Dispositivo polmonare artificiale Priming per l'innesto di superfici di fasci di fibre in situ

I dispositivi medici di barriera sanguigna essenziali per la terapia intensiva spesso affrontano la formazione di trombi, compromettendo la funzione e aumentando i rischi di trombosi sistemica. Gli anticoagulanti clinici mitigano la trombosi, ma aumentano i rischi di sanguinamento. L'assorbimento delle proteine sulle superfici dei biomateriali innesca la coagulazione e l'infiammazione.

Abbiamo studiato l'impatto del rivestimento di lavaggio del polimero zoura sull'assorbimento delle proteine del circuito ECMO. Attualmente, non esiste un anticoagulante commerciale che inibisca selettivamente ed efficacemente la trombosi nei dispositivi medici senza influire sul paziente. Inoltre, è essenziale ottimizzare e dimostrare l'efficacia dei rivestimenti superficiali e dell'ingegneria per durate che vanno da giorni a settimane e persino mesi per vari dispositivi medici.

I nostri nuovi obiettivi scientifici includono la valutazione dell'influenza di diversi approcci di pre-elaborazione sull'applicazione del rivestimento, la valutazione dell'impatto dei metodi di manipolazione per la soluzione di rivestimento wash through sull'uniformità del rivestimento, lo studio degli effetti di innesti polimerici antivegetativi alternativi sull'incrostazione proteica aspecifica e la determinazione della capacità di rivestimenti ottimizzati di limitare la trombosi in vivo. Per pulire il circuito polmonare, ricircolare il 30% di metanolo in acqua deionizzata per 20 minuti. Seguire questo facendo ricircolare il 10% di metanolo in acqua deionizzata e poi solo acqua deionizzata per altri 20 minuti.

Asciugare il circuito polmonare con aria domestica filtrata impostata su flusso basso per due ore. Posizionare il circuito polmonare pulito e asciugato nel generatore di plasma di ozonolisi ultravioletta. Chiudere il generatore e accendere lo strumento per avviare l'esposizione al plasma per 20 minuti.

Dopo aver completato l'esposizione al plasma, procedere direttamente alla fase di rivestimento per prevenire il riarrangiamento della catena superficiale e la perdita dei siti reattivi generati dall'interazione con il plasma. Mentre il dispositivo subisce una modifica della superficie, sciogliere 1,2 grammi di dopamina cloridrato in 600 millilitri di tampone tris in un becher di vetro. Successivamente, sciogliere il monomero di metacrilato di solfobetaina in un rapporto di 1 a 15 cloridrato di dopamina per metacrilato di solfobetaina.

Quindi aggiungere cinque millimolari di parolato di sodio sotto forma di goccioline nella soluzione di rivestimento. Utilizzare un'ancoretta magnetica e una piastra di agitazione impostate a 150 giri/min per miscelare accuratamente la soluzione. Quindi, adescare il dispositivo polmonare con la soluzione di rivestimento utilizzando una siringa grande per aspirare e riempire il circuito.

Clamp un'estremità del circuito e adescarlo dall'altra estremità mentre guida le bolle d'aria attraverso un connettore di accesso al circuito. Una volta che il circuito è completamente adescato, posizionare il dispositivo sotto una fonte di luce ultravioletta per due ore. Agitare la soluzione riorientando le estremità del dispositivo principale su e giù ogni 10 minuti.

Dopo il trattamento con la luce, svuotare completamente il circuito. Sciacquare delicatamente tutti i campioni con acqua deionizzata adescando e drenando ripetutamente con una siringa da 60 centimetri cubi fino a quando l'effluente di risciacquo non è limpido. Infine, conservare il dispositivo riempito con acqua deionizzata in un frigorifero impostato a quattro gradi Celsius per l'autopsia e le analisi di superficie.

Per eseguire il test di assorbimento del fibrinogeno, trasferire i campioni di tappetino in fibra in una soluzione di fibrinogeno da tre milligrammi per millilitro in piastre a pozzetti e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 90 minuti a 60 giri/min. Lavare i campioni con PBS. Trasferirli in nuovi pozzetti e aggiungere un millilitro di un milligrammo per millilitro di soluzione BSA a ciascun pozzetto.

