Quantificazione microscopica in tempo reale e ad alto rendimento del rilascio di trappole extracellulari di neutrofili umani e valutazione della farmacologia degli antagonisti

Abbiamo sviluppato un metodo di microscopia in tempo reale per la quantificazione di trappole extracellulari di neutrofili o NET. Questi NET svolgono un ruolo importante nella difesa immunitaria innata. Tuttavia, è diventato chiaro che l'accumulo di NET nei tessuti contribuisce alla fisiopatologia di molteplici malattie infiammatorie e autoimmuni.

A causa delle implicazioni patologiche dei NET, l'interesse per lo sviluppo di antagonisti della NETosis è aumentato. Per studiare l'inibizione della NETosi, abbiamo sviluppato un metodo di microscopia in tempo reale per la quantificazione del rilascio di NET umano, che ci ha permesso di studiare la NETosi e la sua inibizione in modo ad alto rendimento. I neutrofili sono cellule sensibili e possono modificare la loro reattività agli stimoli durante il processo di purificazione a causa di stress meccanico, microbico e di altro tipo.

Pertanto, è importante convalidare il protocollo di isolamento dei neutrofili per ridurre al minimo l'attivazione dei neutrofili. Quindi questa tecnica consente lo studio del rilascio di NET da individui sani e malati. Inoltre, ci permette di studiare la cinetica di formazione di NET indotta da diversi stimoli fisiologici.

Con questa tecnica di microscopia ad alto rendimento, siamo stati in grado di dimostrare che l'antagonista NETosis CIT-013, un anticorpo monoclonale che ha come bersaglio gli istoni citrullinati 2A e 4, è stato in grado di inibire in modo efficiente il rilascio di NET con un IC 50 o 4.6 nanomolare. Ciò dimostra che questo test è adatto per testare gli antagonisti della NETosis. Dopo aver raccolto il sangue periferico dal volontario sano in una provetta di litio eparina, trasferire il sangue in una nuova provetta da 50 millilitri.

Sciacquare la provetta di litio-eparina con DPBS e trasferirla nella stessa provetta da 50 millilitri, assicurandosi che il rapporto sangue/DPBS sia di 1:1. Dopo la miscelazione, aggiungere il sangue diluito sopra la soluzione del gradiente di densità. Centrifugare il sangue a 400 G per 40 minuti con un'accelerazione e una pausa minime.

Eliminare lo strato superiore di plasma con una pipetta da 10 millilitri. Quindi, utilizzare una pipetta di plastica pasteur per scartare le cellule mononucleate del sangue periferico e la soluzione a gradiente di densità. Agitare delicatamente lo strato contenente eritrociti e neutrofili prima di risospenderlo in 15 millilitri di DPBS.

Aggiungere 25 millilitri di soluzione di destrano al 6% e cloruro di sodio allo 0,9% e mescolare capovolgendo il tubo. Dopo 25 minuti di incubazione, trasferire lo strato superiore di neutrofili in una provetta fresca da 50 millilitri con una pipetta da 10 millilitri e centrifugare a 500 G per 10 minuti. Decantare il tubo per scartare il surnatante e risospendere il pellet in 10 millilitri di tampone di lisi di potassio cloruro di ammonio.

Aggiungere 40 millilitri dello stesso tampone di lisi e incubare a temperatura ambiente capovolgendo continuamente la provetta fino a quando la soluzione diventa traslucida. Centrifugare la provetta a 350 G per 10 minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, lentamente e goccia a goccia, aggiungere cinque millilitri di terreno di coltura, il 10%, sopra il pellet di neutrofili senza mettere i neutrofili in sospensione.

Far roteare delicatamente la provetta fino a quando la maggior parte degli eritrociti presenti sopra il pellet di neutrofili non vengono risospesi nel terreno di coltura. Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere il pellet di neutrofili in 10 millilitri di terreno di coltura, 10%Una volta completamente risospeso, aggiungere fino a 50 millilitri di terreno di coltura 10% e centrifugare la miscela prima di risospendere il pellet in 10 millilitri di trappola extracellulare per neutrofili o tampone per saggio NET. Per iniziare, aggiungere una soluzione di poli-L-lisina allo 0,001% a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius.

Lavare i pozzetti tre volte con 200 microlitri di DPBS e asciugare i pozzetti all'aria. Quindi, sospendi nuovamente il numero richiesto di neutrofili nella trappola extracellulare per neutrofili o nel tampone del saggio NET. Trasferire quattro volte il colorante di DNA concentrato nel tampone di saggio NET in ciascun pozzetto.

Aggiungere stimoli NETosis quattro volte concentrati nel tampone di saggio NET ai pozzetti corrispondenti. Quindi, aggiungere antagonisti NETosis quattro volte concentrati nel tampone del saggio NET e nella sospensione di neutrofili ai pozzetti corrispondenti. Centrifugare la piastra a 100 G per due minuti.

Quindi, inserire la piastra nel sistema di analisi al microscopio su cellule vive posto in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo aver posizionato la piastra di imaging a 96 pozzetti contenente la sospensione di neutrofili in un sistema di analisi al microscopio su cellule vive, aprire il software del sistema. Fare clic su Pianifica per acquisire e fare clic sul pulsante più per avviare.

