers</td><td>Accutom-50</td><td></td></tr><tr><td>DiaPro Mol B3 soluzione diamantata</td><td>Struers</td><td>40600379</td><td></td></tr><tr><td>DiaPro Nap B1 soluzione diamantata</td><td>Struers</td><td>40600373</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>102404598</tr><tr><td>Dibutilftalato</td><td>Chimie-Plus Laboratoires</td><td>28656</td><td></td></tr><tr><td>DragonFly software&nbsp;</td><td>ORS</td><td>2022.1.0.1231.&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ad alto contenuto di glucosio, GlutaMAX(TM), piruvato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Eosina Y- Surgipath&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>1002830105</tr><tr><td>Eritrosina B</td><td>Sigma</td><td></td><td></td>102141057</tr><tr><td>Etanolo assoluto</td><td>VWR&nbsp;</td><td></td><td></td>20820362</tr><tr><td>Eukitt</td><td>Dutscher</td><td>6.00.01.0003.06.01.01</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro ferrico esaidrato (FeCl3, 6H2O)&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.03943.0250</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)&nbsp;</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF00</td><td></td></tr><tr><td>Acido fucsino</td><td>Merck</td><td>1.05231.0025&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)</td><td>Biosieri</td><td>MS01NG100J</td><td></td></tr><tr><td>ematossilina</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>86.118.9&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pressa isostatica</td><td>Nova Suisse</td><td>Pmax 1500 bar</td><td></td></tr><tr><td>Granulometria a diffrazione laser</td><td> Malvern</td><td>Mastersizer 3000</td><td></td></tr><tr><td>Verde chiaro</td><td>Prolabo</td><td></td><td></td>28947135</tr><tr><td>Carbonato di litio</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A13149&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MD-Mol panno per lucidare</td><td>Struers</td><td>40500077</td><td></td></tr><tr><td>Metilcicloesano</td><td>VWR</td><td>8.06147.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Metilcicloesano&nbsp;</td><td>VWR</td><td>8.06147.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Metilcicloesano&nbsp;</td><td>VWR</td><td>8.06147.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Metilmetacrilato</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>8.00590.2500</td><td></td></tr><tr><td>Micro-CT, micro-scanner&nbsp;</td><td>Bruker</td><td>Skyscan 1272</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico (NAH2PO4)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>71496</td><td></td></tr><tr><td>Mortaio</td><td>Fritsch&nbsp;</td><td>Pulverisette 6</td><td></td></tr><tr><td>N,N, Dimetilanilina</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>803060</td><td></td></tr><tr><td>Stazione di nanoindentazione</td><td>Anton Paar</td><td>NHT2</td><td></td></tr><tr><td>ND-Nap panno per lucidatura</td><td>Struers</td><td>40500080</td><td></td></tr><tr><td>OATS Set di sistemi di trasferimento autotrapianto osteocondrale, 4,75 mm</td><td>Arthrex</td><td>AR-1981-04S</td><td></td></tr><tr><td>OATS Set di sistemi di trasferimento autotrapianto osteocondrale, 8 mm</td><td>Arthrex</td><td>AR-1981-08S</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Ral</td><td>M15</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Stampi per inclusione monouso Peel-a-way</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18646C-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina (P/S)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Acido fosfomolibdico&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>221856-100 g</td><td></td></tr><tr><td>Acido fosfotungstico</td><td>Aldrich</td><td>Codice 12863-5&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lucidatrice</td><td>Sturers</td><td>Dap V</td><td></td></tr><tr><td>Poupinel</td><td>MEMMERT</td><td>TV26U&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microspettrometro Raman</td><td>Renishaw</td><td>InVia Qontor</td><td></td></tr><tr><td>Safran du G&acirc; tinais&nbsp;</td><td>Labonord&nbsp;</td><td></td><td></td>11507737</tr><tr><td>Microscopio elettronico a scansione</td><td>Carl Zeiss</td><td>Evo LS 10</td><td></td></tr><tr><td>SEM</td><td>Zeiss</td><td>Carl Zeiss Evo LS10</td><td></td></tr><tr><td>SiC lamine/Carte abrasive</td><td>Struers</td><td>40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000)</td><td></td></tr><tr><td>Vernice d'argento</td><td>Microscopia elettronica</td><td>12686-15</td><td></td></tr><tr><td>Tronchetto standard con coppa di Faraday, standard di carbonio, alluminio e silicio</td><td>Micro-Analysis Consultants Ltd</td><td>8602</td><td></td></tr><tr><td>T25</td><td>Pallone Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Xilene</td><td>VWR&nbsp;</td><td>28975.325</td><td></td></tr><tr><td>Xilidina Ponceau</td><td>Aldrich&nbsp;</td><td>19.976-1&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

caratterizzazione completa della mineralizzazione tissutale in un modello ex vivo

