Monitoraggio dei cambiamenti indotti dall'elettroporazione nella generazione di potenziale d'azione nelle cellule HEK Tet-On Spiking geneticamente modificate

L'elettroporazione aumenta temporaneamente la permeabilità della membrana cellulare per mezzo di impulsi elettrici ad alta tensione. Esistono diversi trattamenti clinici in rapido sviluppo basati sull'elettroporazione che prendono di mira le cellule muscolari e neuronali. È quindi fondamentale studiare come l'elettroporazione influenzi la capacità di queste cellule eccitabili di innescare potenziali d'azione.

Gli esperimenti in vitro sono molto importanti per comprendere gli effetti dell'elettroporazione sulle cellule eccitabili. Tuttavia, i miociti primari e i neuroni hanno un profilo di espressione dei canali ionici molto complesso che rende estremamente difficile districare l'interazione tra eccitazione ed elettroporazione. Abbiamo sviluppato un protocollo per monitorare i cambiamenti indotti dall'elettroporazione nella generazione del potenziale d'azione utilizzando celle HEK tet-on spiking.

Queste cellule esprimono un complemento minimo di canali del sodio e del potassio che le rendono eccitabili. Pertanto, questa cella ha semplificato gli esperimenti e l'analisi teorica dei risultati ottenuti. Utilizzando il nostro protocollo, abbiamo scoperto che un'elettroporazione molto lieve può già influenzare notevolmente l'accettabilità cellulare.

Questi risultati apriranno la strada allo sviluppo di modelli teorici di elettroporazione e accettabilità cellulare, e questo aiuterà la comunità a migliorare le terapie basate sull'elettroporazione in rapida ascesa nel cuore, nel cervello e nei muscoli scheletrici. Per iniziare, pipettare un millilitro di PBS in un pozzetto dei vetrini della camera di vetro con coperchio a due pozzetti. Aggiungere 10 microlitri di soluzione sterile di poli-L-lisina da un milligrammo per millilitro e mescolare bene con una pipetta.

Incubare per 1,5 ore a temperatura ambiente in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare, quindi rimuovere il PBS con poli-L-lisina senza ulteriori lavaggi. Per seminare le cellule, preparare una diluizione da una a 10 di soluzione madre di doxiciclina in un terreno di coltura in una provetta da 1,5 millilitri. Ora, rimuovere il terreno di coltura dal pallone T-25.

Tripsinizzare le cellule con 2,5 millilitri di soluzione di tripsina EDTA in un incubatore ad anidride carbonica a 37 gradi Celsius per due minuti. Aggiungere 2,5 millilitri di terreno di coltura fresco e pipettare delicatamente le cellule per staccarle dalla superficie. Calcolare il volume della sospensione cellulare tripsinizzata necessaria per stabilire la coltura.

Sottrarre il volume della sospensione cellulare precedentemente calcolato da 1.470 microlitri per calcolare il volume del terreno di coltura. Per preparare i campioni con cellule S HEK eccitabili, pipettare il volume calcolato del terreno di coltura e la sospensione cellulare tripsinizzata in un unico pozzetto. Aggiungere 30 microlitri di diluizione della doxiciclina.

Mescolare bene pipettando delicatamente appena prima di posizionare le camere nell'incubatore ad anidride carbonica. Per preparare campioni con cellule NS HEK non eccitabili, pipettare il volume calcolato di terreno di coltura in un pozzetto e aggiungere il 90% del volume calcolato di sospensione cellulare per le cellule S HEK senza doxiciclina. Incubare le camere in un incubatore al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per due o tre giorni prima dell'esperimento.

Prima dell'esperimento, pipettare tre microlitri di soluzione madre di colorante potenziometrico in una provetta da 1,5 millilitri. Lasciare la provetta aperta a temperatura ambiente in una cappa a flusso laminare per circa 15 minuti per consentire all'etanolo di evaporare e al colorante potenziometrico di asciugarsi, quindi aggiungere 997 microlitri di terreno di coltura freddo a quattro gradi Celsius alla provetta per sciogliere il colorante a una concentrazione finale di 12 micromolari. Quindi, rimuovere il terreno di coltura dal pozzetto.

Aggiungere un millilitro di soluzione colorante potenziometrica alle cellule. Refrigerare le celle a quattro gradi Celsius e incubarle per 20 minuti. Successivamente, rimuovere la soluzione colorante potenziometrica e conservarla in un tubo per un ulteriore riutilizzo per un massimo di sei esperimenti sequenziali in un giorno.

