Name: Un protocollo per lespiantazione di gliomi diffusi di basso grado con mutante IDH1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-09T12:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Scopri un metodo di espianto non enzimatico per coltivare a lungo termine i gliomi diffusi di basso grado con mutazione IDH1. Questo protocollo preserva l'espressione proteica e supporta la ricerca sul plasticismo cellulare.

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I frammenti tumorali utilizzati qui fanno parte della collezione NEUROLOGY di campioni di tessuto fresco gestita dal Biological Resource Center dell'Ospedale Universitario di Montpellier (CRB@chu-montpellier.fr). Questa ricerca è stata condotta nell'ambito del progetto intitolato "Gliomacult: Characterization and Primary Cultures of Low-Grade Gliomas", guidato dal Prof. J. P. Hugnot (Progetto n. RECH/P722/1-5). Questo lavoro è stato sostenuto da La ligue contre le cancer, ARC (Associazione per la ricerca sul cancro), ARTC, ARTC SUD, Les Etoiles dans la mer, EMBALL'ISO, Région Occitanie, INCA. K.A.C è supportato dal Consiglio Nazionale delle Scienze e delle Tecnologie Umanistiche (CONAHCYT), Messico, e dall'Associazione per la Ricerca sui Tumori Cerebrali (ARTC), Francia.

