Name: Quantificazione dei genomi virali adeno-associati in campioni di vettori purificati mediante reazione a catena della polimerasi a goccioline digitali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T14:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 43 s
Description: Scopri la quantificazione del genoma virale adeno-associato mediante dd_PCR per la terapia genica. Questo protocollo standardizzato migliora l'affidabilità e la precisione nelle misurazioni del titolo genomico di AAV.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocollo standardizzato per la quantificazione del genoma virale mediante PCR digitale con goccioline

<ol><li>Balakrishnan, B., Jayandharan, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+biology+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+vectors+used+in+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Basic biology of adeno-associated virus (AAV) vectors used in gene therapy.</a> Curr Gene Ther. 14 (2), 86-100 (2014).</li>
<li>Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tissue-tropism+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Virol%22%5BJournal%5D)">In vivo tissue-tropism of adeno-associated viral vectors.</a> Curr Opin Virol. 21, 75-80 (2016).</li>
<li>Pupo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+vectors%3A+The+Rubik%27s+cube+of+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV vectors: The Rubik's cube of human gene therapy.</a> Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).</li>
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<li>Brimble, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+packaging+of+translatable+P5-associated+DNA+contaminants+in+recombinant+AAV+vector+preps%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Preventing packaging of translatable P5-associated DNA contaminants in recombinant AAV vector preps.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 24, 280-291 (2022).</li>
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<li>Sidransky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ras+oncogene+mutations+in+the+stool+of+patients+with+curable+colorectal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of ras oncogene mutations in the stool of patients with curable colorectal tumors.</a> Science. 256 (5053), 102-105 (1992).</li>
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<li>Sanmiguel, J., Gao, G., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+digital+droplet-based+AAV+genome+titration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative and digital droplet-based AAV genome titration.</a> Methods Mol Biol. 1950, 51-83 (2019).</li>
<li>Bio-Rad Laboratories Inc. Planning droplet digital PCR experiments. , 
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<li>Dorange, F., Le Bec, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+approaches+to+characterize+AAV+vector+production+%26+purification%3A+Advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Gene+Ther+Insights%22%5BJournal%5D)">Analytical approaches to characterize AAV vector production & purification: Advances and challenges.</a> Cell Gene Ther Insights. 4 (2), 119-129 (2018).</li>
<li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+determination+of+single-stranded+and+self-complementary+adeno-associated+viral+vector+genome+titers+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.</a> Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li>
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<li>Bio-Rad. Droplet digital PCR applications guide. Bulletin 6407. , 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf</a> (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>pipetta 8 canali 10 &; L</td><td>Eppendorf</td><td>3,12,50,00,010</td><td></td></tr><tr><td>pipetta a 8 canali 200 & micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3,12,50,00,036</td><td></td></tr><tr><td>pipetta a 8 canali 300 & micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3,12,50,00,052</td><td></td></tr><tr><td>Striscia PCR a 8 pozzetti</td><td>Sarstedt</td><td>72.991.002</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler con 96&ndash; Modulo di reazione a pozzetti profondi</td><td>Bio-Rad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Buffer Control per sonde da 9 mL (2 x 4,5 mL)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863052</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix per sonde (senza dUTP) (2 x 1 mL)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863023</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Piastre a 96 pozzetti (confezione da 25)</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Droplet Reader Oil (2 x 1L)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863004</td><td></td></tr><tr><td>Portacartucce DG8</td><td>Bio-Rad</td><td>1863051</td><td></td></tr><tr><td>Cartucce DG8 per QX200/QX100 (confezione da 24)</td><td>Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>Guarnizioni DG8 per QX200/QX100 (confezione da 24)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (10U/&micro; L) + tampone</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Olio per la generazione di goccioline per sonde (10 x 7 mL)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Puntale filtrante, 0,1-10 &mu; L, 34 mm, rack, PCR pulito, STERILE&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30078500</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Filtro Tip, 20-300 &mu; L, 55 mm, rack, PCR clean, STERILE&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30078560</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Filtro Puntale, 2-100 &mu; L, 53 mm, Rack, PCR Clean, STERILE&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30078543</td><td></td></tr><tr><td>Primer liofilizzati a termine e rispettivi master stock a 100 mM&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>GFP come sequenza target. Innesco in avanti: 5'-GAACGGCATCAAGGTGAACT-3'Sonda</td></tr> <tr><td>lyopohilizzata e master stock a 100 &micro; M&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>GFP come sequenza target. PrimeTime Eco Probe: /56-FAM/CAAGATCCG/ZEN/CCACAACATCGAGGA/3IABkFQ/</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio (MgCl2)</td><td>Chemlab Analytical</td><td>CL00.1381</td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>IDT</td><td>11-04-02-01</td><td></td></tr><tr><td>PCR Piastra termosaldabile, lamina, perforabile (confezione da 100)</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-68 tensioattivo non ionico (100x)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24040032</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Honeywell prodotti chimici per la ricerca</td><td>31248</td><td></td></tr><tr><td>Software di gestione QX</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Software per l'analisi dei dati ddPCR</td></tr><tr><td>Generatore di gocce QX200 Lettore di gocce</td><td>Bio-Rad</td><td>1864002</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Serbatoio</td><td>di reagenti per 1864003</td><td></td><td>Bio-Rad</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>613-1181</td><td></td></tr><tr><td>Primer liofilizzati inversi e rispettivi master stock a 100 mM&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>GFP come sequenza target. Primer inverso: 5'-TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3'Provetta</td></tr> di <tr><td>reazione SafeSeal, 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.200</td><td></td></tr><tr><td>DNA spermatico di salmone, tranciato (10 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9680</td><td></td></tr><tr><td>TE tampone</td><td>IDT</td><td></td><td>Accompagnato da primer quando si ordina</td></tr><tr><td>Tris cloridrato (Tris-HCl)</td><td>Roche</td><td>10812846001</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificazione dei genomi virali adeno-associati in campioni di vettori purificati mediante reazione a catena della polimerasi a goccioline digitali

