Name: Controllo spazio-temporale dellattività proteica attraverso la regolazione allosterica optogenetica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Scopri il controllo ottogenetico dell'attività proteica con LightR per regolazione allosterica spazio-temporale. Questo metodo consente di studiare la dinamica della segnalazione cellulare con precisione reversibile.

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<meta charset="utf8"></head><body>Controllo optogenetico dell'attività enzimatica mediante interruttore allosterico regolato dalla luce

<table><tbody><tr><td>#1.5 Vetrini coprioggetti in vetro 25 mm rotondi</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>64-0715&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 1,5 mL</td><td>Stati Uniti Scientifici&nbsp;</td><td>cc7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>2x tampone</td><td></td><td></td> Laemmli <td>per 500 mL: 5,18 g di&nbsp; Tris-HCL, 131,5 mL di glicerolo, 52,5 mL di SDS al 20%, 0,5 g di blu di bromofenolo, pH finale 6,8</td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEAN TGX Gel prefabbricato</td><td>Biorad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion Plus Buffer&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>F538L</td><td></td></tr><tr><td>60 LED Microscopio Anello Luminoso</td><td>Boli Ottica</td><td>ML46241324</td><td>LED Blu, diametro 60 mm, 5 W</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>GoldBiotech</td><td>A-201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Erk 1/2 Anticorpo</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>9102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAPDH Anticorpo</td><td>invitrogen</td><td>AM4300</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP</td><td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-mCherry</td><td>invitrogen</td><td>M11217</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MEK</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>9122</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p130Cas</td><td>BD Biosciences</td><td>610271</td><td></td></tr><tr><td>Segnalazione cellulare</td><td>anti-paxillina</td><td>2542</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-Erk 1/2 T202/Y204 Segnalazione</td><td>cellulare</td><td>anticorpale 9101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-pY249 Segnalazione cellulare p130Cas</td><td></td><td>4014</td><td></td></tr><tr><td>Segnalazione cellulare anti-fosfo-Y118 Paxillina</td><td></td><td>2541</td><td></td></tr><tr><td>Cellula MEK</td><td> Segnalazione</td><td>9121</td><td></td></tr><tr><td>Arduino Alimentatore compatibile</td> Computer <td>aziendale</td><td>LJH -186</td><td></td></tr><tr><td>Arduino Uno Rev3</td><td>Arduino</td><td>&lrm; </td><td></td>A000066</tr><tr><td>Attofluor Cell Chamber</td><td>invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Siero fetale bovino (FBS)&nbsp;</td><td>Gemini Bio-prodotti</td><td>100-106</td><td>Triplo Inattivato a Caldo 0.1 &micro; m filtrato sterile&nbsp;</td></tr><tr><td>bRaf-V600E-Venus</td><td></td><td></td><td>Dono del Dr. John O'Bryan, MUSC</td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>GoldBiotech</td><td>A-420&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillina (Disodium)</td> <td>Gold Biotechnology</td><td>C-103-25</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Colorante per membrana plasmatica rosso intenso</td><td>invitrogen</td><td>c10046</td><td></td></tr><tr><td>Colony Screen MasterMix&nbsp;</td><td>Genesee</td><td>42-138</td><td></td></tr><tr><td>DH5a cellule competenti&nbsp;</td><td>NEB&nbsp;</td><td>C2987H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Scala DNA&nbsp;</td><td>GoldBio&nbsp;</td><td>D010-500</td><td></td></tr><tr><td>dNTP&nbsp;</td><td>NEB</td><td>N04475</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1 Enzima&nbsp;</td><td>NEB</td><td>R01765</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>DL-Ditiotreitolo, Reagenti di Cleland&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros&nbsp;</td><td></td><td></td>409910250</tr><tr><td>FastLightR-bRaf-mVenus</td><td>Addgene</td><td>#162155</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina da plasma bovino&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE(R) 6 Reagente di trasfezione&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Reagente di trasfezione</td></tr><tr><td>Gel Colorazione di acido nucleico verde&nbsp;</td><td>GoldBio</td><td>G-740-500</td><td></td></tr><tr><td>Colorante Gel Caricamento Viola 6x&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7024A</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel GeneJET&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>K0692</td><td>Kit di estrazione del gel&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit Miniprep plasmidico GeneJET</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>K0502</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>GlutaMAX-l (100x) 100 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Celle HEK 