Name: Monitoraggio dei cambiamenti indotti dallelettroporazione nella generazione di potenziale dazione nelle cellule HEK Tet-On Spiking geneticamente modificate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Scopri come monitorare gli effetti dell'elettroporazione sulla generazione di potenziali d'azione nelle cellule HEK Tet-On Spiking. Questo metodo ottico semplifica lo studio delle cellule eccitabili per applicazioni cliniche.

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<meta charset="utf8"></head><body>Valutazione degli effetti dell'elettroporazione su cellule HEK spiking geneticamente modificate

<ol><li>Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+electroporation+and+electropermeabilization%3A+Mechanisms+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Membrane electroporation and electropermeabilization: Mechanisms and models.</a> Ann Rev Biophys. 48 (1), 63-91 (2019).</li>
<li>Yarmush, M. L., Golberg, A., Serša, G., Kotnik, T., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+technologies+for+medicine%3A+principles%2C+applications%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges.</a> Ann Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).</li>
<li>Kotnik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+applications+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based applications in biotechnology.</a> Trend Biotechnol. 33 (8), 480-488 (2015).</li>
<li>Mahnič-Kalamiza, S., Vorobiev, E., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+in+food+processing+and+biorefinery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Memb+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation in food processing and biorefinery.</a> J Memb Biol. 247 (12), 1279-1304 (2014).</li>
<li>Reddy, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+field+or+conventional+thermal+ablation+for+paroxysmal+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Pulsed field or conventional thermal ablation for paroxysmal atrial fibrillation.</a> New Engl J Med. 389 (18), 1660-1671 (2023).</li>
<li>Cvetkoska, A., Maček-Lebar, A., Trdina, P., Miklavčič, D., Reberšek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+contractions+and+pain+sensation+accompanying+high-frequency+electroporation+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Muscle contractions and pain sensation accompanying high-frequency electroporation pulses.</a> Sci Rep. 12 (1), 8019(2022).</li>
<li>Tung, L., Tovar, O., Neunlist, M., Jain, S. K., O'neill, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+strong+electrical+shock+on+cardiac+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+New+York+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of strong electrical shock on cardiac muscle tissue.</a> Ann New York Acad Sci. 720 (1), 160-175 (1994).</li>
<li>Batista Napotnik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+HEK+cells+as+a+valuable+tool+for+studying+electroporation+in+excitable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered HEK cells as a valuable tool for studying electroporation in excitable cells.</a> Sci Rep. 14 (1), 720(2024).</li>
<li>McNamara, H. M., Zhang, H., Werley, C. A., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically+controlled+oscillators+in+an+engineered+bioelectric+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+X%22%5BJournal%5D)">Optically controlled oscillators in an engineered bioelectric tissue.</a> Phys Rev X. 6 (3), 031001(2016).</li>
<li>Tian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-based+pooled+screening+yields+improved+far-red+genetically+encoded+voltage+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Video-based pooled screening yields improved far-red genetically encoded voltage indicators.</a> Nat Methods. 20 (7), 1082-1094 (2023).</li>
<li>Sweeney, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cell+membrane+permeability+induced+by+monopolar+and+high-frequency+bipolar+bursts+of+electrical+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Quantification of cell membrane permeability induced by monopolar and high-frequency bipolar bursts of electrical pulses.</a> Biochim Biophys Acta Biomembranes. 1858 (11), 2689-2698 (2016).</li>
<li>Pakhomov, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+plasma+membrane+permeabilization+in+mammalian+cells+by+nanosecond+pulsed+electric+field+%28nsPEF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectromagnetics%22%5BJournal%5D)">Long-lasting plasma membrane permeabilization in mammalian cells by nanosecond pulsed electric field (nsPEF).</a> Bioelectromagnetics. 28 (8), 655-663 (2007).</li>
<li>Lee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+ratiometric+optical+mapping+enables+high-resolution+cardiac+electrophysiology+in+pig+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo ratiometric optical mapping enables high-resolution cardiac electrophysiology in pig models.</a> Cardiovasc Res. 115 (11), 1659-1671 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Provetta da 1,5 mL</td><td>Ratiolab&nbsp;</td><td>5615000</td><td></td></tr> 2 <tr><td>pozzetti Nunc Lab-Tek II Camerato #1.5 Sistema tedesco di vetro di copertura</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>155379</tr><tr><td>ADP305 Sonda di tensione differenziale</td><td>Teledyne LeCroy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AP015 Sonda di corrente</td><td>Teledyne LeCroy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>A1113903</tr><tr><td>Incubatore a CO2&nbsp;</td><td>PHCbi&nbsp;</td><td>MCO -230AICUV</td><td></td></tr><tr><td>Doxiciclina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aquila Modidata' s Medium high glucose growth medium</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>ElectroFluor630 (Di-4-ANEQ(F)PTEA)sonde</td> <td>potenziometriche</td><td>31795</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10131035</tr><tr><td>Glutammine</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Cappa a flusso laminare</td><td>Iskra Pio</td><td>MC 15-2</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillina&ndash; streptomicina</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>P07681</td><td></td></tr><tr><td>Po-L-lisina bromidrato&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>P9155-5MG&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Generatore di impulsi&nbsp;</td><td>Su</td><td></td> misura <td>vedi riferimento11</td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>A1113803</tr><tr><td>T25 25cm&sup2; Pallone per coltura tissutale</td><td>TPP&nbsp;</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>Cellule HEK Tet-on spiking</td> American <td>Type Culture Collection ATCC</td><td>CRL-3479</td><td></td></tr><tr><td>Thunder Imager Sistema di cellule vive per microscopia a fluorescenza</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>WavePro 7300A Oscilloscopio</td><td>Teledyne LeCroy</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