I frammenti tumorali utilizzati in questo protocollo sono stati ottenuti da una collezione ben caratterizzata e approvata dal punto di vista etico, con il consenso dei pazienti. Questa ricerca è stata condotta nell'ambito del progetto intitolato Gliomacult: Characterization and Primary Cultures of Low-Grade Gliomas (Numero del progetto: RECH/P722/1-5) ed è stata approvata dal consiglio scientifico della biobanca dei tumori il 28 agosto 2023.
1. Preparazione delle piastre di coltura
NOTA: eseguire questi passaggi sotto una cappa a flusso laminare sterile per colture cellulari.
<ol>
	<li>Almeno 1 ora prima della coltura, preparare le piastre da 24 pozzetti rivestite con poli-D-lisina (PDL) e laminina.
	<ol>
		<li>Diluire 10 mg di polvere di PDL in 100 mL di tampone borato (pH 8,4) per ottenere una concentrazione finale di 100 µg/mL. Dopo la completa dissoluzione, filtrare la soluzione (0,22 µm) per garantirne la sterilità. Il PDL è pronto all'uso; preparare aliquote da 3 mL e conservarle a -20 °C.</li>
		<li>Scongelare il tubo di laminina (1-2 mg/mL) a 4 °C per evitare la formazione di gel. Preparare aliquote da 50 µL e conservarle a -20 °C. 
		NOTA: Evitare cicli ripetuti di scongelamento e congelamento.</li>
		<li>Rivestimento delle pozzetti
		<ol>
			<li>Passaggio opzionale: posizionare in ogni pozzetto della piastra da 24 un’ansa sterile da Ø 13 mm, adatta per piastre da coltura cellulare, un’ansa per pozzetto. 
			NOTA: Questo passaggio è necessario per successivi esami di immunofluorescenza degli espianti di glioma.</li>
			<li>Per il rivestimento dei pozzetti, mescolare 3 mL di soluzione di PDL con 9 mL di PBS 1x e aggiungere 50 µL di laminina. Aggiungere 500 µL di questa soluzione in ogni pozzetto, ottenendo una concentrazione di rivestimento di 1-2 µg/cm². Incubare le piastre rivestite a temperatura ambiente, preferibilmente con agitazione lenta (15 RPM), per almeno 1 ora.</li>
			<li>Immediatamente prima della coltura, rimuovere la soluzione di PDL-laminina e risciacquare due volte con PBS 1x sterile. 
			NOTA: Evitare che i pozzetti si asciughino.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Mezzi
<ol>
	<li>Coltivare gli espianti con mutazione IDH1 in un mezzo definito costituito da DMEM/F12 integrato con L-glutammina, insieme a una miscela sostitutiva del siero composta da N2 e B27 senza vitamina A. Utilizzare antibiotici, tra cui ciprofloxacina, gentamicina e fungina, per prevenire contaminazioni batteriche e fungine. Inoltre, aggiungere al mezzo fattori di crescita come eparina, EGF e FGF2, filtrarlo (0,2 µm) e conservarlo fino a 2 settimane a 4 °C. 
	NOTA: Per informazioni dettagliate sugli ingredienti e sulla preparazione del mezzo, consultare Tabella 1 e la Tabella dei Materiali.</li>
</ol>
3. Preparazione dell'espianto
<ol>
	<li>Prima dell'elaborazione del campione, preparare l'area di lavoro e gli strumenti sterili come illustrato in Figura 1A. Sanitizzare una confezione refrigerante spruzzandola con etanolo al 70%. Sterilizzare forbici e pinzette immergendole in etanolo al 70% e risciacquandole con PBS.</li>
	<li>Trasferire immediatamente il campione tumorale per la coltura sul ghiaccio, idealmente entro 2 h dal prelievo chirurgico (Figura 1B). 
	NOTA: Il campione tumorale dovrebbe avere un diametro minimo di 9-10 mm per garantire risultati migliori. Il tessuto viene trasportato senza mezzo di coltura poiché questo metodo è preferito per scopi istologici. L'assenza di liquido previene la formazione di cristalli di ghiaccio durante il congelamento rapido, preservando così l'integrità del tessuto per eventuali esami istologici successivi.</li>
	<li>Posizionare la piastra con il campione tumorale sulla confezione refrigerante e risciacquarlo delicatamente con PBS 1X per rimuovere l'eccesso di sangue.</li>
	<li>Il tumore resecato spesso presenta dimensioni significative e eterogeneità, comprendendo massa tumorale, tessuto infiltrato e componenti non tumorali (Figura 1C). Selezionare porzioni di colore grigio con consistenza morbida o gelatinosa per l'isolamento delle cellule tumorali, poiché tendono a contenere un numero maggiore di cellule tumorali. Al contrario, evitare le aree dure e bianche poiché potrebbero contenere meno cellule tumorali adatte alla coltura (Figura 1D), così come le aree annerite, che probabilmente derivano dall'elettrocoagulazione e potrebbero non fornire risultati affidabili per l'analisi.</li>
	<li>Trasferire i campioni selezionati in una microprovetta da 1,5 mL o in una cryovial per la trinciatura. Aggiungere 1 mL di mezzo sterile nella microprovetta da 1,5 mL o nella cryovial e trinciare il campione con le forbici sterili fino a ottenere piccoli pezzi (1-2 mm3). 
	NOTA: Sono necessari circa 1-2 minuti di trinciatura per ottenere frammenti minuscoli, tipicamente di dimensioni pari a 1-2 mm3 (Figura 1E).</li>
	<li>Con forbici sterili, tagliare con cura l'estremità di una punta da pipetta blu da 1.000 µL per creare un'apertura larga, di circa 3-4 mm di diametro. Utilizzando questa punta modificata, pipettare 50-200 µL dei frammenti di tessuto trinciato e distribuirli uniformemente in ciascun pozzetto. Poiché i frammenti più piccoli tendono a sedimentare rapidamente, riomogeneizzare delicatamente la sospensione in ogni pozzetto per garantire una distribuzione uniforme. 
	​NOTA: Evitare l'eccessivo affollamento e mantenere un equilibrio non introducendo un numero eccessivo di frammenti in ciascun pozzetto (Figura 1F).</li>
	<li>Incubare i frammenti tumorali a 37°C in un incubatore con 5% di CO2 e umidità al 100%. Cambiare il mezzo ogni giorno se l'attività metabolica del tumore (indicata dall'ingiallimento rapido del mezzo) e il numero di frammenti in ciascun pozzetto lo richiedono. Durante il cambio del mezzo, procedere con attenzione aspirando delicatamente il mezzo con una pipetta dotata di punta da 200 µL, avendo cura di non disturbare i frammenti tumorali aderenti.</li>
</ol>
<img alt="Processo di preparazione del tessuto tumorale; configurazione dell'attrezzatura; campioni di tessuto; risultati della centrifuga; grafico di analisi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67260/67260fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Procedura di coltura di espianti tumorali. È stata ottenuta una resezione di glioma di basso grado diffuso da un paziente di 44 anni diagnosticato con astrocitoma di grado II secondo la classificazione WHO 2021. Il tumore presentava una mutazione nel gene IDH1 (esone 4 c.395 G&gt;A, p.Arg132His) e una mutazione nel gene TP53 (esone 8 c.843_844delinsGT, p.Asp281_Arg282delinsGluHis), insieme all'assenza di colorazione per ATRX. Non sono state rilevate mutazioni nei siti di legame Ets/TCF (C250T e C228T) del gene TERT. (A) La superficie di lavoro comprende un pacchetto refrigerante, che fornisce un ambiente atto a minimizzare il degrado del campione e a mantenere la vitalità dei componenti biologici. Queste precauzioni sono importanti per preservare la qualità e l'integrità del tessuto. (B) Il trasporto del campione dall'ospedale al laboratorio deve essere effettuato su ghiaccio. (C) Frammento di resezione tumorale. Le frecce indicano le parti più adatte alla coltura. (D) La dissezione del tumore viene eseguita per selezionare la parte più rilevante da tritare. Secondo la nostra esperienza, la sostanza bianca generalmente ha minori probabilità di generare espianti di successo. (E) Frammenti tumorali di circa 1-2 mm³ di diametro in un tubo da 15 mL dopo essere stati tritati meccanicamente con forbici. (F) Viene mostrato il numero di frammenti tumorali necessari per una corretta semina nelle pozzette di una piastra a 24 pozzette. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67260/67260fig01large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
4. Criopreservazione e scongelamento del tessuto tumorale tritato
NOTA: La criopreservazione garantisce una copia di sicurezza in caso di contaminazione e perdita di colture di espianti o per elaborare in un secondo momento i campioni tumorali.
<ol>
	<li>Criopreservazione: Preparare il mezzo di congelamento (soluzione al 20% v/v di DMSO) aggiungendo 2 mL di DMSO a 8 mL di mezzo di coltura cellulare.</li>
	<li>Combinare un volume della sospensione tumorale tritata con un volume uguale del mezzo di congelamento al 20% di DMSO per ottenere una concentrazione finale del 10% di DMSO. Pipettare delicatamente la miscela su e giù per assicurare un'accurata miscelazione, quindi distribuire circa 1 mL nei cryovials.</li>
	<li>Trasferire rapidamente i cryovials in un contenitore criogenico per una riduzione graduale della temperatura, seguita da un'incubazione notturna a -80 °C prima dello stoccaggio finale in azoto liquido. 
	NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito immediatamente dopo che le cellule sono state poste nel mezzo di congelamento, poiché alcuni crioprotettori, come il DMSO, possono risultare dannosi se le cellule sono esposte a temperatura ambiente per un periodo superiore al necessario.</li>
	<li>Scongelamento: Rimuovere i cryovials dall'azoto liquido e posizionarli immediatamente in un bagno a 37 °C fino a quando circa l'80% delle cellule si sarà scongelato.</li>
	<li>Per rimuovere il DMSO, pipettare rapidamente la sospensione in un tubo da centrifuga da 15 mL contenente 5 mL di PBS 1x preriscaldato e centrifugare a 300 × g per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere il soprannatante e ripetere il lavaggio con PBS 1X seguito da centrifugazione (passaggio 4.5). Aspirare il soprannatante, avendo cura di non disturbare il pellet, e aggiungere la quantità appropriata di mezzo per trasferire le cellule in una piastra da 24 pozzetti precoata con PDL-Laminina, quindi posizionarla nell'incubatore.</li>
	<li>Dopo 24 h, verificare che le cellule si siano attaccate. Dopo alcuni giorni, rimuovere i frammenti non aderenti sostituendo il mezzo di coltura.</li>
</ol>
5. Passaggio della coltura
NOTA: una volta ottenuti, gli espianti possono essere utilizzati per videomicroscopia o immunomarcatura. In alternativa, se le cellule tumorali hanno migrato fuori dall'espianto e appaiono sane, l'espianto può essere sottoposto a passaggio mediante dissociazione enzimatica e reinserito in pozzetti per ulteriori esperimenti. Tuttavia, è importante notare che questo protocollo non è progettato per passaggi ripetuti. Generalmente, può essere effettuato un solo passaggio prima che le cellule tumorali diventino senescenti o muoiano. Non tutte le colture di espianti porteranno a un passaggio riuscito.
<ol>
	<li>Per il passaggio, rimuovere il vecchio mezzo, lavare con PBS 1X e aggiungere (125 µL) di tripsina-EDTA 0,05% alle pozzette, quindi incubare per 3-4 min a 37 °C, seguito dall'aggiunta di 6,5 µL di inibitore della tripsina, 12 µL di CaCl2 20 mM (diluizione finale a 2 mM) e 1 µL di DNAasi I. 
	NOTA: Il tempo di incubazione necessario per la dissociazione può variare a seconda della coltura. È importante verificare se le cellule si sono staccate dopo almeno 3 minuti. In genere, l'espianto potrebbe non essere completamente dissociato in una sospensione monocellulare e spesso vengono mantenuti piccoli aggregati, che possono generare nuove colture di espianti.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta p1000 impostata su 500-600 µL, lavare delicatamente per disgregare gli espianti. Evitare la formazione di bolle.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di PBS 1X e centrifugare per 5 min a 300 × g. Aspirare il sopranatante, risospendere il pellet nel mezzo fresco preriscaldato e contare le cellule per la semina.</li>
	<li>Identificare le colture con potenziale di generare linee cellulari osservando le cellule in divisione al microscopio a contrasto di fase. Queste cellule in divisione presentano tipicamente una morfologia arrotondata e cromosomi visibili, come mostrato in Figura 2A.</li>
</ol>