293T</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Cellule HeLa&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CRM-CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fischer</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Iot Relay</td> Digital <td>Logger</td><td>DLI 705020645490</td><td>Relè di controllo AC/DC per illuminazione</td></tr><tr><td>Kanamycin Monosulfate</td><td>Gold Biotechnology</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>L-15 1x</td><td>Corning&nbsp;</td><td>10-045-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di illuminazione a LED</td><td>HQRP</td><td>884667106091218</td><td>Sistema di lampade a pannello a LED&nbsp;</td></tr><tr><td>LightR-bRaf-mVenus</td><td>Addgene</td><td>#162154</td><td></td></tr><tr><td>LightR-iCre-miRFP670</td><td>Addgene</td><td>#162158</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2024a</td><td>Software per l'esecuzione di script CellGEO</td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Software di analisi dell'imaging</td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Olio Minerale</td><td>Sigma&nbsp;</td>Kit MiniPrep <td>M5310</td><td></td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td>Scelta del gene&nbsp;</td><td>96-308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Gel prefabbricati 12 pozzetti</td><td>Bio-Rad</td><td>4561085</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di Grado di Biologia Molecolare &nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>46-000-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Specchio Policroico Multibanda</td><td>89903BS</td><td>Chroma</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS senza Ca e Mg&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-iCre</td><td>Addgene</td><td>#89573</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry</td><td>Addgene</td><td>#122963</td><td></td></tr><tr><td>pCEFL-ERK2</td><td></td><td></td><td>Regalo dal laboratorio del Dr. Channing Der, provette PCR UNC</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>labForce</td><td>1149Z65</td><td>Provette e tappi a 8 strisce da 0,2 mL, strisce rigide Tappi a cupola fissati singolarmente&nbsp;</td></tr><tr><td>Phusion Plus DNA polimerasi</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>F630S</td><td></td></tr><tr><td>pmiRFP670-N1</td><td>Addgene</td><td>#79987</td><td></td></tr><tr><td>Polygon 400 Illuminatore Modellato</td><td>Mightex</td><td>DSI-G-00C</td><td></td></tr><tr><td>Primer&nbsp;</td><td>Membrane PVDF IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BioRad</td><td>1620219</td><td>Panini in PVDF/carta da filtro Immun-Blot&nbsp;</td></tr><tr><td>T0,25% Tripsina, 2,21 mM, eDTA, 1x [-] Corning di sodio</td><td>&nbsp;</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Acetato-EDTA (TAE) 50x&nbsp;</td><td>Fischer</td><td>BP1332-1&nbsp;</td><td>Per elettroforesi&nbsp;</td></tr><tr><td>UPlanSApo 40x Microscopio Obiettivo</td><td>Olympus</td><td>1-U2B828</td><td></td></tr><tr><td>USB TTL Box</td><td>National Instruments</td><td>6501</td><td>Per interfaccia TTL</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanolo</td><td>Fisher Chemical&nbsp;</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr></tbody></table>

controllo spazio-temporale dell'attività proteica attraverso la regolazione allosterica optogenetica

Spatiotemporal Control of Protein Activity through Optogenetic Allosteric Regulation

Il LightR-Src è progettato e generato seguendo la strategia descritta in Figura 1A, B. L'analisi biochimica di LightR-Src accede alla fosforilazione di substrati endogeni noti di Src, p130Cas (Y249)22 e paxillina (Y118)23 in risposta alla luce blu a 60 minuti di illuminazione continua (Figura 2B). In particolare, non si osserva alcuna attivazione di fondo della chinasi Src quando LightR-Src viene espresso solo al buio per 16-18 ore dopo la trasfezione. Inoltre, il mutante cataliticamente inattivo di LightR-Src con mutazione D388R non induce fosforilazione del substrato di Src, dimostrando che la fosforilazione è effettuata da LightR-Src attivo e non causata da un effetto aspecifico dell'illuminazione a luce blu (Figura 2B). Riconoscendo i rapporti sull'attività oscillatoria della chinasi Src27 nelle cellule viventi, abbiamo studiato se LightR-Src potesse essere regolato per esibire attivazione ciclica. L'originale LightR-Src mostrava una cinetica di disattivazione lenta (Figura 2C), spingendo alla generazione di una nuova variante, Fast-LightR-Src, che ospita la mutazione I85V in entrambi i VVD. La Figura 2D illustra che Fast-LightR-Src mostra una cinetica di disattivazione marcatamente più rapida e si disattiva completamente entro 10 minuti dallo spegnimento della luce, rispetto a oltre un'ora per LightR-Src. Utilizzando FastLightR-Src, siamo stati anche in grado di ottenere cicli ripetuti di attivazione/inattivazione (Figura 2E). Questi risultati dimostrano collettivamente la capacità dello strumento LightR di ottenere una regolazione specifica e strettamente controllata dell'attività di Src nelle cellule viventi.
