Modellazione del glicocalice endoteliale post-pneumonectomia in un chip fluidico 3D - Un approccio alla fabbricazione di un sistema organo-on-chip basato su vasi

Il Mensah Lab si concentra sulla ricerca vascolare e sta sviluppando nuove tecniche per la ricerca sul glicocalice endoteliale e il suo ruolo nelle malattie vascolari. Gli sviluppi recenti riguardano la creazione di modelli in vitro più avanzati per la ricerca sul glicocalice e la ricerca di strategie terapeutiche per mirare alla salute e alla riparazione del glicocalice endoteliale nelle malattie. Le sfide sperimentali includono modelli in vitro incompleti, che non riescono a replicare accuratamente il glicocalice sano, nonché tecniche di quantificazione e misurazione difficili.

Il nostro attuale contributo al campo ha ampliato l'attuale comprensione del glicocalice endoteliale, in particolare nel suo ruolo nelle metastasi del cancro, nella rigenerazione del glicocalice danneggiato e nelle interazioni con i recettori della superficie vascolare. Il nostro metodo presenta un metodo economico ed efficace per la creazione di sistemi vascolari organ-on-a-chip che esprimono un glicocalice endoteliale più sviluppato e biomimetico rispetto alle tecniche convenzionali. Per iniziare, pesa 10 parti di base in elastomero siliconico in una provetta da centrifuga da 50 millilitri.

Versare una parte di agente indurente nel tubo contenente la base in elastomero siliconico fino a un volume finale di 30 millilitri. Mescolare accuratamente per ottenere una soluzione uniforme. Ora versare la soluzione ben miscelata negli stampi, quindi posizionare gli stampi in una camera a vuoto per degassare il PDMS per 30-60 minuti o fino a quando non rimangono bolle.

Rimuovere il PDMS degasato dalla camera a vuoto e lasciarlo polimerizzare a temperatura ambiente per 48 ore. Estrarre il PDMS polimerizzato dallo stampo in PLA. Quindi posizionare due pezzi di nastro biadesivo in ciascuna piastra di coltura cellulare.

Quindi, posizionare ciascuna metà del sistema vascolare PDMS sopra il nastro nel proprio piatto di coltura cellulare. Posizionare diverse gocce da 30 microlitri di fibronectina lungo il sistema vascolare PDMS utilizzando una micropipetta. Inclinare il PDMS secondo necessità e utilizzare una punta per pipetta per rivestire uniformemente la superficie.

Dopo un'incubazione di 30 minuti, aspirare la soluzione di fibronectina dal PDMS. Quindi lasciare asciugare i pezzi all'aria all'interno dell'armadio. Posizionare i tappi stampati in 3D a ciascuna estremità delle metà del sistema vascolare PDMS per evitare perdite dalla sospensione cellulare, utilizzando due tappi per pezzo.

Con una micropipetta, seminare 300 microlitri di sospensione cellulare HLMVEC in ciascun pezzo PDMS e incubare. Quindi rimettere le metà nell'armadio e rimuovere i quattro tappi. Aggiungere il terreno di coltura HLMVEC per immergere le metà del sistema vascolare PDMS e incubare nuovamente per sei-10 ore.

Aspirare ora il terreno HLMVEC dalla piastra di Petri contenente le metà del sistema vascolare. Posizionare ciascuna metà del PDMS nei blocchi di policarbonato, assicurandosi che il corretto allineamento sia corretto. Applicare sigillante siliconico alle estremità del sistema vascolare PDMS.

Inserire un tubo lungo un pollice in entrambe le estremità del PDMS inferiore. Quindi capovolgere il blocco acrilico superiore contenente la metà superiore del PDMS sul blocco acrilico inferiore. Imbullonare insieme i blocchi acrilici, assicurandosi che il blocco filettato sia sul fondo.

Collegare le estremità libere del tubo utilizzando tappi stampati in 3D. Rimuovere un tappo e iniettare delicatamente 500 microlitri di terreno di coltura HLMVEC nel sistema vascolare utilizzando una micropipetta. Inclinare per rimuovere le bolle d'aria, quindi sostituire il tappo.

Portare il chip assemblato e i componenti sterili nella cappa di biosicurezza. Collegare tutti i tubi e assemblare il sistema di flusso, assicurandosi che il tubo di ingresso si colleghi al fondo del serbatoio della siringa per facilitare il flusso per gravità. A questo punto adescare delicatamente il sistema di flusso con il mezzo HLMVEC.

Utilizzare una pipetta sierologica da 50 millilitri. Iniettare 30 millilitri di terreno nella parte superiore del serbatoio della siringa e azionare la pompa peristaltica a bassa velocità per riempire il tubo. Lavare ogni metà del sistema vascolare PDMS in PBS per cinque minuti, aggiungendo una soluzione sufficiente a immergere completamente la sezione vascolare.

La simulazione del fluido ha mostrato uno sforzo di taglio significativamente elevato alle biforcazioni dei vasi nel modello di pneumonectomia rispetto al modello di controllo. La microscopia in campo chiaro ha confermato l'adesione uniforme delle cellule HLMVEC sia in condizioni statiche che di flusso a 93,1 millilitri al minuto dopo 24 ore. L'imaging a fluorescenza della biforcazione di ingresso ha mostrato strati cellulari intatti e ben distribuiti sia nel modello di controllo che in quello di pneumonectomia.

L'imaging subito dopo la seconda biforcazione ha rivelato una sostanziale perdita di cellule sia nel modello di controllo che in quello di pneumonectomia. Le cellule sono rimaste aderenti e hanno mostrato una colorazione coerente nella regione a valle della seconda biforcazione in entrambi i modelli. I nuclei colorati con DAPI uniformi nei modelli vascolari hanno indicato che la confluenza è stata mantenuta nonostante l'esposizione al flusso.

Una prima prova del modello di controllo ha portato a una distribuzione irregolare delle celle a causa delle bolle d'aria introdotte durante l'adescamento del sistema.