Name: Ottimizzazione della preparazione dellantigene per il test di inibizione dellemoagglutinazione della sierologia del virus della malattia di Newcastle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Scopri un metodo ottimizzato per la preparazione dell'antigene 4-HAU per il test di inibizione dell'emoagglutinazione del virus della malattia di Newcastle. Questo approccio migliora l'accuratezza del rilevamento degli anticorpi e supporta la sorveglianza della salute avicola.

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L'approvazione del protocollo è stata concessa dal comitato istituzionale locale per la cura e l'uso degli animali. Tutte le procedure che hanno coinvolto antigeni virali vivi e campioni di siero clinico sono state eseguite in un laboratorio di Biosicurezza di Livello 2, in conformità con i protocolli di sicurezza stabiliti.
1. Preparazione della sospensione di globuli rossi di pollo all'1%
<ol>
	<li>Aggiungere 3 mL di soluzione di Alserver (anticoagulante) in una provetta da centrifuga conica sterile da 15 mL.</li>
	<li>Raccogliere 1 ml di sangue dalla vena alare di ciascuno dei tre polli non immuni (senza anticorpi NDV). Trasferire immediatamente il sangue nella provetta contenente l'anticoagulante e mescolare delicatamente.</li>
	<li>Riempire la provetta con 1 soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS, pH 7,2-7,4) fino a un volume totale di 12 mL e mescolare delicatamente. Centrifugare a 500 × g per 10 min utilizzando un rotore orizzontale.</li>
	<li>Rimuovere con cautela il surnatante e lo strato di globuli bianchi. Ripetere i passaggi 1.3 e 1.4 2 volte per ottenere il pellet RBC.</li>
	<li>Pipettare 1 mL di pellet di globuli rossi in 99 mL di PBS sterile, per preparare una sospensione di globuli rossi all'1%. NOTA: Il volume richiesto della sospensione di globuli rossi di pollo all'1% è stimato in 3 ml/piastra (25 μl/pozzetto x 96 pozzetti x 1,25 = 3,0 ml; dove 1,25 tiene conto degli sprechi di pipettaggio per garantire un volume sufficiente).</li>
</ol>
2. Ricostituzione dell'antigene o del siero liofilizzato
<ol>
	<li>Aggiungere 2 ml di PBS sterile alla fiala contenente l'antigene liofilizzato o il siero. Agitare delicatamente la fiala e lasciarla riposare per 2-3 minuti per ridurre al minimo le bolle e garantire la completa dissoluzione. NOTA: Seguire le istruzioni specifiche del produttore, poiché in questo studio non sono stati confrontati diversi tipi di materiali liofilizzati.</li>
	<li>Aliquotare la soluzione ricostituita in provette da centrifuga da 1,5 mL e congelare a -20 °C fino al momento dell'uso. NOTA: Rideterminare il titolo di HA ogni volta che l'antigene viene scongelato e utilizzato, o quando viene preparata una nuova sospensione di globuli rossi.</li>
</ol>
3. Titolazione HA di antigeni
<ol>
	<li>Erogare rispettivamente 40, 80, 120 e 160 μl di PBS in quattro pozzetti adiacenti di una piastra monouso per microtitolazione con fondo a V da 96 pozzetti, quindi aggiungere 20 μl di antigene a ciascun pozzetto e miscelare pipettando su e giù 10 volte per ottenere diluizioni di 1:3, 1:5, 1:7 e 1:9, rispettivamente. Un diagramma schematico dell'operazione di diluizione è mostrato nella Figura 1.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67256/67256fig1.jpg"> 
Figura 1: Diagramma schematico che illustra la procedura per diluire la soluzione di antigene nel saggio di emoagglutinazione. La soluzione di antigene viene diluita in PBS in rapporti rispettivamente di 1:3, 1:5, 1:7 e 1:9. La PBS nei pozzetti o nelle provette da centrifuga è rappresentata in blu, mentre gli antigeni sono mostrati in verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67256/67256fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="2">
	<li>Etichettare una nuova piastra per microtitolazione. Aggiungere 25 μl di PBS in ciascun pozzetto nelle file 1-5.</li>
	<li>Posizionare 25 μl di soluzioni di antigene diluite nei primi pozzetti delle file 1-5 utilizzando una pipetta multicanale e mescolare pipettando su e giù almeno 5 volte.</li>