monitoraggio dei cambiamenti indotti dall'elettroporazione nella generazione di potenziale d'azione nelle cellule hek tet-on spiking geneticamente modificate

Monitoring Electroporation-Induced Changes in Action Potential Generation in Genetically Engineered Tet-On Spiking HEK cells

Con questo protocollo è possibile monitorare otticamente i cambiamenti di TMV nelle cellule eccitabili in vitro innescati da impulsi elettrici e analizzare i segnali di fluorescenza per estrarne i parametri rilevanti.
La configurazione sperimentale è mostrata nella Figura 1A. Un segnale tipico di impulso elettrico di 100 μs utilizzato negli esperimenti è mostrato nella Figura 1B. Le cellule nelle camere poste al microscopio assomigliano tipicamente alle cellule della Figura 1C (immagine in campo chiaro) e della Figura 1D (immagine a fluorescenza). Eseguiamo un esperimento in cui ogni 2 minuti viene applicato un impulso elettrico con tensione crescente alle stesse celle. Si noti che il tempo di interimpulso di 2 minuti potrebbe non essere sufficientemente lungo per consentire la completa richiusura e il recupero delle membrane cellulari, specialmente quando si utilizzano impulsi della massima ampiezza, che sono associati a un'elettroporazione prominente. Pertanto, ci si può aspettare alcuni effetti cumulativi degli impulsi. Per evitare questi effetti cumulativi, il ritardo tra gli impulsi può essere esteso, ma a scapito della riduzione del numero delle ampiezze degli impulsi testate e dell'evitare di tenere le cellule al microscopio troppo a lungo.
Dopo aver acquisito le immagini a fluorescenza negli esperimenti, analizzale con l'applicazione MATLAB personalizzata. Innanzitutto, determinare le soglie di pixel (Figura 2A); Regolando la soglia bassa, otteniamo un'immagine chiara delle membrane intorno alle cellule (in viola) e regolando la soglia alta, rimuoviamo il segnale dei detriti (verde). L'applicazione determina quindi l'intensità media della fluorescenza di tutti i pixel di soglia per ogni impulso consecutivo erogato per ottenere un segnale dipendente dal tempo della variazione relativa della fluorescenza F/F0. Questo segnale viene corretto per il fotobleaching del colorante sottraendo la pendenza della diminuzione lineare di F determinata dalla registrazione time-lapse di controllo in cui non è stato applicato alcun impulso (Figura 2B). Dopo aver corretto il segnale, i parametri delle risposte vengono estratti sotto forma di una tabella in-app e di un grafico del segnale di fluorescenza corretto (Figura 2C). In rari casi, l'algoritmo non rileva un picco evidente o rileva segnali di rumore spuri come falsi positivi. In questi casi, l'utente ha la possibilità di selezionare manualmente il punto corrispondente nel segnale di fluorescenza come picco o di rimuovere il falso picco rilevato (Figura 2D - rimozione di un piccolo picco che è stato rilevato in modo anomalo prima dell'applicazione dell'impulso elettrico).
Utilizzando l'applicazione MATLAB, possiamo ottenere immagini delle risposte TMV agli impulsi elettrici sia in celle S-HEK eccitabili (Figura 3A) che in celle NS-HEK non eccitabili (Figura 3B). Vengono estratti i seguenti parametri di risposta (Tabella 1): numero di picchi (NoPeaks), tempo medio picco-picco (quando viene rilevato più di un picco, MPPT), risposta massima (MR), tempo al primo picco (TtFP) e tempo dal picco al 25%, 50%, 75% e 90% di recupero (T25, T50, T75, T90, rispettivamente). Questi parametri consentono la valutazione delle risposte a diversi impulsi elettrici (ad esempio, determinare il numero di picchi innescati da impulsi elettrici di diverso E, Figura 3C) e l'interazione tra eccitazione ed elettroporazione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67257/67257fig01.jpg"> 
