Controllo spazio-temporale dell'attività proteica attraverso la regolazione allosterica optogenetica

La nostra ricerca complessiva si concentra sullo sviluppo di metodi optogenetici che raggiungano un controllo spazio-temporale preciso dell'attività proteica da parte della luce. Progettiamo domini regolabili della luce chiamati lightR per la regolazione allosterica, che ci consentono di studiare come l'attività proteica controllata spazio-temporalmente influisce sulla segnalazione cellulare e sulle funzioni, aiutando nella modellazione preclinica della malattia e nello sviluppo della terapia. L'optogenetica deve affrontare diverse sfide, tra cui il raggiungimento di un controllo preciso e reversibile dell'attività proteica bersaglio e l'imitazione accurata della cinetica di segnalazione endogena.

Le questioni chiave sono la prevenzione dell'attivazione indesiderata, l'abilitazione dell'attivazione subcellulare mirata e la gestione della fototossicità per preservare la vitalità cellulare. Inoltre, lo sviluppo di strumenti robusti e universalmente compatibili è fondamentale per migliorare la versatilità e la riproducibilità nelle applicazioni. Il nostro protocollo per l'ingegnerizzazione degli strumenti lightR combina in modo unico molteplici funzionalità avanzate in un unico sistema, tra cui la regolazione allosterica, l'elevata sensibilità, la risoluzione spaziale, lo stretto controllo temporale e la precisa specificità della segnalazione.

Questa integrazione consente la sintonizzabilità su diverse proteine bersaglio, colmando le lacune in altri metodi che potrebbero mancare di una o più di queste capacità critiche. Siamo interessati a definire i principali processi di segnalazione e strutturali che regolano la migrazione cellulare. Il nostro obiettivo è quello di utilizzare la nostra tecnologia optogenetica per analizzare le regolazioni della migrazione e delle interazioni delle cellule endoteliali.

Comprendere come il rimodellamento della matrice extracellulare sia mediato dalle cellule endoteliali e determinare come la disregolazione di questi processi contribuisca allo sviluppo della malattia. Per l'analisi biochimica della piastra lightR chinasi una volta per 10 alla potenza di sei cellule lin XE per una piastra di coltura cellulare di 3,5 centimetri per ciascun gruppo sperimentale, incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 16-18 ore. Il giorno seguente, trasfettare le cellule con il costrutto di DNA selezionato utilizzando un reagente di trasfezione appropriato.

Coprite il piatto con un foglio di alluminio e rimettetelo nell'incubatrice. Dopo 16-18 ore di trasfezione, posizionare un sistema di lampade a pannello LED da 465 nanometri all'interno dell'incubatore per colture tissutali. Posiziona un pannello di plexiglass perforato a 10 centimetri sopra la lampada per ottenere un'illuminazione di tre milliwatt per centimetro quadrato.

Utilizzare l'illuminazione continua nelle celle che esprimono LightR-Src e D388 R-LightR-Src. Accendere e spegnere manualmente il pannello LED per controllare l'illuminazione. Al termine dei punti temporali sperimentali, raccogliere le cellule sotto luce rossa di sicurezza, aspirare il terreno e lavare le cellule con PBS freddo.

L'illuminazione globale delle cellule lin XE con LightR-Src ingegnerizzato per 60 minuti mostra la fosforilazione dei substrati di Src, della paxillina endogena e delle cellule p130Cas che esprimono il mutante catalitico inattivo D388 RLightR-Src non mostra fosforilazione dei substrati di Src all'illuminazione globale. Per iniziare, piastrate due volte 10 alla potenza di cinque cellule hela per piastra di coltura tissutale da 35 millimetri in terreni di coltura cellulare. Incubare le cellule per due ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Una volta che le cellule si sono attaccate e hanno raggiunto il 60-70% di confluenza, cotrasfettare le cellule hella con la miscela data. Coprire il piatto con un foglio di alluminio per evitare l'accensione accidentale delle celle. Quindi incubare le cellule per 16-18 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Quindi, posizionare i bicchieri coperti con un diametro di 25 millimetri e uno spessore di 0,17 millimetri in una camera a sei pozzetti. Rivestire tre vetrini rotondi con cinque milligrammi per litro di fibronectina in PBS e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Quindi risciacquare i vetrini coprioggetto con PBS da 16 a 18 ore dopo la trasfezione.

Raccogli le cellule hela trasfettate in una luce rossa sicura, quindi riproduci circa una volta 10 alla potenza di cinque celle hela trasfettate su ogni vetrino coprioggetti sotto una luce rossa sicura. Coprire la piastra con un foglio di alluminio e incubare in terreno di coltura cellulare per due ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quindi, riscaldare il supporto di imaging preparato e l'olio minerale a 37 gradi Celsius.

Quindi lavare due volte i vetrini coprioggetto contenenti le celle con PBS. Dopo aver colorato e lavato le cellule, posizionare con cura il vetrino coprioggetto in una camera di imaging di cellule vive. Aggiungere un millilitro di terreno di imaging L15 alla camera.

Aggiungere un millilitro di olio minerale preriscaldato al terreno per evitare l'evaporazione durante l'imaging. Mantieni la camera protetta dalla luce a 37 gradi Celsius fino al momento dell'acquisizione. Posizionare la camera su un tavolino da microscopio preriscaldato a 37 gradi Celsius.

Selezionare una singola cella che esprima sia la ciliegia LightR-Src veloce che Src un IRFP. Seleziona regioni specifiche di interesse all'interno della cella da illuminare. Per questo studio, scegliere una piccola area alla periferia della cellula selezionata.

Visualizzare la cella selezionata ogni minuto per 20 minuti nello stato basale prima dell'illuminazione. Continuare l'imaging per 50 minuti illuminando localmente, seguiti da 20 minuti dopo l'attivazione per un totale di 90 minuti. Dopo l'imaging, salvare i filmati in formato file tif stack per l'analisi.

L'illuminazione globale delle cellule hela ha portato alla localizzazione di LightR-Src veloce alle aderenze focali, che sono state invertite una volta spenta la luce blu. Questa illuminazione ha anche causato un aumento significativo della diffusione delle celle, che si è fermata una volta spenta la luce blu. Il mutante catalitico inattivo D388 R-LightR-Src non ha mostrato alcuna diffusione cellulare.

L'illuminazione localizzata delle cellule hela che esprimono LightR-Src veloce ha provocato l'accumulo del costrutto nelle aderenze focali, portando a sporgenze di membrana localizzate con illuminazione di 50 minuti. Non è stato osservato alcun ulteriore guadagno di area nei 20 minuti di buio dopo l'illuminazione. Fast LightR-Src è gradualmente scomparso dalle aderenze focali nella fase scura.

Il baricentro della cellula si è spostato verso la regione illuminata. A seguito di una rapida attivazione di LightR-Src, che indica il movimento diretto della cella.