	<li>Trasferire 25 μl dal primo pozzetto di ogni fila al secondo pozzetto, mescolando accuratamente. Continuare a trasferire da un pozzetto all'altro, fino all'11a colonna, per creare diluizioni seriali doppie (da 1:2 a 1:2048). Scartare 25 μl dopo l'11a colonna.</li>
	<li>Aggiungere 25 μl di PBS a ciascun pozzetto, iniziando dai pozzetti contenenti la concentrazione di antigene più bassa.</li>
	<li>Aggiungere 25 μl di sospensione di globuli rossi di pollo all'1% in ciascun pozzetto, sempre iniziando dai pozzetti contenenti la concentrazione di antigene più bassa.</li>
	<li>Agitare la piastra su un agitatore per micropiastre per ~20 s per mescolare accuratamente.</li>
	<li>Lasciarlo indisturbato sul banco di lavoro a temperatura ambiente (20-25 °C) per ~30 minuti fino a quando l'RBC della 12a colonna non si è completamente stabilizzato. Per la disposizione delle piastre fare riferimento alla Figura 2.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67256/67256fig2.jpg"> 
Figura 2: Layout schematico di una micropiastra utilizzata nel saggio di emoagglutinazione. La prima colonna delle righe 1-5 contiene varie diluizioni iniziali non diluite della soluzione di antigene, seguite da una doppia diluizione seriale da sinistra a destra fino alla colonna 11. Il controllo PBS viene posizionato nell'ultima colonna. Il gradiente da scuro a chiaro indica una diminuzione della concentrazione di antigene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67256/67256fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="9">
	<li>Leggi e registra i risultati. L'HA viene determinato inclinando la piastra di 90° per ~25 s e osservando la presenza o l'assenza di flusso a forma di lacrima dei globuli rossi. La diluizione più alta che mostra un'emoagglutinazione completa (senza flusso), rappresenta 1 unità HA. I pozzetti nella 12a colonna fungono da controlli RBC (negativi).</li>
	<li>Calcolare il titolo di HA di ciascuna riga utilizzando la Tabella 1, il cui massimo viene utilizzato per la preparazione della soluzione di antigene 4-HAU. Ad esempio, se a, b, c, d ed e sono uguali rispettivamente a 9, 8, 7, 6, 6, allora 3 x 28 = 768 è il valore massimo ed è il titolo HA dello stock di antigene.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antigeni</td>
			<td>Colonna di diluizione più alta dell'HA completo</td>
			<td>Titolo HA di stock non diluito</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stock non diluito</td>
			<td>un</td>
			<td>2un</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diluizione in 3 volte</td>
			<td>b</td>
			<td>3 x 2b</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diluizione 5 volte</td>
			<td>c</td>
			<td>5 x 2c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diluizione 7 volte</td>
			<td>d</td>
			<td>7 x 2d</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diluizione 9 volte</td>
			<td>e</td>
			<td>9 x 2e</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Risultati del dosaggio dell'acido ialuronico e calcolo del titolo di HA della soluzione madre.
4. Preparazione della soluzione di antigene 4-HAU
<ol>
	<li>Calcolare il fattore di diluizione per la preparazione della soluzione di antigene 4-HAU: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/67256/67256eq3.jpg">. Determinare il volume totale di 4-HAU necessario: V = 3 ml x Numero di micropiastre. Quindi, calcolare i volumi richiesti della soluzione madre dell'antigene: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/67256/67256eq5.jpg">, e PBS: Vp = V - Va. NOTA: I volumi sono misurati in millilitri. Stimare 3 mL per piastra per microtitolazione del 4-HAU (25 μL/pozzetto x 96 pozzetti x 1,25 = 3 mL).</li>
	<li>Pipettare il volume calcolato di PBS in un contenitore, quindi aggiungere il volume corrispondente di soluzione madre di antigene e mescolare bene per ottenere la soluzione di antigene 4-HAU. NOTA: La soluzione di antigene 4-HAU deve essere utilizzata il prima possibile.</li>
</ol>
5. Titolazione inversa della soluzione di antigene 4-HAU
<ol>
	<li>Erogare 25, 50, 75, 100, 125 e 150 μl di PBS in sei pozzetti adiacenti di una piastra per microtitolazione, quindi aggiungere 25 μl della soluzione di antigene 4-HAU a ciascun pozzetto e mescolare pipettando su e giù 10 volte. NOTA: Diluire la soluzione dell'antigene 4-HAU con PBS a diluizioni di 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 e 1:7. Un diagramma schematico dell'operazione di diluizione è mostrato nella Figura 3.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67256/67256fig3.jpg"> 