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<li>Thomas, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2021+updates+to+the+World+Health+Organization+classification+of+adult-type+and+pediatric-type+diffuse+gliomas%3A+A+clinical+practice+review%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">2021 updates to the World Health Organization classification of adult-type and pediatric-type diffuse gliomas: A clinical practice review.</a> Chin Clin Oncol. 12 (1), 7(2023).</li>
<li>Azar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+characterization+of+IDH1-mutated+diffuse+low+grade+gliomas+reveals+tumor+heterogeneity+and+absence+of+EGFR%2FPDGFRalpha+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular characterization of IDH1-mutated diffuse low grade gliomas reveals tumor heterogeneity and absence of EGFR/PDGFRalpha activation.</a> Glia. 66 (2), 239-255 (2018).</li>
<li>Bhaduri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+radial+glia-like+cancer+stem+cells+contribute+to+heterogeneity+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Outer radial glia-like cancer stem cells contribute to heterogeneity of glioblastoma.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 48-63.e6 (2020).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Lo sviluppo di modelli in vitro e preclinici per i gliomi di basso grado con mutazione IDH1 è particolarmente complesso a causa della crescita lenta di questi tumori e della difficoltà di riprodurre le estese alterazioni genomiche ed epigenomiche indotte dalla mutazione IDH. Inoltre, queste cellule tumorali infiltrative interagiscono attivamente con le cellule circostanti, inclusi i linfociti, le cellule endoteliali, le cellule gliali e i neuroni, dai quali potrebbero dipendere per la sopravvivenza. Questo complesso intr...

