Un protocollo per l'espiantazione di gliomi diffusi di basso grado con mutante IDH1
9 maggio 2025
I gliomi diffusi di basso grado con mutazione IDH1 sono tumori rari e difficili da coltivare. Introduciamo un metodo di espianto semplice e non enzimatico che preserva l'espressione della proteina IDH1-mutante e sostiene le colture per mesi. È importante sottolineare che questa tecnica funziona con i tumori crioconservati, offrendo una risorsa preziosa per la ricerca sul glioma.
Nel nostro laboratorio, ci concentriamo sul raro tipo di tumori cerebrali che è chiamato gliomi diffusi di basso grado. Questi gliomi colpiscono spesso giovani adulti e sono caratterizzati da una mutazione nel gene chiamato IDH-1. I principali progressi nel campo dei gliomi sono, in primo luogo, l'uso di modelli 3D, come tumoridi o organoidi, in secondo luogo, l'uso dell'imaging direttamente nel cervello di topi trapiantati con gliomi e, in terzo luogo, l'uso di speciali RNA trascrittomici e a singola cellula.
La sfida principale che affrontiamo quando lavoriamo sui gliomi mutanti IDH-1 è la bassa proliferazione di queste cellule e la loro difficoltà di essere mantenute in coltura, e quindi abbiamo derivato e definito un protocollo per mantenere in vita le cellule, e per alcune di esse, siamo stati in grado di derivare una linea cellulare, ma non per tutti i pazienti. Studiando le cellule mutanti IDH-1 in vitro, ma anche in vivo, abbiamo scoperto che queste cellule sono piuttosto plastiche e possono adottare il destino di due cellule, sia simili agli astrociti che ovali, e abbiamo anche scoperto che il nudge sta giocando un ruolo importante in questa plasticità. Con questo nuovo protocollo di espianto, siamo stati in grado di mantenere le cellule mutanti IDH-1 in vitro per settimane, ma anche di più, per mesi, e abbiamo dimostrato che esistono diversi tipi di cellule tumorali, come abbiamo riscontrato nei pazienti.
Abbiamo anche scoperto che ci sono alcune cellule dell'ambiente tumorale, come le cellule microgliali, che rendono possibile studiare l'interazione tra le cellule tumorali e il loro ambiente, quindi questi modelli offrono una rappresentazione più accurata della diversità biologica trovata nei tumori. Per iniziare, prepara l'area di lavoro e disponi tutti gli strumenti sterilizzati. Trasferire la resezione del tumore su ghiaccio per preservare la vitalità dei tessuti per la coltura.
Esaminare la resezione del tumore per verificarne le dimensioni e l'eterogeneità. Seleziona le parti che mostrano un colore grigio con una consistenza morbida o gelatinosa, poiché queste aree sono ricche di cellule tumorali. Trasferire i campioni tumorali selezionati in una microprovetta da 1,5 millilitri o crioviale e aggiungere un millilitro di terreno.
Utilizzando le forbici sterili, tagliare i campioni in piccoli pezzi di uno o due millimetri cubi. Quindi, con le forbici sterili, tagliare l'estremità di un puntale per pipetta da 1.000 microlitri per creare un'ampia apertura di circa tre o quattro millimetri di diametro. Pipettare da 100 a 200 microlitri di frammenti di tessuto tritati con una punta tagliata nei pozzetti di una piastra.
Riomogeneizzare delicatamente la sospensione per garantire una distribuzione uniforme, poiché i frammenti più piccoli tendono a depositarsi rapidamente. Posizionare la piastra in un'incubatrice impostata a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e il 100% di umidità. Sostituire quotidianamente il terreno se l'attività metabolica del tumore provoca un rapido ingiallimento o se la densità dei frammenti lo richiede.
Per iniziare, ottenere la sospensione di tessuto tumorale tritato. Per la preparazione del terreno di congelamento, aggiungere due millilitri di DMSO a otto millilitri di terreno di coltura cellulare. Combinare un volume della sospensione tumorale tritata con un volume uguale del mezzo di congelamento preparato al 20% di DMSO.
Pipettare con cura la miscela su e giù per garantire una miscelazione completa. Trasferire rapidamente i crioviali in un contenitore criogenico per facilitare la riduzione graduale della temperatura, quindi incubare durante la notte a meno 80 gradi Celsius prima di trasferirli in azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Per lo scongelamento, rimuovere i crioviali dall'azoto liquido e metterli immediatamente in un bagnomaria a 37 gradi Celsius.
Scaldali fino a quando circa l'80% delle cellule non si è scongelato. Per rimuovere il DMSO, trasferire rapidamente la sospensione in una provetta da centrifuga da 15 millilitri contenente cinque millilitri di PBS 1X preriscaldato e centrifugare la provetta a 300 G per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e ripetere il lavaggio PBS, seguito dalla centrifugazione.
Aspirare il surnatante, assicurandosi che il pellet rimanga indisturbato. Risospendere il pellet in una quantità appropriata di terreno e trasferirlo in una piastra PDL Laminin prerivestita a 24 pozzetti. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius.
È stato osservato che le cellule che presentano morfologie allungate, bipolari o multipolari crescono da espianti tumorali attaccati alla superficie del pozzetto dopo una durata minima della coltura di quattro settimane. Le cellule derivate dal tumore hanno mostrato una morfologia comparabile tra tumori freschi e crio-conservati in tre casi, come dimostrato dall'aspetto allungato e bipolare che forma reti intricate. La migrazione radiale della cellula derivata dal tumore lungo la fibra è stata chiaramente osservata.