Figura 3: Diagramma schematico della procedura di diluizione della soluzione di 4 unità di emoagglutinazione in retrotitolazione. La soluzione di lavoro 4-HAU è diluita con PBS in rapporti di 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 e 1:7. La PBS è raffigurata in blu e gli antigeni in verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67256/67256fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="2">
	<li>Trasferire 25 μl di ciascuna soluzione di antigene diluita nei pozzetti di un'altra fila utilizzando una pipetta multicanale. Aggiungere 25 μL di PBS a un pozzetto extra come controllo negativo.</li>
	<li>Aggiungere 25 μL di PBS in ciascun pozzetto, quindi aggiungere 25 μL di RBC di pollo all'1% in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Agitare la piastra su un agitatore per micropiastre per ~20 s per mescolare.</li>
	<li>Lasciarlo indisturbato sul banco di lavoro a temperatura ambiente (20-25 °C) per ~30 minuti fino a quando i globuli rossi del controllo negativo non si sono completamente stabilizzati.</li>
	<li>Leggi e registra i risultati. NOTA: Il pozzetto del controllo negativo non dovrebbe mostrare HA. Idealmente, la diluizione 1:4 è esattamente la diluizione più alta con l'HA completo. Se il titolo della soluzione di 4-HAU è superiore a 4, la diluizione massima può essere 1:5, 1:6 o 1:7; se inferiore, può essere 1:2 o 1:3. Nella Figura 4 è mostrato uno schema schematico della titolazione inversa e i risultati rappresentativi.</li>
</ol>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67256/67256fig4.jpg"> 
Figura 4: Layout schematico dei pozzetti per la titolazione inversa e risultato rappresentativo. La soluzione di lavoro 4-HAU diluita viene trasferita su una nuova fila, con l'aggiunta di un ulteriore controllo PBS. Il gradiente dal verde scuro al verde chiaro indica la concentrazione dell'antigene da alta a bassa. Risultati rappresentativi dimostrano che la diluizione 1:4 è la diluizione più alta che mostra un'emoagglutinazione completa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67256/67256fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="7">
	<li>Se necessario, regolare o riformulare la soluzione dell'antigene 4-HAU. NOTA: Se il volume della soluzione di antigene 4-HAU utilizzata nella titolazione inversa è ≤1% del volume totale (il volume della soluzione di antigene 4-HAU ≥ 15 ml), fare riferimento alla Tabella 2 per gli aggiustamenti specifici. Ad esempio, se la diluizione più alta con l'HA completo è 1:2, il titolo della soluzione di antigene 4-HAU è ora 2 e deve essere aggiunto un volume di antigene uguale a quello della precedente preparazione della soluzione di antigene 4-HAU. Al contrario, se la diluizione più alta dell'HA completo è 1:6, il titolo è ora 6 e metà del volume di PBS dovrebbe essere reintegrato. Se il volume utilizzato nella titolazione inversa supera l'1% del totale (il volume della soluzione di antigene 4-HAU &lt; 15 mL), riformulare la soluzione di antigene 4-HAU utilizzando il fattore di diluizione corretto. Fare riferimento alla Tabella 3 per le correzioni specifiche. Ad esempio, se la diluizione più alta dell'HA completo è 1:2, il titolo della soluzione di antigene 4-HAU è ora 2 e il fattore di diluizione deve essere regolato a 1/2 dell'originale. Al contrario, se la diluizione più alta dell'HA completo è 1:6, il titolo della soluzione di antigene 4-HAU è ora 6 e il fattore di diluizione viene regolato a 3/2 dell'originale.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Titolo HA della titolazione inversa</td>
			<td>Rifornimento di antigene o PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:2</td>
			<td>Va</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:3</td>
			<td>Va/3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:5</td>
			<td>Vp/4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:6</td>
			<td>Vp/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:7</td>