I gliomi diffusi sono i tumori cerebrali primari più frequenti. Questi tumori sono attualmente incurabili nonostante un trattamento molto intenso (chirurgia, radio e chemioterapia)1. Prove crescenti supportano l'ipotesi che la gliomagenesi abbia origine da cellule staminali adulte o progenitrici gliali residenti nel cervello2. Sebbene i glioblastomi rappresentino il tipo più aggressivo, sono prevalenti anche i gliomi diffusi di basso grado (DLGG, tumori di grado 2) (15% dei gliomi diffusi)1,3. I DLGG crescono lentamente e migrano lungo i tratti della sostanza bianca, un segno distintivo di questa neoplasia "diffusa4. Questi DLGG molto spesso si ripresentano nonostante il trattamento, progredendo infine verso tumori maligni di alto grado (gradi 3 e 4)5.
DLGG sono caratterizzati da una mutazione missenso nel gene dell'isocitrato deidrogenasi 1 o 2 (IDH1 o IDH2), con conseguente produzione aberrante dell'oncometabolita 2-idrossiglutarato (2HG). Questo interrompe la differenziazione cellulare attraverso disregolazioni epigenetiche6. I gliomi con mutazione IDH1 sono ulteriormente classificati in sottotipi: gli astrocitomi hanno tipicamente mutazioni in ATRX e P53, mentre gli oligodendrogliomi sono caratterizzati da delezioni 1p19q7. Questi tumori mostrano un'eterogeneità delle cellule tumorali. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e l'immunocaratterizzazione hanno rivelato una popolazione diversificata di cellule tumorali, che mostrano fenotipi simili alle cellule staminali, agli astrociti e agli oligodendrociti all'interno di questi tumori8,9.
A differenza del glioblastoma, che beneficia di colture e linee cellulari prontamente disponibili e a lungo termine, esiste una notevole scarsità di strumenti cellulari su misura per studiare i tumori mutanti IDH11. Ciò rappresenta un ostacolo significativo all'avanzamento dello sviluppo terapeutico e all'approfondimento della gliomagenesi e della progressione della malattia con mutazione IDH1. Le linee cellulari tradizionali cresciute con il siero, sebbene utilizzate da tempo, replicano in modo inadeguato i tumori originali, mostrando profili trascrizionali alterati. In alternativa, le condizioni di coltura senza siero, sia in modelli tumorali 2D che 3D, preservano più efficacemente i profili trascrizionali delle cellule tumorali e i loro fenotipi in vivo, come l'invasione nel tessuto cerebrale normale10,11.
Inoltre, le colture cellulari a breve termine derivate dal campione chirurgico di un paziente preservano il profilo molecolare e la diversità cellulare del tumore, rappresentando così meglio i tratti biologici dei tumori rispetto alle linee cellulari12. In questo articolo, introduciamo un semplice metodo non enzimatico per la coltura di gliomi diffusi di basso grado con mutante IDH1 come espianti derivati da resezioni di pazienti freschi o congelati, con l'obiettivo di soddisfare la necessità di migliorare i modelli in vitro per la ricerca e lo sviluppo terapeutico del glioma. Offrono anche il potenziale per derivare linee cellulari mutanti IDH1.