L'applicazione di FastLightR-Src consente inoltre di valutare gli effetti dell'attivazione transitoria di Src sulla morfodinamica cellulare. L'attivazione di FastLightR-Src nelle cellule HeLa induce la diffusione cellulare e questo processo si interrompe non appena FastLightR-Src viene inattivato. Dopo l'attivazione, abbiamo osservato la traslocazione di FastLightR-Src dal compartimento perinucleare alle aderenze focali e alla membrana plasmatica, un comportamento esibito dalla chinasi Src wild-type11,12. Le cellule illuminanti che esprimono il mutante cataliticamente inattivo D388RLightR-Src non riescono a mostrare tali effetti di diffusione (Figura 3B, C). Ciò conferma ulteriormente che FastLightR-Src funziona in modo simile alla sua controparte wild-type. L'illuminazione locale di una regione cellulare provoca l'attivazione localizzata di FastLightR-Src, indicata dall'accumulo locale di LightR Src nell'adesione focale e accompagnata dalla formazione di sporgenze locali di membrana (Figura 4B (i), (ii)) e dallo spostamento del baricentro cellulare (Figura 4C (i), (ii)) con conseguente movimento cellulare verso la luce. Dopo aver stabilito l'applicazione dello strumento LightR per la regolazione della chinasi Src, mostriamo l'ampia utilità di LightR estesa alla regolazione della chinasi bRaf e della DNA ricombinasi Cre. L'analisi di LightR-bRaf mostra la fosforilazione indotta dalla luce del substrato endogeno di bRaf, MEK1 e la fosforilazione a valle delle chinasi ERK1/224,25 a livelli paragonabili a quelli del mutante bRaf costitutivamente attivo (V600E) (Figura 5A). Al contrario, il D575RLightR-bRaf, cataliticamente inattivo, non dimostra fosforilazione di MEK1 e ERK1/2, paragonabile ai campioni di LightR-bRaf non illuminati, confermando così la specificità della regolazione di LightR-bRaf. L'imaging su cellule vive ha dimostrato che cicli ripetuti di attivazione/inattivazione di FastLightR-bRaf inducono traslocazioni ripetute di ERK2 dentro e fuori dal nucleo, corroborando con gli esiti noti dell'attivazione di bRaf28 (Figura 5B). L'attivazione di LightR-Cre si traduce nella ricombinazione di successo di un gene reporter mCherry, dimostrando l'applicabilità di LightR a diverse classi di enzimi (Figura 5C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig01.jpg"> 
Figura 1: Strategia di sviluppo dell'approccio LightR. (A) Strutture cristalline di due monomeri Vivid allo stato scuro (PDB: 2PD7) e del dimero allo stato illuminato (PDB: 3RH8). (B) Rappresentazione in cartone animato del design LightR. Due fotorecettori VVD collegati in tandem, inseriti nel dominio catalitico, interrompono l'attività catalitica della proteina al buio. La dimerizzazione della VVD in risposta alla luce blu ripristina l'attività della proteina. (C) Strutture cristalline dei domini catalitici (i) Src (PDB 1Y57) e (ii) bRaf (PDB 4MNF). (ii) Struttura della Cre ricombinasi (PDB 1MA7). Le frecce gialle indicano il sito di inserzione di LightR e indicano l'amminoacido sostituito. (D) Diagramma schematico della strategia di clonaggio per l'inserimento del dominio LightR in una sequenza di enzima bersaglio19. Nella fase 1, i primer appositamente progettati vengono utilizzati per la sintesi PCR di un frammento LightR affiancato da siti di ricottura nel gene bersaglio prima e dopo il sito di inserimento. Nella fase 2, il frammento di LightR così prodotto viene utilizzato come "megaprimer" per l'inserimento di LightR nel gene dell'enzima bersaglio mediante mutagenesi sito-diretta a cambiamento rapido. I pannelli A-C sono stati adattati e modificati con il permesso di Shaaya et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig02.jpg"> 