			<td>3Vp/4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2: Tabella di riferimento per la regolazione della concentrazione di 4-HAU in base ai risultati della titolazione inversa. Va e Vp rappresentano rispettivamente i volumi di antigene e PBS utilizzati nella formulazione della soluzione di antigene 4-HAU.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Titolo HA della titolazione inversa</td>
			<td>Correzione del fattore di diluizione</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:2</td>
			<td>D/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:3</td>
			<td>3D/4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:5</td>
			<td>5D/4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:6</td>
			<td>3D/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:7</td>
			<td>7D/4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 3: Tabella di riferimento della correzione del fattore di diluizione per la ripreparazione dell'antigene 4-HAU. D rappresenta il fattore di diluizione precedentemente utilizzato nella preparazione dell'antigene 4-HAU.
6. Preparazione del siero
<ol>
	<li>Raccogliere ~1 ml di sangue dalle ali di pollo senza utilizzare un anticoagulante.</li>
	<li>Trasferire il sangue in una provetta da centrifuga da 1,5 mL e incubare a 37 °C per ~2 ore. Centrifugare a 3.000 x g per 10 minuti e aspirare con cura il surnatante in una nuova provetta.</li>
</ol>
7. Saggio HI
<ol>
	<li>Etichettare le piastre per microtitolazione in base al layout del saggio. Aggiungere 25 μl di PBS a ciascun pozzetto nelle colonne 1-11 e 50 μl ai pozzetti nella colonna 12, utilizzando una pipetta multicanale.</li>
	<li>Aggiungere 25 μl di siero al primo pozzetto di ogni fila, comprese le righe di controllo del siero positive e negative. Miscelare accuratamente pipettando su e giù almeno 5 volte.</li>
	<li>Trasferire 25 μl dal primo pozzetto di ogni fila al secondo pozzetto e mescolare accuratamente. Continuare a trasferire e mescolare dal secondo pozzetto al terzo, e così via, fino alla 10° colonna. Scartare 25 μl di liquido dal pozzetto nella 10a colonna dopo la miscelazione.</li>
	<li>Aggiungere 25 μl di antigene 4-HAU a ciascun pozzetto nelle colonne 1-11 nella direzione della concentrazione sierica da bassa ad alta.</li>
	<li>Agitare la piastra su un agitatore per micropiastre per ~20 s. Lasciarlo indisturbato sul piano di lavoro per ~30 minuti.</li>
	<li>Aggiungere 25 μl di globuli rossi di pollo all'1% in ciascun pozzetto nella direzione di una concentrazione sierica da bassa ad alta.</li>
	<li>Agitare la piastra su un agitatore per micropiastre per ~20 s per mescolare accuratamente. Lasciarlo indisturbato sul banco di lavoro per ~30 minuti fino a quando i globuli rossi dei pozzetti di controllo PBS non si sono completamente stabilizzati.</li>
	<li>Leggi e registra i risultati. NOTA: Il titolo HI è la più alta diluizione sierica che inibisce completamente l'emoagglutinazione dell'antigene 4-HAU. Il flusso a forma di lacrima di globuli rossi può essere osservato nell'ultima colonna di ogni fila, inclinando la piastra di 90° per 25 s. L'HA completo (senza flusso) può essere osservato nel penultimo pozzetto dalla fine di ogni fila. I risultati validi del test richiedono che il titolo HI del controllo sierico positivo sia entro una diluizione del titolo HI noto; il titolo HI del controllo sierico negativo deve essere ≤ 2 log2; e l'assenza di auto-HA del controllo RBC. Per un diagramma schematico del flusso di lavoro del saggio HA, vedere la Figura 5.</li>
</ol>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67256/67256fig5.jpg"> 
Figura 5: Diagramma schematico del flusso di lavoro del saggio di emoagglutinazione. La PBS è rappresentata in blu, il siero in giallo, la soluzione dell'antigene 4-HAU in verde e la sospensione di globuli rossi di pollo all'1% in rosso. Le frecce indicano l'ordine di erogazione dei liquidi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67256/67256fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<meta charset="utf8"></head><body>Preparazione semplificata dell'antigene 4-HAU per un rilevamento accurato degli anticorpi NDV