Quindi, selezionare Scansione in base alla pianificazione e fare clic su Avanti. Per creare un nuovo recipiente da zero, selezionare nuovo nella sezione crea recipiente e fare clic su Avanti. Nella sezione Tipo di scansione, selezionare Standard e fare clic su Avanti.

Selezionare le impostazioni di scansione come cella per cella, nessuna. Canali immagine, contrasto di fase in verde. Tempo di acquisizione, 100 millisecondi e obiettivo 20x.

Quindi fare clic su Avanti. Dalla sezione Selezione imbarcazione, selezionare il tipo di imbarcazione appropriato da scansionare e fare clic su Avanti. Specificare la posizione nel cassetto per il recipiente e fare clic su Avanti.

Nella sezione Scan Pattern (Modello di scansione), selezionare i pozzetti che devono essere scansionati e il numero di immagini per pozzetto. Fare clic su Avanti. Nella sezione Quaderno dell'imbarcazione, fornisci informazioni sull'imbarcazione.

Immettere il nome della targa e fare clic su Avanti. Nella sezione Impostazione analisi, selezionare Rinvia analisi a un momento successivo e fare clic su Avanti. Nella sezione Pianificazione scansione, selezionare Crea nuova pianificazione con scansioni a intervalli di e selezionare un'ora nella sezione Aggiungi scansioni alla pianificazione.

Selezionare Interrompi scansione dopo cinque ore dalla prima scansione. Fare clic su Avanti e quindi su Aggiungi per pianificare quando le informazioni di scansione sono corrette. Dopo aver acquisito le immagini a contrasto di fase e immunofluorescenza dei neutrofili, avviare il software di analisi al microscopio su cellule vive.

Dalla vista, selezionare l'esperimento di microscopia su cellule vive da analizzare. Selezionare Crea nuova definizione di analisi e fare clic su Avanti. Quindi, selezionare l'analizzatore di base dalla sezione Tipo di analisi e fare clic su Avanti.

Nella sezione Canale immagine, selezionare il verde, deselezionare la fase e fare clic su Avanti. Aprire la finestra dei livelli dell'immagine, selezionare il verde e deselezionare la fase. Disattivare la scalabilità automatica nella sezione verde e impostare manualmente min e max.

Quindi aprire la finestra dei tempi di scansione del recipiente e selezionare le immagini che rappresentano i pozzetti di controllo positivi con NET. Aprire la finestra delle impostazioni della definizione dell'analisi e scrivere NET per il nome dell'oggetto. Per la segmentazione, selezionare Adattivo.

Per la GCU di soglia, selezionare un valore compreso tra tre e cinque e impostare Edge Split On tra meno 10 e zero. Quindi, per la pulizia, selezionare Riempimento foro a 100 micrometri quadrati e regolare le dimensioni a meno un pixel. Da Filtri, selezionare un'area maggiore di 200 micrometri quadrati, un'intensità media inferiore a 24,6 e un'intensità integrata maggiore di 7.000.

Quindi fare clic su anteprima corrente o anteprima tutto per applicare le impostazioni. Passare il puntatore del mouse sulle diverse strutture NET e regolare le impostazioni di analisi per ottimizzare le NET false positive e falsenegative. Quando le impostazioni per l'analisi NET sono corrette, fare clic su Avanti.

Selezionare i punti temporali e i pozzetti da analizzare nella sezione Tempi di scansione e pozzetti e fare clic su Avanti. Inserire il nome della definizione nella sezione Salva e applica definizione analisi e fare clic su Avanti. Fare clic su Fine quando le informazioni dell'analisi sono verificate e corrette.

Aprire l'analisi dell'esperimento facendo clic sull'analisi all'interno dell'imbarcazione di interesse. Quindi, apri la finestra delle metriche del grafico. Quindi, fai clic sul pulsante più per creare una metrica.

Quando si presentano i dati come percentuale di confluenza netta, selezionare Area nella sezione Metrica e selezionare Confluenza nella sezione Valore. Quando si presentano i dati come percentuale di neutrofili NETting, selezionare Conteggio oggetti nella sezione Metrica e selezionare Per immagine nella sezione Valore. Dopo aver configurato le impostazioni delle metriche, nella sezione Metriche definita dall'utente, selezionare NETs Area Confluence (NETs Area Confluence) o NETs Object Count (Numero di oggetti NETs per immagine).

Selezionare tutti i punti temporali e i pozzetti necessari per l'analisi rispettivamente dalle sezioni Seleziona scansioni e Seleziona pozzetto. Infine, fai clic su Esporta dati. La stimolazione con ionoforo di calcio ha indotto una NETosi più rapida rispetto alla PMA, il che ha portato a una percentuale più elevata di neutrofili che rilasciano NET.

I NET indotti dagli ionofori di calcio erano più diffusi oltre la membrana plasmatica dei neutrofili, mentre i NET indotti da PMA rimanevano più vicini alla membrana plasmatica dei neutrofili. Una tendenza verso livelli elevati di NET è stata osservata quando i neutrofili sono stati attivati con complessi immunitari rivestiti, FMLP e cristalli di urato monosodico. NET in risposta a un 23187 è stato completamente inibito da CIT-013 a una concentrazione inibitoria semimassima di 4,6 nanomolari.