Comprehensive Characterization of Tissue Mineralization in an Ex Vivo Model

Un'immagine micro-CT dell'espianto è mostrata nella Figura 2. Utilizzando la segmentazione manuale non è possibile separare in modo ottimale l'osso dal cemento, presente nel canale centrale, utilizzando la soglia globale. Per migliorare il riconoscimento dell'osso trabecolare e del cemento, proponiamo di utilizzare il deep learning. Il deep learning è potente per riconoscere le caratteristiche dei biomateriali e aiuta a migliorare la separazione tra osso e cemento, consentendo una migliore valutazione delle interazioni cemento-osso. Questo è della massima importanza per quantificare con precisione la quantità di osso formata all'interfaccia con il cemento e non incorporare falsi pixel in questo calcolo.
Tuttavia, la semplice quantificazione dell'osso all'interfaccia non è sufficiente per caratterizzare l'osso di nuova formazione. È necessario uno studio più approfondito della qualità della matrice ossea e della composizione cellulare per comprendere meglio la forza del nuovo osso e i meccanismi cellulari che hanno portato alla formazione di questa nuova matrice. La matrice ossea può essere caratterizzata utilizzando due approcci complementari: qBEI e microspettroscopia Raman. Un esempio di immagine qBEI è presentato nella Figura 3. Con qBEI, ogni pixel codificato in scala di grigi viene trasformato in una concentrazione di calcio. Questo è un prerequisito per valutare la distribuzione del contenuto di calcio nell'osso trabecolare e per comprendere (i) il grado di mineralizzazione dell'osso di nuova formazione all'interfaccia con il cemento e (ii) se la presenza di cemento interrompe la mineralizzazione dell'osso trabecolare. Il vantaggio di qBEI è la sua capacità di acquisire un'immagine ad alta risoluzione in un tempo molto breve, a differenza della microspettroscopia Raman che richiede un tempo di acquisizione più lungo. I parametri qBEI come lamedia del Ca, ilpicco del Ca el'ampiezza del Ca possono quindi essere derivati dalla distribuzione del calcio e utilizzati per confrontare la risposta tra due cementi o biomateriali.
D'altra parte, qBEI non fornisce alcuna informazione sulla qualità della fase organica della matrice ossea all'interfaccia con il biomateriale. Ulteriori informazioni sulle proprietà del materiale della fase organica sono derivate dalla microspettroscopia Raman. La microspettroscopia Raman viene eseguita sullo stesso campione utilizzato per qBEI dopo una rapida levigatura e lucidatura superficiale al fine di rimuovere lo strato di carbonio conduttivo. Nella microspettroscopia Raman, gli spettri vengono acquisiti in ogni posizione dei pixel. Nella Figura 4 sono forniti esempi di spettri Raman grezzi non trasformati e trasformati. Ogni spettro contiene informazioni sulla composizione del pixel analizzato e comprende picchi relativi alla resina di inclusione, in questo caso, pMMA, la fase minerale, picchi v1PO4 e v1CO3, e la fase organica, picchi Pro, Hyp, CML, Amide III, PG, CH2, Pen. e Ammide I. Nell'esempio nella Figura 4, lo spettro non trattato mostra il contributo della resina di rivestimento a ~812 cm-1 e una linea di base curva diversa da zero a causa della fluorescenza, sebbene venga utilizzato un laser rosso nel vicino infrarosso. L'elaborazione dello spettro è un prerequisito per garantire un calcolo accurato dei vari parametri Raman, in particolare l'eliminazione della fluorescenza di fondo. Durante l'acquisizione dei dati, l'utente deve garantire sia il posizionamento accurato che l'evitare la saturazione del rivelatore per confermare la presenza del picco v1PO4 situato a ~960 cm-1. Dopo la post-elaborazione, i rapporti di intensità di picco vengono calcolati in base alla posizione del modo vibrazionale caratteristico.
Tuttavia, è discutibile se i cambiamenti nella composizione del materiale abbiano portato a cambiamenti nella risposta biomeccanica. Per raccogliere informazioni sulla biomeccanica dell'osso di nuova formazione, eseguiamo sistematicamente indagini di nanoindentazione sullo stesso campione utilizzato per la microspettroscopia Raman. Le informazioni meccaniche dei tessuti sono ottenute dalle curve di nanoindentazione rappresentate dalle curve di carico rispetto alla profondità (Figura 5). Vale la pena notare che la profondità non torna a zero alla fine del test, rappresentando la deformazione plastica e il danno permanente creato al materiale. Il tasso di scorrimento dell'indentazione è derivato dalla curva profondità in funzione del tempo.