Figura 2: Caratterizzazione biochimica di LightR-Protein ingegnerizzate. (A) Rappresentazione schematica del protocollo sperimentale per la caratterizzazione biochimica di LightR Src. (B) Le cellule LinXE che esprimono transitoriamente il costrutto LightR Src con un mCherry e un tag myc all'estremità C sono state illuminate continuamente con luce blu per 60 minuti, utilizzando una configurazione LED a 465 nm. I lisati cellulari sono stati sondati per la fosforilazione dei substrati di Src, paxillina e p130Cas. I risultati del Western Blot mostrano fosforilazione della paxillina endogena e di p130Cas in risposta all'attivazione di LightR-Src nelle cellule viventi. (C, D) Le cellule LinXE che esprimono transitoriamente i costrutti LightR-Src indicati con il tag tandem mCherry-myc al C-terminale sono state continuamente esposte alla luce blu per tempi specificati (0 min e 30 min) e quindi poste al buio per periodi di tempo indicati. I lisati cellulari sono stati sondati per la fosforilazione dei substrati di Src, mostrando il confronto della cinetica di attivazione e disattivazione tra (C) LightR-Src e (D) FastLightR-Src. (E) Le cellule LinXE che esprimono transitoriamente i costrutti LightR-Src indicati con il tag tandem mCherry-myc al C-terminale sono state continuamente esposte alla luce blu per 20 minuti, seguite da ripetute incubazioni al buio per 10 minuti e alla luce per 20 minuti. I lisati cellulari sono stati raccolti e sondati per la fosforilazione dei substrati di Src, dimostrando l'efficienza del ciclo della chinasi Src tra gli stati di attivazione e inattivazione. Tutti gli esperimenti sono stati ripetuti almeno tre volte con risultati simili. I numeri visualizzati accanto a ciascun pannello Western B-E rappresentano i pesi molecolari delle proteine, misurati in kilodalton (kDa). I pannelli B-E sono stati adattati e modificati con il permesso di Shaaya et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig03v3.jpg"> 
Figura 3: Controllo dell'illuminazione globale e temporale ed effetto sull'attività di FastLightR-Src. (A) Rappresentazione in cartone animato dello schema sperimentale di illuminazione ciclica globale e temporale e successive analisi dei dati. (B,C) La regolazione della morfologia cellulare e la localizzazione di FastLightR-Src da parte della luce blu sono rappresentate in immagini rappresentative di cellule HeLa ottenute da una serie time-lapse utilizzando la microscopia a fluorescenza a campo largo. Queste cellule co-esprimevano transitoriamente FastLightR-Src-mCherry-myc (N = 10 cellule) o D388RLightR-Src-mCherry-myc cataliticamente inattive (N = 9 cellule) insieme a Stargazin-iRFP670 (marcatore della membrana plasmatica). L'imaging di cellule vive è stato condotto ogni minuto, mentre le cellule sono state illuminate globalmente con luce blu (contorni blu). (B) Le frecce gialle evidenziano la localizzazione di FastLightR-Src in strutture che assomigliano ad aderenze focali. Le immagini sono state ottenute da una serie time-lapse di cellule HeLa utilizzando la microscopia a fluorescenza a campo largo. (C) La quantificazione delle variazioni nell'area cellulare indotte dall'attivazione di FastLightR-Src rispetto a D388RLightR-Src è mostrata su ciascun pannello. La finestra di illuminazione è indicata da rettangoli blu. I grafici rappresentano gli intervalli di confidenza medi ± 90%. I pannelli B e C sono stati adattati e modificati con il permesso di Shaaya et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig04.jpg"> 
Figura 4: Controllo dell'illuminazione subcellulare locale ed effetto sull'attività di FastLightR-Src. (A) Rappresentazione in cartone animato di uno schema sperimentale di controllo locale dell'illuminazione subcellulare. (B) (i) Sequenza time-lapse che illustra una cellula HeLa che esprime FastLightR-Src-mCherry, illuminata localmente con luce blu (raffigurata da un cerchio blu). Le immagini sono state acquisite ogni minuto utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (obiettivo 60x). Le immagini sono presentate come immagini a contrasto invertito ottenute a intervalli di tempo specificati. (ii) Immagini di proiezione di celle che mostrano le sporgenze formate durante intervalli di tempo specificati. La soglia e il mascheramento della morfologia cellulare nella linea temporale sperimentale rappresentano la piattaforma per analizzare la diffusione cellulare e la dinamica del bordo cellulare. L'area illuminata specificata della cella è delineata da un cerchio blu. (C) (i) Grafico polare per le celle che rappresentano la distanza di migrazione del baricentro (d) e l'angolo di deviazione (θ) rispetto all'illuminazione locale