Name: Analisi delle interazioni proteina-DNA telomerico utilizzando pinzette magnetiche a singola molecola (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-30T14:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Scopri le interazioni proteina-DNA telomerico utilizzando pinzette magnetiche a singola molecola per analizzare TRF2 e la struttura cromatinica. Questo metodo consente misurazioni precise delle proprietà meccaniche del DNA.

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<meta charset="utf8"></head><body>Studio delle interazioni TRF1/2 con il DNA telomerico utilizzando il saggio a singola molecola

<table><tbody><tr><td>Anti-digossigenina</td><td>Roche</td><td>11214667001</td><td></td></tr><tr><td>BfaI</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>R0568S</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900933</td><td></td></tr><tr><td>CMOS camera&nbsp;</td><td>Mikrotron</td><td>MC1362</td><td></td></tr><tr><td>CviAII</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>R0640S</td><td></td></tr><tr><td>DIG-11-dUTP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-803-DIGXL</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di estrazione del DNA</td><td>G-CLONE</td><td>EX0108</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I, Rnase-Free, Hc Ea</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0523</td><td></td></tr><tr><td>dNTP miscela</td><td>Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)</td><td>P032-02</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Solarbio</td><td>D1070</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-270&nbsp; perline</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65305</td><td>Perline di streptavidina</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne perline Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>65001</td><td>Perline di streptavidina</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Beijing Hwrkchemical Co. Ltd</td><td>SMG66258-1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Solarbio</td><td>II0070</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Solarbio</td><td>I8070</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory</td><td>A1079</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0523</td><td></td></tr><tr><td>Frammento di Klenow (3&prime;-5&prime; exo-)</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>LabView</td><td>National Instruments</td><td>https://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.html</td><td>Software di programmazione grafica&nbsp;</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Bide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)</td><td>BD136449</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Solarbio</td><td>L8120-5</td><td></td></tr><tr><td>MseI</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>R0525S</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Shanghai Aladdin</td><td>C111533</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Spectrofotometro</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>Ni NTA Beads 6FF</td><td>Changzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co., Ltd</td><td>SA005025</td><td></td></tr><tr><td>Membrana in nitrocellulosa</td><td>ABclonal</td><td>RM02801</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Solarbio</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Beyotime Biotech Inc (beyotime)</td> <td>ST535-500mg</td><td></td></tr><tr><td>rCutSmart Buffer</td><td>New England Biolab (NEB)</td> <td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4875</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>SERVA Electrophoresis GmbH</td><td>2124902</td><td></td></tr><tr><td>Sumo proteasi</td><td>Beyotime Biotech Inc (beyotime)</td><td>P2312M</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi delle interazioni proteina-dna telomerico utilizzando pinzette magnetiche a singola molecola

Analyzing Telomeric Protein-DNA Interactions Using Single-Molecule Magnetic Tweezers