Infine, la colorazione istologica viene utilizzata per valutare la risposta tissutale al biomateriale a livello cellulare (Figura 6). Le colorazioni istologiche proposte permettono di determinare la presenza di tessuto osteoide, ma anche l'identificazione di cellule (macrofagi, cellule giganti multinucleate, osteoclasti, osteoblasti) e l'eventuale presenza di una capsula fibrosa all'interfaccia con il biomateriale. Questo è molto importante per comprendere la biocompatibilità di un biomateriale, ma anche la persistenza di nuovo osso quando il biomateriale viene degradato.
Nel complesso, l'approccio multi-metodo consente uno studio approfondito della formazione ossea, della qualità dell'osso di nuova formazione e della composizione cellulare. Se eseguite nell'ordine sequenziale proposto, tutte le indagini possono essere eseguite sullo stesso campione, riducendo i costi e i tempi di elaborazione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig01.jpg"> Figura 1: Riassunto grafico. Di seguito è riportato un riepilogo dei passaggi del protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig02.jpg"> Figura 2: Analisi di micro-CT e deep learning. (A) Ricostruzione 3D di immagini micro-CT. (B) Segmentazione ossea e cementizia: confronto tra segmentazione manuale e deep learning. Barra della scala = 5 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig03.jpg"> Figura 3: Imaging quantitativo di elettroni retrodiffusi per determinare il contenuto di calcio. (A) L'immagine retrodiffusa composta dai livelli di grigio ottenuti nella microscopia elettronica a scansione (SEM) viene convertita dal software di analisi delle immagini in (B) una mappa del calcio che mostra i punti caldi del campione osseo. (C) Viene tracciata la distribuzione del contenuto di calcio rispetto all'area ossea e vengono calcolati i tre principali parametri qBEI, Camean, Capeak eCa width. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig04.jpg"> Figura 4: Esempio di spettri Raman. (A) Spettro Raman grezzo non trattato ottenuto nell'intervallo spettrale 800 - 1800 cm-1. Il fondo di fluorescenza è chiaramente visibile in quanto gli spettri non partono da 0. Il contributo di resina (pMMA) è chiaramente visibile a ~812 cm-1. (B) Spettro elaborato. La posizione dei diversi modi vibrazionali di interesse è indicata sullo spettro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig05.jpg"> Figura 5: Studio delle proprietà meccaniche dei tessuti mediante nanoindentazione. (A) Il dispositivo di nanoindentazione è composto da una parte ottica utilizzata per definire la posizione della regione di interesse sulla superficie del blocco di campioni, e quindi il blocco viene traslato sotto la parte di indentazione. (B) Il carico rispetto al tempo e la profondità rispetto al tempo vengono tracciati durante il test di indentazione e vengono utilizzati per generare il (C) curva di carico rispetto alla profondità. In questo esempio la profondità scelta è stata fissata a 400 nm. Il carico massimo (Lm), la profondità alla fine del carico (hl), la profondità dopo il periodo di pausa (hm), la pendenza del segmento di scarico (S) e l'area sotto la fase di carico-scarico della prova (Wplast) sono derivati dalla curva carico rispetto alla profondità e vengono utilizzati per calcolare i diversi parametri di nanoindentazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig06.jpg"> Figura 6: Analisi istologica degli espianti osteocondrali trattati con cemento dopo 28 giorni di coltura. (A) La colorazione Movat dimostra la struttura del tessuto, compreso l'osso e il cemento che riempie il difetto. (B) La colorazione HES illustra l'integrazione tissutale e la risposta cellulare attorno al cemento. Barra della scala: 2,5 mm. (C) Ingrandimento dell'area evidenziata in (B), che descrive in dettaglio l'interfaccia tra il cemento e il tessuto circostante, dove si possono osservare le cellule che invadono il cemento. Barra della scala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Caratterizzazione completa della mineralizzazione tissutale in un modello ex vivo