Quantification of Adeno-Associated Viral Genomes in Purified Vector Samples by Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

I risultati possono essere visualizzati utilizzando un software appropriato. Per ogni pozzetto, il grafico dell'ampiezza 1D mostra tutte le goccioline relative alla loro ampiezza. Ci si aspetta una netta separazione tra goccioline positive e negative. Se più del 10% delle goccioline totali si trova tra le nuvole di goccioline positive e negative (un fenomeno noto come pioggia di goccioline), è necessario rimisurare il campione (vedi Figura 1). Ulteriori informazioni sulla pioggia di goccioline sono disponibili nella discussione.
È possibile creare una tabella di dati per riassumere tutte le informazioni registrate, tra cui il nome del campione, il numero di goccioline accettate (conteggio degli eventi) e la concentrazione (copie/μL). Idealmente, il numero di eventi dovrebbe essere compreso tra 15.000 e 20.000 goccioline accettate. Se il numero di eventi per un pozzo è inferiore a 10.000, il punto dati deve essere escluso dall'analisi. Un esempio dei dati di output è fornito nella Tabella 5.
Il titolo vg può essere calcolato in base alla concentrazione (copie/μL), tenendo conto delle diluizioni del campione. L'intervallo di lavoro di dd_PCR è di 10-10.000 copie/μL. Valori inferiori a 10 copie/μL devono essere esclusi dall'analisi. Devono essere calcolati il titolo vg per i campioni, nonché i controlli positivi e negativi. Il valore misurato del controllo positivo deve avere un coefficiente di variazione (%CV) inferiore al 20% rispetto al valore teorico. Il controllo negativo deve essere inferiore a 5 copie/μL. Inoltre, deve essere calcolata la %CV tra le ripetizioni e le diverse diluizioni per ciascun campione. Se la percentuale di CV tra le diverse diluizioni supera il 20%, il valore può essere considerato impreciso e può essere necessario misurare nuovamente il campione.
Una misurazione di successo è caratterizzata da una netta separazione delle nuvole di goccioline positive e negative, almeno 10.000 goccioline accettate, un valore compreso tra 10 copie/μL e 10.000 copie/μL e una %CV tra le ripetizioni inferiore al 20%.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67252/67252fig01.jpg"> Figura 1: Visualizzazione delle goccioline dd_PCR. (A) Il grafico dell'ampiezza 1D mostra una chiara separazione delle goccioline positive e negative, indicando una partizione delle goccioline riuscita. (B) Il grafico mostra una scarsa separazione delle goccioline positive e negative, nota come pioggia di goccioline, che suggerisce una partizione non ottimale o potenziali problemi con il saggio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67252/67252fig02.jpg"> Figura 2: Flusso di lavoro per la quantificazione dei genomi virali mediante PCR digitale con goccioline. (1) I tamponi, i reagenti e le soluzioni vengono preparati secondo le istruzioni del produttore o la fase 1 del protocollo (Preparazione delle soluzioni stock). (2) 45 μl della soluzione di DNasi I vengono aliquotati in ciascuna provetta di una striscia per PCR da 8 provette. Dopo il vortice e la breve centrifugazione dei campioni, 5 μl di campione vengono aggiunti a una delle provette. La DNasi I e la striscia PCR a otto provette contenente campioni vengono incubate in un termociclatore per 1 ora a 37 °C, seguite da diluizioni seriali dei campioni. (3) La mastermix per PCR viene preparata come descritto e 19,8 μl vengono aliquotati in ciascuna provetta di una striscia per PCR da 8 provette. Le diluizioni seriali campione della fase 2 vengono aggiunte al mastermix. 