Visualizzazione delle trappole extracellulari dei neutrofili nelle venule mesenteriche dopo danno da ischemia-riperfusione mesenterica tramite microscopia intravitale

Il ruolo di particolari geni sull'insorgenza e lo sviluppo della trombosi, in questo caso, studiamo l'espressione endoteliale di PAR1 sul danno da ischemia-riperfusione. Cerchiamo di individuare l'effetto dell'endotelio sulla risposta, sia dopo l'ischemia che durante la riperfusione. Un aspetto davvero importante che è stato poco studiato finora è quello di individuare il ruolo dei commensali intestinali nel danno da ischemia-riperfusione mesenterica.

Per studiare questa domanda, il nostro gruppo ha combinato la microscopia intravitale con un modello di lesione da ischemia-riperfusione mesenterica e lo abbiamo combinato con modelli murini privi di germi. L'applicazione di modelli di trombosi a topi transgenici in combinazione con la microscopia intravitale, tali tecnologie consentono l'osservazione in vivo dei comportamenti cellulari durante l'insorgenza della malattia. L'esecuzione di modelli sperimentali su un organismo vivente è sempre una sfida, poiché l'esperimento è influenzato da molti fattori tra cui sesso, età, trattamento anestesiologico, modifiche alle normative sul benessere degli animali, eccetera.

Inoltre, la ricerca sulla trombosi è iniziata nel secolo scorso. Molti fattori che contribuiscono rimangono ancora irrisolti. Il mio gruppo studia il ruolo del microbiota intestinale sulla trombosi, l'aterosclerosi, la funzione piastrinica e la vascolarizzazione.

Per iniziare, posiziona il topo anestetizzato e rasato in una decubita dorsale su un termoforo. Collegare il mouse al sistema di ossigeno tramite un cono anteriore. Fissare gli arti del mouse al pad riscaldato con del nastro chirurgico.

Per l'impianto del catetere nella vena giugulare, praticare un'incisione trasversale sulla trachea. Rimuovere la pelle che copre il collo e isolare la vena giugulare destra. Quindi, utilizzando un filo di seta di cinque centimetri, chiudere l'estremità distale della vena e fissarla con una pinza chirurgica.

Posiziona tre fili di seta a circa due centimetri sotto la vena, uno vicino all'estremità distale e due vicino all'estremità prossimale della vena giugulare. Fai un nodo chirurgico, ma non chiudere il vaso. Riempire un catetere in polietilene con cloruro di sodio allo 0,9%.

Rimuovere le bolle d'aria e inserirla in una siringa da un millilitro. Usa le forbici per praticare un foro tra il secondo e il terzo nodo e impiantare il catetere nella vena giugulare. Aspirare la siringa per assicurarsi che il sangue sia presente nel catetere.

Legare il filo di seta per fissare il catetere nella vena. Quindi, utilizzare un nastro adesivo per fissare la siringa. Riempire siringhe da un millilitro con arancia acridina alla concentrazione finale di 0,5 milligrammi per millilitro e colorante di acido nucleico con concentrazione di cinque micromolari.

Iniettare 50 microlitri di SYTOX Orange per trappole extracellulari di neutrofili, o NET. Disinfettare la pelle addominale del topo con cicli alternati di scrub a base di iodio e alcol. Quindi, utilizzando un bisturi, eseguire una laparotomia da tre a cinque centimetri lungo l'alba lineare.

Posizionare delicatamente l'intestino fuori dalla cavità addominale utilizzando due punte di cotone inumidite con soluzione salina e identificare una posizione con una copertura di grasso minima. Posizionare piccoli rami dell'intestino su un impasto nero per ridurre il segnale di fondo. Iniettare 50 microlitri di arancia acridina attraverso il catetere della vena giugulare per visualizzare i leucociti colorati.

Acquisire il video dell'intestino prima della riperfusione ischemica. Prepara un impacco inumidito con cloruro di sodio e mettici dentro l'intestino. Occludere l'arteria mesenterica superiore con un piccolo morsetto vascolare.

Spingere delicatamente l'intestino nella cavità addominale utilizzando tamponi di cotone inumiditi con soluzione salina. Utilizzare una sutura 7-0 per chiudere la parete addominale e prevenire la perdita di umidità e temperatura. Dopo un'ora, rimuovere la sutura.

Dopo il periodo ischemico, applicare alcune gocce di soluzione fisiologica sulla zona tagliata. Quindi, rimuovere delicatamente le clip microvascolari utilizzando un applicatore di clip. Utilizzando punte di cotone inumidite con soluzione salina, posizionare delicatamente l'intestino fuori dalla cavità addominale e posizionare i piccoli rami della vena su un impasto nero.

Iniettare 50 microlitri di arancia acridina e catturare il video post-ischemico della vena. Accendi il microscopio a fluorescenza ad alta velocità ad ampio campo dotato di un condensatore a lunga distanza, un monocromatore, un obiettivo a immersione in acqua 10 volte e una fotocamera per dispositivi ad accoppiamento di carica. Imposta il tempo di esposizione a 30 millisecondi e seleziona il canale 5B con i filtri Alexa Fluor 488 e Rhodamine Red installati per visualizzare i leucociti e i NET.

Quantifica il reclutamento cellulare all'interno di una regione di interesse di 0,06 millimetri quadrati. Quindi, quantificare i leucociti aderenti contando le cellule che sono rimaste stazionarie o attaccate al rivestimento endoteliale durante un periodo di osservazione di 20 secondi. Identificare i NET marcati con coloranti fluorescenti sia per leucociti che per acidi nucleici.

L'adesione dei leucociti all'endotelio mesenterico ischemico è aumentata sia nel gruppo EC wild-type che in quello F2r delta in seguito a danno da ischemia-riperfusione, con un'adesione notevolmente inferiore osservata nel gruppo F2r delta EC, implicando un ruolo del PAR1 endoteliale nel reclutamento dei leucociti. Dopo il danno da ischemia-riperfusione, i NET sono stati osservati solo nel gruppo wild-type che esprimeva livelli normali di PAR1 sulle cellule endoteliali, indicando un ruolo regolatorio di PAR1 nella NETosi.