Incubare per altri 90 minuti. Quindi lavare i campioni altre tre volte con la soluzione PBS e trasferirli in nuovi pozzetti. Quindi, aggiungere un millilitro di una diluizione da uno a 1000 di anticorpo fibrinogeno coniugato con perossidasi di rafano in soluzione PBS a ciascun pozzetto.

Dopo aver incubato i campioni per 30 minuti e averli lavati, trasferirli in nuovi pozzetti. Nei nuovi pozzetti, aggiungere 500 microlitri di efenilendiammina in tampone citrato fosfato con perossido di idrogeno allo 0,03%, regolato a un pH di 5,0 a intervalli di 30 secondi. Incubare i campioni al riparo dalla luce per 30 minuti.

Per fermare la reazione della perossidasi e dell'ofenilendiammina, aggiungere 500 microlitri di un normale acido cloridrico a ciascun pozzetto. Trasferire il surnatante da ogni pozzetto in una cuvetta. Misurare l'assorbanza del surnatante a 492 nanometri utilizzando uno spettrofotometro UV visibile.

Scongelare il kit per il dosaggio della lattato deidrogenasi per 20 minuti. Mentre il kit del test è in fase di scongelamento, preparare il pool di plasma umano adulto per ottenere plasma ricco di piastrine. Per preparare il plasma ricco di piastrine, la centrifuga ha scongelato le provette per campioni di plasma umano a 483 G per separare il plasma in due regioni.

Identificare il terzo inferiore contenente plasma ricco di piastrine e i due terzi superiori contenenti plasma povero di piastrine. Rimuovere con cautela i pellet piastrinici sul fondo delle provette e i due terzi superiori contenenti plasma povero di piastrine. Disperdere delicatamente il pellet piastrinico nel plasma superiore agitando le provette.

Prima del test, aggiungere cloruro di calcio al plasma ricco di piastrine per invertire gli effetti dei citrati. Successivamente, incubare i campioni di tappetino in fibra in 500 microlitri di plasma ricco di piastrine per 90 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, trasferire i campioni in nuovi pozzetti e risciacquare tre volte con la soluzione di PBS.

Anche in questo caso, trasferire i campioni in nuovi pozzetti. Aggiungere 300 microlitri di soluzione PBS e 10 microlitri di tampone di lisi 10 X a ciascun pozzetto. Incubare i campioni per 45 minuti, quindi aggiungere 50 microlitri della miscela di reazione a ciascun pozzetto e incubare per 30 minuti al riparo dalla luce.

Aggiungere 50 microlitri di acido cloridrico in ogni pozzetto per fermare le reazioni. Per rilevare l'attività della lattato deidrogenasi dai lisati delle piastrine assorbite, misurare l'assorbanza della luce delle soluzioni a pozzetto sviluppate a 490 nanometri e 680 nanometri. L'incrostazione di fibrinogeno è risultata significativamente ridotta nelle fibre PP-PDMS codificate rispetto ai controlli non rivestiti.

Non c'era alcuna differenza significativa nell'incrostazione di fibrinogeno tra i fasci esterni e interni nelle fibre PP-PDMS in assenza di condizioni di flusso. Al di sotto del flusso di PBS nelle 24 ore, l'incrostazione di fibrinogeno nei fasci esterni e interni è rimasta bassa e non ha mostrato differenze significative. L'incrostazione piastrinica era più alta nel fascio esterno di fibre PP-PDMS rispetto al fascio interno e nel controllo non rivestito.

L'incrostazione piastrinica era significativamente più alta nel fascio esterno rispetto alle fibre PP-PDMS codificate nel fascio interno senza esposizione al flusso. Al di sotto del flusso di PBS nelle 24 ore, non è stata osservata alcuna differenza significativa nell'incrostazione piastrinica tra i fasci esterni e interni con bassi livelli di incrostazioni.