Le colture di espianto, non riuscite, hanno mostrato frammenti non aderenti e numerose cellule gitter, caratterizzate da autofluorescenza e contenuto lipidico.
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Panoramica
I gliomi diffusi di basso grado con mutazione di IDH1 sono tumori rari e difficili da coltivare. Questo studio presenta un metodo di espianto non enzimatico che mantiene l'espressione della proteina con mutazione di IDH1 e consente colture a lungo termine.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Oncologia
- Biologia cellulare
Sfondo
- I gliomi di basso grado diffusi colpiscono principalmente i giovani adulti.
- Questi tumori sono caratterizzati da mutazioni nel gene IDH1.
- La coltura di cellule di glioma con mutazione IDH1 è difficoltosa a causa dei bassi tassi di proliferazione.
- I metodi esistenti presentano limitazioni nel mantenere a lungo termine queste cellule.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo che consenta la coltura a lungo termine di cellule di glioma con mutazione IDH1.
- Esplorare la plasticità di queste cellule in vitro e in vivo.
- Fornire una risorsa preziosa per la ricerca sui gliomi.
Metodi Utilizzati
- Tecnica di coltura esplantistica non enzimatica.
- Utilizzo di tumori criopreservati.
- Studi in vitro e in vivo per valutare il comportamento cellulare.
- Analisi del destino cellulare e della plasticità.
Risultati principali
- Il metodo di espianto mantiene con successo le cellule con mutazione IDH1 per mesi.
- Sono stati identificati diversi tipi di cellule tumorali, rispecchiando i campioni dei pazienti.
- Le cellule hanno mostrato plasticità, assumendo destini simili ad astrociti e di forma ovale.
- È stato scoperto che Nudge svolge un ruolo significativo in questa plasticità.
Conclusioni
- Il nuovo protocollo di espianto è efficace per la coltura a lungo termine dei gliomi con mutazione IDH1.
- Questo metodo migliora la comprensione della biologia del glioma.
- Fornisce una piattaforma per la futura ricerca sui gliomi e lo sviluppo di terapie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La creazione di colture solide di espianti di gliomi diffusi di basso grado con mutazione IDH1 risponde a un'importante lacuna nei sistemi di modelli pertinenti alla malattia per la ricerca traslazionale e la scoperta precoce. Questo protocollo consente il mantenimento prolungato in vitro dell'eterogeneità tumorale derivata dal paziente, sostenendo una maggiore affidabilità nella validazione degli obiettivi e nella riduzione del rischio meccanicistico per i portafogli di ricerca sui gliomi. L'approccio migliora l'affidabilità degli studi preclinici e facilita decisioni di avanzamento più informate nei percorsi di neuro-oncologia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi dei meccanismi oncogenici nei gliomi con mutazione di IDH1 utilizzando tessuto derivato da pazienti.
- Supporta la validazione funzionale dei bersagli preservando la diversità delle cellule tumorali e le interazioni con il microambiente.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico mantenendo sia le popolazioni di cellule tumorali proliferative sia quelle differenziate.
- Migliora l'affidabilità predittiva nella selezione di percorsi e bersagli nei programmi di neuro-oncologia.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce una piattaforma di coltura espiantata validata per lo screening quantitativo di farmaci e studi di perturbazione genica.
- Garantisce riproducibilità e standardizzazione mantenendo l'espressione della proteina mutante IDH1 e i marcatori di linea cellulare.
- Permette la videomicroscopia e l'analisi di fenotipi in un contesto fisiologicamente rilevante.
- Consente la preparazione scalabile di colture espiantate sia da tumori freschi che da tumori criopreservati.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea alla biologia rilevante per la malattia preservando l'eterogeneità tumorale e i componenti del microambiente.
- Facilita la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica consentendo colture a lungo termine e la derivazione di linee cellulari.
- Supporta decisioni di avanzamento personalizzate in base al rischio fornendo una piattaforma per studi funzionali e farmacologici.
- Potenzia la scoperta di biomarcatori traslazionali grazie all'espressione prolungata di marcatori di linea cellulare e tumorali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di coltura di espianti si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo test precoci delle ipotesi, la validazione di bersagli e lo screening successivo nella ricerca sui gliomi con mutazione di IDH1.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mantenendo la plasticità e l'eterogeneità delle cellule tumorali.
- Screening: Fornisce espianti pronti per saggi per la valutazione riproducibile di composti e l'analisi fenotipica quantitativa.
- Analisi: Consente la misurazione dell'espressione dei marcatori di linea cellulare e della morfologia cellulare per studi comparativi.
- Ricerca Translazionale: Mantiene la rilevanza della malattia e supporta l'allineamento dei biomarcatori per la validazione preclinica.
- Riutilizzo Aziendale: Offre una piattaforma standardizzata e riutilizzabile per diverse applicazioni di ricerca e sviluppo in neuro-oncologia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi nel glioma.
- Valore operativo: Fornisce colture esplantate standardizzate, riproducibili e scalabili per team multifunzionali.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale consentendo una valutazione preclinica robusta.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e lo sviluppo di asset in neuro-oncologia con adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dei tessuti, nelle tecniche sterili e nei modelli sperimentali di neuro-oncologia.
- Necessita dell'accesso a infrastrutture per la coltura cellulare, attrezzature per la crioconservazione e piattaforme di imaging.
- Richiede una standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per garantire riproducibilità e confrontabilità dei dati.
- Adattabile sia a campioni tumorali freschi che crioconservati, consentendo flussi di lavoro flessibili.
- Limitato dalla scarsa proliferazione intrinseca delle cellule del glioma con mutazione di IDH1 e dal successo variabile nella derivazione delle linee cellulari.