<table><tbody><tr><td>Anti-ASCL1</td><td>BD Pharmingen&commercio;</td><td></td><td>Diluizione 556604 1:500</td></tr><tr><td>Diluizione HPA001906 Anti-ATRX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>1:100</td></tr><tr><td>Diluizione Anti-CD68</td><td>Agilent</td><td>M081401-2</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Diluizione 1:500 Anti-GFAP</td><td>Aves Labs</td><td>AB_2313547</td><td>Diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Anticorpi Fujifilm Wako</td><td>Anticorpi 019-19741</td><td>Dilizione 1:1000</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale di topo Anti-IDH1 (R132H)</td><td>Dianova</td><td>DIA-H09</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ki67</td><td>BD Pharmingen&commercio;</td><td>556003</td><td>Dilituion 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-OLIG1</td><td>R& D Sistemi&reg;</td><td>AF2417</td><td>Dulituion 1:300</td></tr><tr><td>Anti-OLIG2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MABN50</td><td>Diluizione 1:250</td></tr><tr><td>Anti-SOX9</td><td>Abcam&reg;</td><td>Diluizione EPR14335-78</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Integratore di B-27 (50x), meno vitamina A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>CiteAb</td><td>A-421-100</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacina HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1044-1G</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell</td><td>Corning&reg;</td><td>432000</td><td>Contenitore per congelamento cellulare, per fiale criogeniche da 12 x 1 mL o 2 mL</td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetto &Oslash;, 13 mm</td><td>Karl Hecht&trade; Assistente&commercio;</td><td></td><td></td>328017</tr><tr><td>Dimetil Solfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, senza glutammina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>DNAsi I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm Piatto per colture cellulari trattato</td><td>con TC Corning&reg;</td><td></td><td></td>353003</tr><tr><td>Falcon 24 pozzetti a fondo piatto trasparente</td><td>Corning&reg;</td><td>353047</td><td>Piastra per colture cellulari multipozzetto trattata con TC, con coperchio, sterile</td></tr><tr><td>Fungin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-fn-1</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15750-037</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-100KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3375</td><td></td></tr><tr><td>EGF umano</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15-1MG</td><td></td></tr><tr><td>FGF umano-basic</td><td>PeproTech</td><td>100-18B-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Integratore (100x )</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7886</td><td></td></tr><tr><td>Siero acrodisc 37 mm filtro per siringa con GF/0.2 &; m Supor</td><td>PALL Corporation</td><td>4525</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Zeiss Z1 Apotome 3 Microscopio</td><td>per epifluorescenza a campo largo dritto</td> <td>Zeiss</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocollo per l'espiantazione di gliomi diffusi di basso grado con mutante idh1

