Name: Visualizzazione delle trappole extracellulari dei neutrofili nelle venule mesenteriche dopo danno da ischemia-riperfusione mesenterica tramite microscopia intravitale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Scopri la formazione delle trappole extracellulari dei neutrofili nelle venule mesenteriche dopo danno da ischemia-riperfusione utilizzando la microscopia intravitale su modelli murini. Questo metodo consente l'osservazione in vivo dei comportamenti cellulari.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Ruolo endoteliale di PAR1 nell'adesione leucocitaria e nella formazione di NET durante la lesione I/R

<table><tbody><tr><td>Arancio acridina</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>&nbsp; A-6014</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti Multiply PCR-Platten&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>721977202.00</td><td></td></tr><tr><td>Sistemi di anestesia per roditori</td><td>GROPPLER medizintechnik</td><td>Uni Vet -Porta T-8</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia IVM</td><td>B Braun Melsungen</td><td>53402101</td><td></td></tr><tr><td>pasta nera</td><td>Staedtler</td><td></td><td>pasta da modellare</td></tr><tr><td>CD146 Microbeads, topo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-007</td><td></td></tr><tr><td>cellSens</td><td>Olympus</td><td>Olympus cellSense Dimension Desktop 2.3</td><td>software</td></tr><tr><td>dispositivo ad accoppiamento di carica fotocamera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>ORCA-R2</td><td></td></tr><tr><td>fotocamera cotton fioc</td><td>B&ouml; ttger</td><td>09-119-9100</td><td></td></tr><tr><td>Emostatico curvo 125mm/5"</td><td>Indigo Instruments&nbsp;</td><td>22466</td><td></td></tr><tr><td>Crema depilatoria</td><td>Balea</td><td>non applicabile</td><td></td></tr><tr><td>Dorbene Vet</td><td>zoetis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forcipe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo p.a. 99,5 %</td><td>Roth</td><td>5504.20</td><td></td></tr><tr><td>Forbici extra strette &ndash; Dritto/Affilato-Affilato/10,5</td><td>FST</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>Janssen-Cilag GmBH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinze "Dumont #5" (Inox, punta 0,1 mm, lunghezza 11 cm)</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Graphpadprism</td><td>Graphpad</td><td>Prism 10</td><td>software</td></tr><tr><td>isoflurano&nbsp;</td><td>Piramal</td><td>4150097146757.00</td><td></td></tr><tr><td>iTaq UniversalSYBR Green Supermix 10x5ml</td><td>BioRad</td><td>1725125.00</td><td></td></tr><tr><td>Nastro medico Leukofix</td><td>BSNMedical</td><td>0213600</td><td></td></tr><tr><td>Kit di dissociazione epatica, topo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-105-807</td><td></td></tr><tr><td>LS-Colonne di separazione MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS Smart Strainer 100 &micro; m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-463</td><td></td></tr><tr><td>Microseal B Seal Seals</td><td>Biorad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>hameln</td><td>5918501.00</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Braun</td><td>2350748</td><td></td></tr><tr><td>Porta aghi</td><td>FST</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Sutura di seta intrecciata non assorbibile, dimensioni: 7/0, 91 metri&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-70</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza Olympus BX51WI</td><td>Microscopio Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR per strisce di provette</td><td>Sarstedt</td><td>72985002.00</td><td></td></tr><tr><td>Coperchi per provette PCR</td><td>Sarstedt</td><td>65989002.00</td><td></td></tr><tr><td>Catetere in plyethylene</td><td>Smith Medical Deutschland GmbH</td><td>800/100/100</td><td></td></tr><tr><td>Prolene (8648G), polipropilene 6-0, Nahtmaterial&nbsp;</td><td>Johnson & Johnson Medical GmbH&nbsp;</td><td>8695H</td><td></td></tr><tr><td>Relia Prep RNA Miniprep Systems</td><td>Promega</td><td>Z6112</td><td></td></tr><tr><td>Kit di scrittura inversa (cDNA ad alta capacità)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368813.00</td><td></td></tr><tr><td>Scala scolastica&nbsp;</td><td>KERN & SOHN GmbH</td><td>EMB 500-1</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla - Angolate lateralmente</td><td>FST</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Leica</td><td>M50</td><td></td></tr><tr><td>Emostatici dritti 135mm/5.5"</td><td>Indigo Instruments&nbsp;</td><td>22468</td><td></td></tr><tr><td>Siringa 1 mL</td><td>Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Arancione</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura TC-1000</td><td>FMI F&ouml; hr Medical Instruments GmbH</td><td>non applicabile</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per tessuti - 1x2 denti</td><td>FST</td><td>18057-14</td><td></td></tr><tr><td>morsetto vascolare</td><td>Fine Science Tools</td><td>18055-02</td><td></td></tr><tr><td>Vetiva mini</td><td>WAHL</td><td>1584-0480</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzazione delle trappole extracellulari dei neutrofili nelle venule mesenteriche dopo danno da ischemia-riperfusione mesenterica tramite microscopia intravitale

Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Mesenteric Venules After Mesenteric Ischemia-Reperfusion Injury via Intravital Microscopy

Per studiare gli effetti dipendenti dalle cellule endoteliali sul rotolamento e l'adesione dei leucociti, nonché sulla formazione di NET, inizialmente è stata esaminata l'efficacia del deficit di F2r inducibile VE-Caderina Cre nelle cellule endoteliali. La selezione magnetica delle cellule è stata impiegata per isolare le cellule endoteliali epatiche. Successivamente, l'RNA è stato isolato, seguito dalla PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR). I topi F2r ΔEC, in cui la Cre ricombinasi espressa sotto il controllo del promotore VE-Caderina è assente, hanno mostrato livelli di mRNA di F2r (PAR1) significativamente ridotti (circa un terzo) rispetto ai controlli WT (Figura 1).
Dopo aver confermato il deficit nella linea murina, è stata eseguita una lesione I/R mesenterica per esaminare l'impatto di PAR1 espresso dalle cellule endoteliali vascolari sul rotolamento e sull'adesione dei leucociti, visualizzato mediante microscopia intravitale (Figura 2A, B). Dopo 1 ora di ischemia, la pinza è stata rimossa e il vaso è stato lasciato riperfondere. Sono stati osservati e registrati il rotolamento e l'adesione dei leucociti (colorati di verde, indicati da frecce bianche). Sebbene entrambi i gruppi abbiano mostrato un aumento del numero di leucociti aderenti dopo il danno I/R, il deficit di F2r endoteliale (PAR1) ha determinato una marcata ma non significativa diminuzione dell'adesione dei leucociti all'endotelio mesenterico attivato da I/R, suggerendo un ruolo attivo dell'attivazione endoteliale di PAR1 nel reclutamento dei leucociti nelle venule mesenteriche ischemiche (Figura 2C).
L'obiettivo successivo è stato quello di esaminare se l'espressione endoteliale di PAR1 regola la formazione di NET indotta da lesioni I/R. Pertanto, gli acidi nucleici extracellulari sono stati colorati con un colorante30 impermeabile alle cellule e hanno visualizzato i NET generati utilizzando la microscopia intravitale (indicata da frecce nere) (Figura 2A, B). Dopo il danno I/R, i NET sono stati osservati solo nel gruppo WT che esprimeva livelli normali di PAR1 sulle cellule endoteliali, indicando un ruolo regolatorio di PAR1 nella NETosi (Figura 2C, D). In particolare, quando l'espressione endoteliale di F2r era soppressa, nessun NET era presente nelle venule mesenteriche con danno I/R.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67264/67264fig01.jpg"> 
Figura 1: Espressione dell'mRNA F2r (PAR1). Espressione delle cellule endoteliali epatiche F2r di topi WT (n = 6) e F2rΔEC (n = 9) rispetto al gene L32. I dati sono presentati come mediana con un intervallo di confidenza del 95%. Il test di Mann-Whitney è stato utilizzato per confrontare due gruppi indipendenti, *p &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67264/67264fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67264/67264fig02.jpg"> 
Figura 2: La PAR1 endoteliale influenza l'adesione dei leucociti e la formazione di NET nelle venule mesenteriche con danno I/R. Immagini rappresentative al microscopio intravitale di leucociti aderenti colorati con Acridina arancione (frecce bianche) e NET colorati con Sytox Orange (frecce nere) di topi WT e F2rΔEC prima (pre) e dopo (post) lesione I/R (A) 10x e (B) ingrandimento 20x. Barre della scala: A, 50 μm; B, 20 μm. (C) Adesione leucocitaria e (D) NET per mm2 di topi WT (n = 7) e F2rΔEC (n = 4) prima (pre) e dopo (post) lesione I/R. Tutti i dati sono stati rappresentati come mediana con un intervallo di confidenza del 95%. I confronti statistici sono stati eseguiti utilizzando il test ANOVA a due vie, **p&lt; 0,01, e i test di confronto multiplo di Sídák per confrontare le medie di diversi genotipi in ogni punto temporale (pre e post-ischemia). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67264/67264fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Visualizzazione delle trappole extracellulari dei neutrofili nelle venule mesenteriche dopo danno da ischemia-riperfusione mesenterica tramite microscopia intravitale

Intestinal ischemia-reperfusion (I/R) injury is an acute condition characterized by tissue damage resulting from restricted blood flow to the mesenteric ...

visualization-neutrophil-extracellular-traps-mesenteric-venules-after

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Neutrofili Trappole extracellulare (NET) sono un importante meccanismo immunitario innato per combattere i batteri patogeni, funghi e parassiti. Qui si descrivono i metodi per isolare i granulociti neutrofili dal sangue umano e di attivare per formare NET. Vi presentiamo le tecniche di preparazione di visualizzare reti in microscopia ottica ed elettronica.