Lavare delicatamente le celle tre volte con la soluzione di tyrode. Dopo l'ultimo lavaggio, pipettare un millilitro di soluzione di tyrode a basso contenuto di potassio nel pozzetto. Per iniziare, preparare le celle HEK per l'elettroporazione, quindi configurare la sincronizzazione dell'erogazione dell'impulso con l'acquisizione dell'immagine utilizzando un segnale TTL dal sistema del microscopio che attiva il generatore di impulsi.

Nella parte inferiore della camera, posizionare due elettrodi paralleli a filo di platino-iridio con un diametro di 0,8 millimetri e una distanza di cinque millimetri tra i bordi interni. Fissare la camera al microscopio, quindi collegare gli elettrodi al generatore di impulsi. Utilizzando una sonda di tensione e corrente, collegare l'uscita del generatore di impulsi a un oscilloscopio per consentire la verifica della corretta erogazione degli impulsi durante l'esperimento.

Focalizzare le celle sul campo luminoso e visualizzare le celle situate al centro tra gli elettrodi. Acquisisci 80 immagini in modalità time-lapse a una velocità di almeno 25 fotogrammi al secondo. Illuminare le celle con una lunghezza d'onda di eccitazione di 635 nanometri, impostare il tempo di esposizione a 10 millisecondi e rilevare l'emissione a circa 700 nanometri.

Dopo l'acquisizione, attendere due minuti. Regolare la tensione sull'interfaccia del generatore di impulsi a 63 volt. Registra un time-lapse allo stesso modo ogni due minuti.

Durante queste acquisizioni, applicare un singolo impulso di 100 microsecondi al momento dell'acquisizione della decima immagine. Acquisizione di immagini con tensioni di impulso di 63, 75, 88, 100, 125, 150, 175 e 200 volt. Stimare il campo elettrico a cui sono esposte le celle come il rapporto tensione-distanza elettrodo applicato.

Per l'analisi dei dati, esportare le registrazioni time-lapse in formato TIFF, quindi inserire tutte le registrazioni time-lapse delle tensioni applicate da un singolo esperimento in un'unica cartella. Rinomina ogni registrazione time-lapse in modo che MATLAB possa riconoscere il campo elettrico. Per l'acquisizione all'inizio dell'esperimento, dove non viene applicato alcun impulso, rinominarlo utilizzando la frase 000Vcm.

Successivamente, apri l'applicazione scaricata da GitHub. Clicca su Seleziona cartella dati"per scegliere la cartella contenente le registrazioni time-lapse di un esperimento. Per selezionare i pixel, utilizzare due cursori per determinare la soglia bassa per un'immagine chiara delle membrane e la soglia alta per l'eliminazione dei detriti dall'analisi.

Ora, fai clic su Analizza dati. Nella scheda Analisi, apparirà una tabella con i parametri estratti. Sul lato destro della tabella verranno visualizzati i grafici della fluorescenza relativa nel tempo per ogni campo elettrico utilizzato.

Seleziona i grafici per un dato campo elettrico dal menu a tendina sul lato sinistro sopra la tabella. Esamina tutti i grafici ed esegui la correzione manuale in caso di rilevamento di falsi picchi. selezionare Cancella picchi AUTO"nella parte inferiore della scheda Analisi" per cancellare i picchi rilevati automaticamente.

Fare clic sul grafico per determinare manualmente un nuovo punto dell'ora di picco. Se necessario, selezionare Esegui nuovamente il rilevamento dei picchi AUTOMATICO"nella parte inferiore della scheda Analisi" per eseguire nuovamente il rilevamento automatico dei picchi. I parametri estratti verranno ora regolati in base al nuovo picco.

Successivamente, seleziona Esporta dati"in basso a destra della scheda Analisi" per esportare i dati nella stessa cartella come un file dotmap, un file di foglio di calcolo e immagini PNG per ogni campo elettrico utilizzato. Impulsi elettrici di 126 volt per centimetro hanno innescato picchi multipli di fluorescenza nelle celle eccitabili, come dimostrato dalle distinte oscillazioni nel cambiamento di fluorescenza nel tempo. Con l'aumentare dell'intensità del campo elettrico, la risposta è cambiata e ha mostrato una depolarizzazione sostenuta a 400 volt per centimetro.

Le celle non eccitabili non hanno mostrato picchi significativi in risposta alle intensità del campo elettrico più basse, indicando l'assenza di eccitazione. A intensità di campo elettrico più elevate, le celle non eccitabili hanno anche mostrato una depolarizzazione sostenuta, indicando l'elettroporazione. Il numero massimo di picchi nelle celle eccitabili è stato osservato a 150 volt per centimetro, con una tendenza decrescente nel numero di picchi all'aumentare della tensione oltre questo punto.