The extensive characterization of tissue mineralization in the context of bone regeneration represents a significant challenge, given the numerous ...

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Non distruttivo di visualizzazione volume può essere raggiunto solo con tecniche tomografiche, di cui il più efficiente è la tomografia a raggi X micro computerizzata (TAC).

Ad alta risoluzione di immagini 3D Ex-Vivo I campioni biologici da Micro CT

I modelli animali sono spesso utilizzati per studiare metastasi alle ossa. In questo protocollo si descrivono due metodi comuni di inoculo del tumore per gli studi di metastasi ossee e descrivere brevemente alcune delle analisi utilizzati per monitorare e quantificare questi modelli.

Modelli di metastasi ossee

In questo video, descriviamo un metodo per la rilevazione dei depositi di calcio secreti dagli osteoblasti utilizzando un colorante anionico, Alizarin Red S. Gli osteoblasti in coltura vengono prima colorati e quindi il colorante viene recuperato per la quantificazione colorimetrica dei depositi di calcio o del grado di mineralizzazione degli osteoblasti.

Saggio di mineralizzazione in vitro: un metodo colorimetrico per quantificare i depositi di calcio degli osteoblasti sul sostituto dell'innesto osseo mediante colorazione ed estrazione del rosso di alizarina

In questo manoscritto, presentiamo una piattaforma di crioistologia semi-automatizzata ad alta produttività per produrre immagini composite allineate di misure di risposta multipla da diversi cicli di imaging fluorescente su sezioni congelate di tessuti mineralizzati.

-High Throughput, Multi-Image Cryohistology di mineralizzati tessuti

Vi presentiamo un protocollo per confrontare lo stato di minerali in vescicole rilasciate da due linee di cellule di osso umano: hFOB 1,19 e Saos-2. I profili di mineralizzazione sono stati analizzati da Alizarin Red-S (AR-S) colorazione, ultravioletto (UV) luce visualizzazione, formazione immagine di microscopia elettronica (TEM) di trasmissione e microanalisi a raggi x dispersiva di energia (EDX).

Analisi di minerali prodotto da hFOB 1.19 e Saos-2 cellule mediante microscopia elettronica a trasmissione con microanalisi a raggi x dispersiva di energia

Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morte in tutto il mondo. La calcificazione vascolare contribuisce in modo sostanziale al carico di morbilità e mortalità cardiovascolare. Questo protocollo descrive un metodo semplice per quantificare la precipitazione di calcio mediata da cellule muscolari lisce vascolari in vitro mediante imaging fluorescente.

Un metodo semi-automatico e riproducibile a base biologica per quantificare la deposizione di calcio in vitro

Qui, descriviamo un sistema microfisiologico standardizzato e facile da implementare che riflette la complessità della struttura in vivo del midollo osseo umano, fornendo un modello pertinente per studiare con precisione una vasta gamma di eventi normali e patologici.

Un modello 3D di midollo osseo umano per studiare le dinamiche e le interazioni tra cellule residenti in contesti fisiologici o tumorali

Questo articolo presenta la metodologia per ottenere e valutare la calcificazione vascolare isolando le aorte murine seguita dall'estrazione di vescicole extracellulari calcificate per osservare il potenziale di mineralizzazione.

Analisi della calcificazione vascolare extracellulare vescicolo-mediata mediante modelli in vitro e in vivo

Questo protocollo presenta un metodo economico ed efficiente per la valutazione quantitativa della microarchitettura ossea in un modello murino di osteoporosi combinando tecniche di colorazione ematossilina-eosina (HE) e micro-tomografia computerizzata (Micro-CT).

Valutazione della microarchitettura dell'osso trabecolare in un modello murino di osteoporosi

Proponiamo un protocollo per valutare la rigenerazione ossea a vari livelli gerarchici. Questo approccio multimodale consente un'analisi strutturale su diverse scale di lunghezza, affrontando efficacemente le sfide nella preparazione del campione. Fornisce inoltre un flusso di lavoro affidabile per valutare l'efficacia dei biomateriali nel promuovere la rigenerazione ossea.

Approccio multimodale per valutare la rigenerazione ossea e le prestazioni dell'impalcatura

Questo protocollo descrive la fabbricazione di costrutti ossei 3D utilizzando osteociti umani incorporati in idrogel di gelatina metacrilata (GelMA) integrati con matrice extracellulare decellularizzata. Il metodo è a basso costo, scalabile e compatibile con le apparecchiature di laboratorio di base, offrendo una piattaforma traslazionale per lo studio dei processi delle malattie muscoloscheletriche.

Una piattaforma di coltura ossea 3D che utilizza osteociti umani e matrice extracellulare decellularizzata per la modellazione delle malattie muscoloscheletriche

Scopri la caratterizzazione completa della mineralizzazione tissutale per la rigenerazione ossea utilizzando modelli ex vivo. Questo metodo multimodale con micro-CT e nanoindentazione aiuta a identificare candidati promettenti per terapie rigenerative.

Caratterizzazione completa della mineralizzazione tissutale in un modello ex vivo

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