Figura 1: La configurazione, la forma d'onda e le cellule S-HEK. (A) L'immagine della camera sul tavolino del microscopio. (B) Esempio della forma d'onda di un impulso utilizzato nello studio (tensione (U) nel tempo). (C, D) L'immagine delle celle S-HEK ((C): campo chiaro, (D): fluorescenza), barra della scala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67257/67257fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67257/67257fig02v2.jpg"> 
Figura 2: Applicazione per l'analisi dei dati. (A) L'immagine dell'interfaccia dell'applicazione - soglia. (B) Il grafico del segnale grezzo e corretto della variazione di fluorescenza. (C) L'immagine dell'interfaccia dell'applicazione - dati estratti. (D) Correzione manuale del rilevamento dei picchi (rimozione di un piccolo picco che è stato rilevato in modo anomalo prima dell'applicazione dell'impulso elettrico, contrassegnato da una freccia rossa). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67257/67257fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67257/67257fig03v2.jpg"> 
Figura 3: Risultati rappresentativi. (A, B) Attivazione di cambiamenti nel TMV in (A) S-HEK eccitabile e (B) NS-HEK non eccitabile con impulsi elettrici di 100 μs di diverse ampiezze, risultati di esperimenti rappresentativi. Per chiarezza, vengono mostrate solo le risposte agli impulsi selezionati nella sequenza di impulsi applicata. (C) I parametri delle risposte TMV attivate dagli impulsi da 100 μs di diverse ampiezze: l'esempio mostra il numero di picchi. I risultati sono espressi come media ± SE, numero di esperimenti: N = 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67257/67257fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Indice</td>
			<td>Forza E (V/cm)</td>
			<td>Nessun picco (-)</td>
			<td>Produttore di energia MPPT (manoscritti)</td>
			<td>SIGNOR (-)</td>
			<td>TtFP (manoscritti)</td>
			<td>T25 (manoscritti)</td>
			<td>T50 (manoscritti)</td>
			<td>T75 (manoscritti)</td>
			<td>T90 (manoscritti)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>126</td>
			<td>9</td>
			<td>224</td>
			<td>0.104</td>
			<td>360</td>
			<td>72</td>
			<td>108</td>
			<td>144</td>
			<td>180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>150</td>
			<td>6</td>
			<td>354</td>
			<td>0.097</td>
			<td>108</td>
			<td>72</td>
			<td>108</td>
			<td>144</td>
			<td>180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>176</td>
			<td>2</td>
			<td>144</td>
			<td>0.089</td>
			<td>36</td>
			<td>72</td>
			<td>108</td>
			<td>144</td>
			<td>180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>200</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td>0.075</td>
			<td>0</td>
			<td>108</td>
			<td>144</td>
			<td>180</td>
			<td>252</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>250</td>
			<td>2</td>
			<td>396</td>
			<td>0.064</td>
			<td>0</td>
			<td>108</td>
			<td>216</td>
			<td>432</td>
			<td>2052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>300</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td>0.059</td>
			<td>0</td>
			<td>180</td>
			<td>1188</td>
			<td>2448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>350</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td>0.053</td>
			<td>0</td>
			<td>1008</td>
			<td>2340</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>400</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td>0.047</td>
			<td>0</td>
			<td>1512</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Parametri delle risposte TMV attivate dagli impulsi di 100 μs di diverse ampiezze.

Monitoraggio dei cambiamenti indotti dall'elettroporazione nella generazione di potenziale d'azione nelle cellule HEK Tet-On Spiking geneticamente modificate

Excitable cells such as&#160;neuronal and muscle cells can be primary targets in rapidly emerging electroporation-based treatments. However, they can be ...

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