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<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HN+protein+of+Newcastle+disease+virus+induces+cell+apoptosis+through+the+induction+of+lysosomal+membrane+permeabilization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The HN protein of Newcastle disease virus induces cell apoptosis through the induction of lysosomal membrane permeabilization.</a> PLoS Pathog. 20 (2), e1011981(2024).</li>
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</ol>

Il metodo ottimizzato proposto in questo articolo presenta un approccio per preparare accuratamente la soluzione dell'antigene 4-HAU. Sebbene le linee guida dell'OIE e dell'UE suggeriscano diluizioni iniziali per la titolazione dell'HA, non forniscono dettagli precisi sui rapporti di diluizione da utilizzare né offrono metodologie specifiche11,12. Inoltre, sebbene la FAO e l'OIE raccomandino la titolazione inversa come mezzo per migliorare l'accuratezza del 4-HAU, mancano di un proto...

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Provetta da centrifuga sterile (15 mL)&nbsp;</td><td>Labshark</td><td>130201030</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da tavolo a bassa velocità raffreddata ad aria&nbsp;</td><td>Titan</td><td>LDC-5</td><td></td></tr><tr><td>Alserve's Solution</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607058</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>DLAB</td><td>9032002121</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta monouso Pasteur</td><td>Titan</td><td>SWXG-004</td><td></td></tr><tr><td>Siringa sterile monouso (1 mL)</td><td>Beyotime</td><td>FS801-30PCS</td><td></td></tr><tr><td>Piastra monouso per microtitolazione con fondo a V (96 pozzetti)</td><td>Labshark</td><td></td><td></td>130207001</tr><tr><td>Agitatore per micropiastre</td><td>Jiangsu Xinkang Medical Equipment Co., Ltd</td><td>XK96-3</td><td></td></tr><tr><td>NDV HI Sieri negativi</td><td>Qingdao Regen Diagnostics Development Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NDV HI Sieri positivi</td><td>Qingdao Regen Diagnostics Development Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NDV HI Test Antigen</td><td>Qingdao Regen Diagnostics Development Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS Soluzione (1x)&nbsp;</td>Provetta da centrifuga sterile <td>Adamas Life</td><td>C8020</td><td></td></tr><tr><td>(1,5 mL)</td><td>Labshark</td><td>130201012</td><td></td></tr></tbody></table>

ottimizzazione della preparazione dell'antigene per il test di inibizione dell'emoagglutinazione della sierologia del virus della malattia di newcastle

Optimization of Antigen Preparation for Hemagglutination Inhibition Assay of Newcastle Disease Virus Serology

Validazione del titolo della soluzione di antigene 4-HAU formulata con il metodo ottimizzato Lo studio ha impiegato varie diluizioni della soluzione madre dell'antigene per determinare con precisione il titolo di HA, facilitando il calcolo del fattore di diluizione per la preparazione della soluzione antigenica 4-HAU. I risultati rivelano che il metodo ottimizzato è efficiente e preciso, riducendo il numero di procedure ripetitive di titolazione e regolazione inversa. Nel primo scenario, un titolo ini...

Ottimizzazione della preparazione dell'antigene per il test di inibizione dell'emoagglutinazione della sierologia del virus della malattia di Newcastle

Accurate assessment of Newcastle disease virus (NDV) antibody titers is crucial for effective poultry disease control and surveillance. This article ...

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Il video mostra un test di inibizione dell'emoagglutinazione per rilevare anticorpi sierici contro antigeni specifici. La conferma dell'inibizione dell'emoagglutinazione nel pozzetto del test e dell'emoagglutinazione nel pozzetto di controllo si ottiene attraverso modelli visivi distinti. Questo test svolge un ruolo cruciale nella valutazione della risposta immunitaria, dell'efficacia del vaccino e nello studio delle infezioni virali in virologia e immunologia.

Il test di inibizione dell'emoagglutinazione per rilevare gli anticorpi sierici contro un antigene bersaglio

Questo video mostra saggi di microneutralizzazione per misurare gli anticorpi neutralizzanti utilizzando cellule renali canine Madin-Darby che sovraesprimono l'acido sialico legato all'α2,6 in sieri umani. Questo test è spesso utilizzato per la sierologia umana...

Un test di microneutralizzazione per misurare i titoli anticorpali neutralizzanti nel siero umano

Questo video mostra un test che misura i titoli anticorpali inibitori della neuraminidasi dell'influenza (NA) in un campione di siero. Un campione di siero contenente anticorpi contro NA viene aggiunto a una piastra a micropozzetti rivestita di fetuina. Dopo l'aggiunta del virus, gli anticorpi impediscono al NA virale di scindere la fetuina ed esporre la sua porzione di galattosio. Viene quindi aggiunta una lectina coniugata con perossidasi, che si lega al galattosio esposto. Il titolo...