A Protocol for Explant Cultures of IDH1-mutant Diffuse Low-grade Gliomas

I gliomi diffusi, i tumori cerebrali primari più diffusi, sono classificati in gradi bassi e alti in base a criteri istopatologici e mutazioni genetiche. I gliomi diffusi di basso grado costituiscono un sottogruppo, che affligge prevalentemente i giovani adulti e predispone ai gliomi di alto grado. Esistono due tipi principali di gliomi diffusi di basso grado: astrocitomi e oligodendrogliomi, ciascuno definito da caratteristiche genetiche e istologiche distinte. Questi tumori presentano tipicamente una variante mutata dell'enzima metabolico IDH1, che interrompe la differenziazione cellulare. Sono eterogenee e comprendono sia cellule staminali proliferative che cellule gliali più differenziate e quiescenti. 
I modelli tumorali in vitro specifici per il paziente hanno un potenziale significativo per svelare i meccanismi oncogenici e personalizzare la selezione dei farmaci per la terapia personalizzata. Tuttavia, l'assenza di modelli in vitro affidabili specifici per i gliomi di basso grado con mutazione IDH1 ha ostacolato la ricerca fondamentale e traslazionale. Qui, presentiamo un metodo semplice per coltivare tumori mutanti IDH1 come espianti in terreni definiti senza bisogno di dissociazione enzimatica. Questi espianti possono essere mantenuti per periodi prolungati, mantenendo l'espressione della proteina IDH1-mutante e marcatori per le cellule progenitrici degli oligodendrociti come ASCL1 (MASH1), OLIG1 e OLIG2 e per gli astrociti (GFAP, SOX9). Possono anche essere stabiliti da tumori congelati nel DMSO. Queste colture possono fungere da preziosa piattaforma per lo screening dei farmaci, la videomicroscopia e gli studi genetici, facilitando così i progressi nella comprensione e nel trattamento di questi tumori difficili. Offrono anche il potenziale per derivare linee cellulari mutanti IDH1.

Dopo alcuni giorni, alcuni frammenti tumorali aderiranno alle superfici delle pozzette, avviando la migrazione cellulare dagli espianti. Il tempo trascorso tra il primo allestimento della coltura e la comparsa di cellule tumorali in crescita varia da campione a campione. Le colture iniziali contengono spesso una notevole quantità di detriti cellulari, rendendo difficile valutare la presenza di cellule vitali. Di conseguenza, la coltura deve essere mantenuta per un minimo di 4 settimane. Una volta che le cellule iniziano ...

I gliomi diffusi di basso grado con mutazione IDH1 sono tumori rari e difficili da coltivare. Introduciamo un metodo di espianto semplice e non enzimatico che preserva l'espressione della proteina IDH1-mutante e sostiene le colture per mesi. È importante sottolineare che questa tecnica funziona con i tumori crioconservati, offrendo una risorsa preziosa per la ricerca sul glioma.

Un protocollo per l'espiantazione di gliomi diffusi di basso grado con mutante IDH1

Diffuse gliomas, the most prevalent primary brain tumors, are categorized into low and high grades based on histopathological criteria and genetic ...

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Questo video dimostra il processo di isolamento e coltura delle cellule progenitrici gliali dal glioma pontino intrinseco diffuso o dal tessuto del tronco encefalico affetto da DIPG. Le cellule gliali isolate dal tessuto tumorale tramite una digestione enzimatica vengono coltivate in un mezzo neurobasale, che ne promuove la crescita e lo sviluppo di neurosfere fluttuanti.

Isolamento e coltura di cellule da glioma pontino intrinseco diffuso

I gliomi maligni costituiscono un gruppo eterogeneo di neoplasie gliali altamente infiltrative con caratteristiche cliniche e molecolari distinte. Gli xenoinnesti ortotopici primari ricapitolano le caratteristiche istopatologiche e molecolari dei sottotipi di glioma maligni nei modelli animali preclinici.