Neutrofili Trappole extracellulare: Come generare e poterle visualizzare

Descriviamo un protocollo di microscopia brightfield intravitale per la misurazione dinamica dei neutrofili, le interazioni delle cellule endoteliali durante il reclutamento dei neutrofili in risposta alla sorgente di un fattore chemiotattico dei neutrofili in vivo. Crawling dei neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale nel tessuto muscolare del mouse cremastere vengono visualizzati con il tempo trascorso fotografia-video e monitorati con ImageJ.

Monitoraggio Crawling neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale in tessuto al microscopio video intravitale

Questo video dimostra l'induzione e la visualizzazione di trappole extracellulari neutrofile o NET in neutrofili pre-marcati utilizzando siero paziente contenente anticorpi citoplasmatici anti-neutrofili. Inoltre, l'utilizzo di un colorante di DNA impermeabile e della microscopia a fluorescenza consente la visualizzazione dei NET.

Induzione e visualizzazione di trappole extracellulari di neutrofili in neutrofili pre-marcati

Qui riportiamo una tecnica sperimentale di fluorescenza microscopia intravitale di visualizzare eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni sul endotelio attivato durante l'infiammazione vascolare e la formazione di trombi nei topi vivi. Questa tecnologia microscopica sarà prezioso per studiare il meccanismo molecolare della malattia vascolare e per testare agenti farmacologici in condizioni fisiopatologiche.

In tempo reale di immagine degli eterotipica piastrine-neutrofili interazioni sull&#39;endotelio Attivato durante l&#39;infiammazione vascolare e la formazione di trombi in topi vivi

Questa applicazione semplificata della microscopia intravitale delle vene mesenterarie nei topi può essere utilizzata in diversi modelli di infiammazione per osservare le interazioni leucociti-endoteliali e piastrine-leucociti.

Interazioni intravitale Microscopia di leucociti-endoteliali e piastrine-leucociti in Mesenterial Vene Mice

Descriviamo un protocollo per monitorare il comportamento dei neutrofili e dei monociti nelle vene mesenteriche in condizioni stazionarie e infiammatorie utilizzando la microscopia confocale intravitale su topi anestetizzati.

Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

Questo protocollo descrive l'induzione di un modello di ischemia-riperfusione (IR) sulla pelle orecchio mouse utilizzando magnete di bloccaggio. Utilizzando un modello di imaging intravitale custom-built, studiamo in vivo risposte infiammatorie post-riperfusione. La logica alla base dello sviluppo di questa tecnica è quello di estendere la comprensione di come leucociti rispondono al danno IR pelle.

Inducendo ischemia-riperfusione lesioni in Ear pelle mouse per intravitale Multiphoton Imaging delle risposte immunitarie

I monociti sono mediatori importanti di arteriogenesi nel contesto della malattia arteriosa periferica. Utilizzando una matrice del tipo di membrana basale e la microscopia intravital, questo protocollo indaga l'angiogenesi di homing e tumore-relativa del monocito dopo l'iniezione del monocito nel modello murino di legatura dell'arteria femorale.

Microscopia intravital del monocito Homing e l'angiogenesi tumore-relativa in un modello murino della malattia arteriosa periferica

Le trappole extracellulari neutrofilo (NET) sono strutture tridimensionali generate da granulociti neutrofili stimolati. È diventato chiaro negli ultimi anni che i NET sono coinvolti in una vasta gamma di malattie. Il rilevamento di RETI nei tessuti può avere rilevanza diagnostica, quindi sono necessari protocolli standardizzati per l'etichettatura dei componenti NET.

Immunofluorescenza Etichettatura delle trappole extracellulari di neutrofilo umano e murino nel tessuto incorporato di paraffina

Descriviamo un metodo per identificare le trappole extracellulari neutrofiche (NET) nei trombi arteriosi cardiogenici felini fissi e incorporati in parina di formaldeide utilizzando il recupero di antigeni indotti dal calore e un doppio protocollo di immunoetichettatura.

Identificazione delle trappole extracellulari neutrophil in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi utilizzando la microscopia immunofluorescenza

Le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono associate a varie malattie e l'immunofluorescenza viene spesso utilizzata per la loro visualizzazione. Tuttavia, esistono vari protocolli di colorazione e, in molti casi, viene esaminato un solo tipo di tessuto. Qui, stabiliamo un protocollo generalmente applicabile per la colorazione dei NET nel topo e nel tessuto umano.

Imaging in immunofluorescenza di trappole extracellulari di neutrofili in tessuti umani e murini

Scopri la formazione delle trappole extracellulari dei neutrofili nelle venule mesenteriche dopo danno da ischemia-riperfusione utilizzando la microscopia intravitale su modelli murini. Questo metodo consente l'osservazione in vivo dei comportamenti cellulari.

Visualizzazione delle trappole extracellulari dei neutrofili nelle venule mesenteriche dopo danno da ischemia-riperfusione mesenterica tramite microscopia intravitale (Video) | JoVE Journal

Visualizzazione delle trappole extracellulari dei neutrofili nelle venule mesenteriche dopo danno da ischemia-riperfusione mesenterica tramite microscopia intravitale

Esplora altri video