20 μL di mastermix plus La soluzione campione viene caricata nella fila centrale della cartuccia e 60 μL di olio generatore di goccioline vengono trasferiti ai pozzetti inferiori di una cartuccia generatrice di goccioline. La cartuccia viene quindi inserita nel generatore di goccioline e fatta funzionare secondo le condizioni specificate. Dopo la generazione di goccioline, 42,5 μl dalla fila superiore della cartuccia vengono trasferiti a una piastra PCR a più pozzetti. (4) La piastra PCR viene caricata in un termociclatore PCR ed eseguita secondo le condizioni fornite. La lastra viene analizzata utilizzando un lettore dd_PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Dati di precisione. Questa tabella presenta i dati di precisione provenienti da quattro serie di campioni di controllo qualità (QC), ciascuno con cinque concentrazioni (QC1-QC5). Ogni QC è stato misurato cinque volte. Viene mostrato il coefficiente di variazione (%CV) tra diverse esecuzioni, che rappresenta la ripetibilità (A), e tra diversi set di campioni, che rappresenta la precisione intermedia (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%201.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 2: Diluizioni del campione. La tabella mostra le diluizioni raccomandate del campione in base al titolo del genoma virale previsto (vg/mL). Si raccomanda un totale di tre diluizioni per garantire che almeno due valori rientrino nell'intervallo di lavoro del test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%202.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 3: dd_PCR composizione del master mix. Questa tabella delinea la composizione della dd_PCR master mix, che include un primer diretto e inverso (909 nM), una sonda (227 nM) e dd_PCR supermix per sonde (senza dUTP, 1x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%203.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 4: Condizioni di termociclo. La tabella descrive in dettaglio il programma di PCR raccomandato, che include: (1) un'incubazione di 10 minuti a 95 °C per la distruzione del capside e l'attivazione enzimatica, (2) 40 cicli di 30 s a 94 °C per la denaturazione del DNA e 1 minuto a 60 °C per la ricottura e l'estensione, (3) un'incubazione di 10 minuti a 98 °C per la disattivazione degli enzimi, e (4) mantenimento a 4 °C. La temperatura di ricottura può richiedere un'ottimizzazione in base al set di primer/sonda utilizzato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%204.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 5: Esempio di dati di output da un'esecuzione AAV effettiva. La tabella fornisce un esempio di dati di output da un'esecuzione AAV effettiva, in cui un campione è stato misurato in due diverse diluizioni, ciascuna in duplicato. Il titolo del genoma virale (vg) (in vg/mL) viene calcolato utilizzando la seguente formula: 10 (pretrattamento con DNasi I) x 10 (diluizione nella miscela master) x 1.000 (μL in mL) x diluizione in tampone di diluizione AAV. STDEV rappresenta la deviazione standard e CV indica il coefficiente di variazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%205.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

Quantificazione dei genomi virali adeno-associati in campioni di vettori purificati mediante reazione a catena della polimerasi a goccioline digitali

Adeno-associated virus (AAV) is a non-pathogenic virus used as a delivery vehicle to transfer therapeutic genes into patients. Accurate quantification of ...

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Quantificazione dei genomi virali adeno-associati in campioni di vettori purificati mediante reazione a catena della polimerasi a goccioline digitali (Video) | JoVE Journal

Quantificazione dei genomi virali adeno-associati in campioni di vettori purificati mediante reazione a catena della polimerasi a goccioline digitali

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