della luce blu. I punti neri rappresentano le singole cellule HeLa che esprimono D388RLightR-Src cataliticamente inattivo (N = 6 cellule) o FastLightR-Src (N = 10 cellule). (ii) Rappresentazione schematica che dimostri la distanza di spostamento del baricentro (d) percorsa dal baricentro della cellula dall'inizio (1) alla conclusione (2) della stimolazione locale con luce blu. L'angolo di deviazione (θ) indica l'entità della divergenza del movimento del baricentro della cellula dalla posizione della luce blu. L'ombreggiatura grigio chiaro indica la regione sporgente dalla cellula in risposta alla stimolazione locale FastLightR-Src. L'area illuminata specificata della cella è indicata da un cerchio blu pieno. I pannelli B e C sono stati adattati e modificati da Shaaya et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig05.jpg"> 
Figura 5: Ampia applicabilità dell'approccio LightR. (A) Regolazione del LightR-bRaf. Le cellule LinXE che esprimono transitoriamente LightR-bRaf-Venus, D575R Catoliticamente inattivo LightR-bRaf Venus o bRaf (V600E)-Venus costitutivamente attivo sono state esposte a luce blu continua per il periodo di tempo specificato. I lisati cellulari sono stati sondati per la fosforilazione delle proteine indicate. (B) Immagini rappresentative ottenute da una serie time-lapse di imaging di cellule vive utilizzando la microscopia a fluorescenza a campo largo illustrano la regolazione della risposta globale alla luce blu nelle cellule LinXE che co-esprimono transitoriamente FastLightR-bRaf-Venus e mCherry-ERK2. Queste celle sono state illuminate globalmente con luce blu (50 ms impulsi al secondo, 50 impulsi al minuto) per durate specificate delineate in blu. L'imaging su cellule vive di mCherry-ERK2 è stato condotto ogni minuto. Le frecce gialle evidenziano gli stadi della localizzazione nucleare di ERK2 indotta dall'attivazione della luce blu di bRaf ingegnerizzato. (C) Le cellule LinXE sono state co-trasfettate transitoriamente con un reporter Floxed-stop-mCherry e LightR-Cre-iRFP670. Le cellule sono state sottoposte a condizioni di oscurità o a luce blu pulsante (2 s on, 10 s off) per un massimo di 8 ore. Le immagini per tutti i punti temporali di ciascun canale sono state acquisite utilizzando un microscopio a fluorescenza a campo largo (obiettivo 10x) con impostazioni identiche e sono state regolate a livelli di luminosità e contrasto costanti per facilitare il confronto dei livelli di espressione proteica tra i campioni. L'esperimento è stato ripetuto almeno tre volte, producendo risultati simili. La figura è stata adattata e modificata da Shaaya et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella supplementare 1: Sequenza LightR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Tabella supplementare 2: Descrizione dei siti di inserzione di LightR e lista di controllo per la progettazione della proteina LightR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Tabella supplementare 3: Primer per la clonazione LightR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%203.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Tabella supplementare 4: Condizioni di trasfezione per l'analisi biochimica dell'attività della proteina LightR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%204.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Tabella supplementare 5: Condizioni di trasfezione per l'analisi basata sull'imaging dell'attività della proteina LightR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%205.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 1: Illuminazione pulsata utilizzando l'ambiente di sviluppo integrato (IDE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2: Impostazioni di illuminazione del microscopio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20File%202_Updated.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Controllo spazio-temporale dell'attività proteica attraverso la regolazione allosterica optogenetica

Optogenetics offers the potential for mimicking complex spatiotemporal control of enzyme activity down to a subcellular resolution. However, most ...

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