Un test per misurare i titoli anticorpali di inibizione della neuraminidasi dell'influenza

Virus della malattia di Newcastle (NDV) è stata ampiamente studiata negli ultimi anni per sviluppare nuovi vettori per la vaccinazione e terapia, tra gli altri. Questi studi sono stati possibili a causa di tecniche di salvataggio virus ricombinante da cDNA, come quelle descritte.

Salvataggio di virus ricombinante malattia di Newcastle da cDNA

Qui, vi presentiamo un protocollo per generare una prova di principio di tipo bivalente adenovirus 5 (Ad5) vettore Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 utilizzando la strategia di Antigen Capside-incorporazione. Questo vettore è stato dimostrato per esporre idoneità qualitativa, la capacità di sfuggire sieri Ad5-positivi in vitro, e l'antigenicità e immunogenicità agli antigeni incorporati.

Utilizzando la strategia di Antigen Capside-Incorporation per lo sviluppo di approcci Adenovirus sierotipo 5 Vectored vaccino

Descriviamo il test della lectina enzimatica (ELLA) per misurare i titoli anticorpali di inibizione della neuraminidasi dell'influenza (NA) nei sieri. Il test utilizza l'agglutinina di arachidi per quantificare i residui di galattosio che diventano accessibili quando NA rimuove l'acido sialico da piastre a 96 pozzetti rivestite di fetuina.

Misurare Influenza neuraminidasi Inibizione anticorpo I titoli da Enzyme-linked lectina Assay

Questo studio descrive un   di imaging basata su test di micro-neutralizzazione per analizzare le relazioni antigeniche tra virus. Il protocollo impiega uno scanner piano ed ha quattro fasi, tra cui la titolazione, la titolazione quantificazione, neutralizzazione, e la neutralizzazione quantificazione. Il test funziona bene con corrente circolante pdm09 influenza A (H1N1), A (H3N2), e virus B.

Ottimizzazione di un Quantitative Micro-neutralizzazione Assay

I protocolli presentati viene descritto come eseguire un'analisi di inibizione di emagglutinazione per quantificare i titoli dell'anticorpo specifico dell'influenza da campioni di siero dei destinatari del vaccino di riossidazione. Il primo test determina concentrazioni di antigene virale ottimale di emagglutinazione. Il secondo test quantifica i titoli dell'anticorpo specifico dell'influenza di inibizione di emagglutinazione.

Un'analisi di inibizione (HI) ottimizzato emagglutinazione per quantificare i titoli dell'anticorpo specifico dell'Influenza

Qui forniamo una procedura dettagliata per la produzione, la purificazione e la quantificazione del virus della malattia di Newcastle ricombinante ad alto titolo. Questo protocollo produce costantemente &gt; 6 × 109 unità di formazione della placca / mL, fornendo quantità di virus appropriate per studi su animali in vivo . Vengono descritti ulteriori saggi di controllo della qualità per garantire la sicurezza in vivo .

Produzione di virus della malattia di Newcastle ricombinante ad alto titolo dal liquido allantoico

Descriviamo un metodo per elaborare e schermo campo raccolti zanzare per una varietà di virus mediante test Vero colture cellulari. Utilizzando questa tecnica, abbiamo rilevato 9 virus diversi da 4 famiglie tassonomiche nelle zanzare raccolte nel Connecticut.

Il rilevamento del virus infettivo da Campo-zanzare raccolte mediante test coltura cellulare Vero

Scopri un metodo ottimizzato per la preparazione dell'antigene 4-HAU per il test di inibizione dell'emoagglutinazione del virus della malattia di Newcastle. Questo approccio migliora l'accuratezza del rilevamento degli anticorpi e supporta la sorveglianza della salute avicola.

Ottimizzazione della preparazione dellantigene per il test di inibizione dellemoagglutinazione della sierologia del virus della malattia di Newcastle (Video) | JoVE Journal

Ottimizzazione della preparazione dell'antigene per il test di inibizione dell'emoagglutinazione della sierologia del virus della malattia di Newcastle

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