Gli xenoinnesti glioma ortotopici primari ricapitolano la crescita infiltrativa e la mutazione isocitrato deidrogenasi I

Protocollo per la propagazione di campioni chirurgici di glioma dissociati di alta qualità nel mezzo della neurosfera privo di siero da selezionare per le cellule con fenotipo delle cellule staminali tumorali. Per gli esemplari che non riescono a crescere come neurosfere, viene suggerito un protocollo alternativo. Viene descritta una tecnica di incorporamento della paraffina per mantenere l'architettura della neurosfera 3D per l'immunocitochimica.

Ottimizzazione della coltura cellulare glioma di alto grado da campioni chirurgici per l'uso in modelli animali clinicamente rilevanti e immunochimica 3D

Presentato ecco un metodo semplice per l'isolamento e il flusso citometria di cellule mononucleate del sangue periferico gliomi infiltranti che produce dati quantitativi dipendenti dal tempo sul numero e l'attivazione dello stato di cellule immunitarie che entrano presto microambiente tumorale al cervello.

Isolamento e analisi citofluorimetrica di-Glioma infiltrazione sangue periferico mononucleari Cellule

Questo protocollo descrive un metodo per la rapida trasformazione del post mortem diffuse campioni di glioma pontino intrinseca per la definizione di modelli di coltura cellulare derivati ​​da pazienti o la caratterizzazione diretta delle cellule tumorali e microambiente.

Un protocollo per Rapid post-mortem delle cellule Cultura della diffusa intrinseca Pontine glioma (DIPG)

Questo studio introduce e descrive protocolli per derivare due organoidi neurali umani specifici come un modello rilevante e accurato per lo studio 1) lo sviluppo del glioblastoma umano all'interno di organoidi neurali umani esclusivamente negli esseri umani e 2) neuronergico differenziazione generando un organoide tridimensionale.

Organidi neurali umani per lo studio del cancro al cervello e delle malattie neurodegenerative

Qui presentiamo un sistema di coltura motrice mista ex-vivo per lo studio della migrazione delle cellule glioma umane (hGC) in tempo reale. Questo modello fornisce la capacità di osservare le interazioni tra hGC e assoni mielinati e non mielinati all'interno di una camera compartimentata.

Monitoraggio in tempo reale della migrazione delle cellule del Glioma umano sulle coculture di Asse-Olgon-Oligodendroce

Questo studio presenta un protocollo di immunocitochimica delle cellule 3D vive applicato ad una linea cellulare di glioma diffuso pediatrico della linea mediana, utile per studiare in tempo reale l'espressione delle proteine sulla membrana plasmatica durante processi dinamici come l'invasione e la migrazione delle cellule 3D.

Saggi di immunocitochimica delle cellule 3D del glioma diffuso della linea mediana pediatrica

La disregolazione proteomica svolge un ruolo importante nella diffusione dei gliomi diffusamente infiltranti, ma diverse proteine rilevanti rimangono non identificate. L'elaborazione spaziale digitale (DSP) offre un approccio efficiente e ad alto rendimento per caratterizzare l'espressione differenziale di proteine candidate che possono contribuire all'invasione e alla migrazione dei gliomi infiltrativi.

Profilazione spaziale digitale per la caratterizzazione del microambiente in gliomi diffusamente infiltranti di tipo adulto

Qui, descriviamo un metodo per generare organoidi di glioblastoma (GBM) da campioni di pazienti primari o colture cellulari derivate dal paziente e mantenerli fino alla maturità. Questi organoidi GBM contengono popolazioni cellulari fenotipicamente diverse e ricreano microambienti tumorali ex vivo.

Mantenimento della diversità cellulare del glioblastoma umano ex vivo utilizzando la coltura di organoidi tridimensionali

Scopri un metodo di espianto non enzimatico per coltivare a lungo termine i gliomi diffusi di basso grado con mutazione IDH1. Questo protocollo preserva l'espressione proteica e supporta la ricerca sul plasticismo cellulare.

Un protocollo per l'espiantazione di gliomi diffusi di basso grado con mutante IDH1

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