La Figura 1A illustra i domini schematici e le strutture di TRF1 e TRF2, costituiti rispettivamente da 439 e 542 amminoacidi, che possono essere espressi nelle cellule procariotiche. La preparazione di TRF1 è stata precedentemente descritta in letteratura41. Qui, forniamo una descrizione completa e risultati rappresentativi della preparazione di TRF2. La Figura 1B mostra la mappa plasmidica utilizzata per esprimere TRF2 in E. coli. Abbiamo valutato l'espressione di TRF2 prima e dopo l'induzione in E. coli, come illustrato nella Figura 1B. I processi di purificazione e di scissione dei tag sono stati analizzati utilizzando SDS-PAGE (Figura 1C). Seguendo questo protocollo, entrambe le proteine leganti i telomeri, TRF1 e TRF2, sono state espresse con successo in E. coli.
Il DNA telomerico, sotto forma di frammenti di restrizione terminale (TRF), è generato da genomi umani utilizzando una combinazione di quattro enzimi di restrizione. Seguendo il diagramma di flusso mostrato nella Figura 2A, abbiamo estratto i genomi dalle cellule umane. Gli enzimi digeriscono selettivamente il DNA genomico lasciando intatto il DNA telomerico a lunghezza intera, fornendo così materiale per saggi a singola molecola. Abbiamo ampiamente testato il preparato di DNA TRF utilizzando varie linee cellulari umane. L'integrità del DNA genomico è stata esaminata utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio, come mostrato nella Figura 2B. I TRF sono stati successivamente analizzati mediante Southern blotting, impiegando oligonucleotidi marcati in fluorescenza complementari alla sequenza di ripetizione telomerica TTAGGG (Figura 2C), seguendo un metodo descritto altrove41,56. In media, la lunghezza dei TRF umani è di circa pochi kilobasi.
I saggi a singola molecola avvengono in una cella a flusso assemblata come descritto nella Figura 3A. Un rivestimento in nitrocellulosa copre la superficie del vetro caricato negativamente, fornendo una matrice idrofila per l'adsorbimento degli anticorpi. La passivazione BSA blocca le aree della matrice nitrocellulosica non legate dagli anticorpi anti-digossigenina. Le perle di polistirene, che non contengono nanoparticelle di ferro, fungono da perle di riferimento. I cavi TRF si formano attraverso interazioni di affinità tra l'anticorpo digossigenina sulla matrice nitrocellulosica e la biotina-streptavidina sulla superficie della microsfera magnetica (Figura 3B). TRF1 o TRF2 vengono introdotti nella cella di flusso, legandosi ai cavi del DNA TRF tramite diffusione libera. Le pinzette magnetiche vengono utilizzate per modulare il campo magnetico, generando forze sulle perle magnetiche per allungare e rilassare i cavi TRF, consentendo così di sondare le interazioni proteina-DNA.
Un saggio meccanico a singola molecola viene progettato sviluppando uno script per controllare i movimenti dei motori delle pinzette magnetiche. Un diagramma di flusso fornisce un approccio strutturato alla creazione di questo script in MatLab per un saggio di una singola molecola utilizzando pinzette magnetiche (Figura 4A). I magneti si muovono lungo l'asse z in un intervallo compreso tra 0 e 25 mm. Le forze sono calcolate in base alle posizioni del magnete, in base alla configurazione del magnete, utilizzando le equazioni descritte in letteratura54. Per una specifica velocità di carico della forza, le posizioni del magnete e le velocità di movimento sono progettate e programmate in MatLab per ottenere il profilo di manipolazione della forza desiderato, come dimostrato nell'esempio del saggio della rampa di forza (Figura 4B-D).
Usando TRF1 come esempio, abbiamo sondato le interazioni telomeriche DNA-proteina con pinzette magnetiche a singola molecola. La configurazione sperimentale può essere configurata come un saggio forza-rampa, come mostrato nella Figura 5A, in cui le curve forza-estensione mostrano caratteristiche a zig-zag durante l'allungamento a causa della rottura delle interazioni proteina-DNA e tracce lisce durante il rilassamento, riflettendo la fibra di DNA senza loop mediati da proteine. La configurazione può anche essere configurata come un saggio di salto di forza, come mostrato nella Figura 5B, C, che ci consente di misurare i cambiamenti nell'estensione e la durata delle interazioni proteina-DNA sotto forze specifiche. Da queste misurazioni è possibile derivare la cinetica di dissociazione dei complessi DNA-proteina telomerici (Figura 5D). Inoltre, la formazione di anse nei complessi DNA-proteina può essere rivelata da cambiamenti nell'estensione (Figura 5E). Inoltre, la concentrazione proteica può essere titolata all'interno di questa configurazione sperimentale del DNA telomerico. Inoltre, l'eterogeneità della lunghezza del DNA telomerico proveniente da cellule umane ci permette di studiare il meccanismo di formazione dell'ansa in telomeri di varie lunghezze (Figura 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig01v2.jpg"> Figura 1: L'espressione e la purificazione di TRF1/2. (A) L'architettura dei domini di TRF1 e TRF2. (B) La mappa plasmidica di pET28a-SUMO-TRF2 per l'espressione di TRF2 in E. coli. (C) Analisi SDS-PAGE dei campioni ottenuti nei vari stadi di espressione e purificazione. Corsia 1: non indotta da IPTG. Corsia 2: precipitato indotto da IPTG ottenuto mediante lisi cellulare. Corsia 3: surnatante indotto da IPTG ottenuto dopo lisi cellulare. Corsia 4: Flusso attraverso la colonna Ni. Corsia 5: lavare con tampone a basso contenuto di imidazolo per rimuovere le proteine delle impurità. Corsia 6: Eluizione di 6xHis-SUMO-TRF2 con tampone contenente 300 mM di imidazolo. Corsia 7: Digestione dei tag SUMO da parte dell'enzima proteasi SUMO . Corsia 8: Ripurificazione con colonna di Ni ed eluizione di TRF2 (6xHis e SUMO tag rimossi) con tampone contenente 20 mM di imidazolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig01largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig02.jpg"> Figura 2: Preparazione di frammenti di restrizione terminale (TRF). (A) Diagramma di flusso per la preparazione di TRF da cellule umane. (B) Esame dell'integrità del DNA genomico utilizzando un gel di agarosio all'1% per 5 linee cellulari umane. (C) Analisi TRF eseguita mediante Southern blotting per 5 linee cellulari umane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig03.jpg"> Figura 3: Preparazione di saggi meccanici a singola molecola. (A) Diagramma di flusso che illustra la preparazione di una cella di flusso per saggi meccanici a singola molecola. (B) Rappresentazione schematica di saggi meccanici a singola molecola mediante pinzette magnetiche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig04.jpg"> Figura 4: Progettazione di un saggio meccanico a singola molecola. (A) Diagramma di flusso per la generazione di uno script per l'esecuzione di un saggio di rampa di forza. (B) Il profilo di movimento dei magneti lungo l'asse z. (C) Il profilo di forza corrispondente al movimento del magnete. (D) La correlazione tra le posizioni dei magneti e le forze risultanti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig05.jpg"> Figura 5: Interazioni DNA-proteina telomerica analizzate da pinzette magnetiche a singola molecola. (A) Le interazioni TRF1-telomeri sono state sondate in saggi di forza-rampa (N = 10) in un tampone contenente 20 mM di HEPES (pH 7,5), 1 mM di EDTA e 100 mM di NaCl a 23 °C. La concentrazione di TRF1 era di 10 nM, con una velocità di carico della forza di ±1 pN/s. (B) Il cavo TRF è stato allungato e rilassato nei saggi di salto forzato. Il protocollo di forza applicato era Frest = 0 pN, Ftest = 2 pN - 8 pN, Fhigh = 10 pN e Fmax = 20 pN. Le condizioni di buffer e temperatura erano le stesse di (A). Frame rate = 200 Hz. (C) Le interazioni TRF1-telomeri sono state sondate in saggi di salto di forza con una concentrazione di TRF1 di 10 nM. (D) Cinetica di dissociazione dei complessi TRF1-telomeri. Il logaritmo del tasso di dissociazione alle forze testate (media ± SD, n = 206) segue il modello di Kramer-Bell-Evans (curva rossa ed equazione della legenda). Il riquadro mostra il tempo medio di dissociazione (&lt;τ&gt;) a Ftest. (E) Distribuzione delle variazioni di estensione (ΔL) in seguito a eventi di rottura dei complessi TRF1-telomeri. Le curve nere e rosse rappresentano i raccordi gaussiani. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Li et al.41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig06.jpg"> Figura 6: Il numero e le dimensioni delle anse di DNA formate da TRF1 in un telomero. (A) Dipendenza dalla lunghezza dei telomeri delle dimensioni dell'ansa del DNA (ΔL) a [TRF1] = 20 nM. Le curve rappresentano i raccordi gaussiani. (B) Dipendenza dalla lunghezza dei telomeri di ΔL a [TRF1] = 40 nM. (C) Correlazione tra ΔL e numero di eventi di rottura per telomero, N. La correlazione di ordine zero è r = -0,20, con p &lt; 0,001 (dimensione del campione = 1496). (D) Un cartone animato che illustra un possibile meccanismo che spiega la correlazione negativa tra ΔL e N, suggerendo che TRF1 può compattare un singolo telomero con domini di loop primari in una topologia di ordine superiore. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Li et al.41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File supplementare 1: Codice MatLab per la generazione di script.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/JoVE67251-coding%20files-MatLab%20code%20for%20generating%20scripts.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2: Script per la assay.txt a forza costante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/JoVE67251-coding%20files-Script%20for%20constant%20force%20assay.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 3: Script per la rampa di forza assay.txt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/JoVE67251-coding%20files-Script%20for%20force%20ramp%20assay.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Tabella supplementare 1: Ricette <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

Analisi delle interazioni proteina-DNA telomerico utilizzando pinzette magnetiche a singola molecola

Telomeres, the protective structures at the ends of chromosomes, are crucial for maintaining cellular longevity and genome stability. Their proper ...

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