Name: Ablazione mediata da laser a due fotoni di osteoblasti nello sviluppo di larve di zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Impara l'ablazione laser a due fotoni di osteoblasti nelle larve di zebrafish per studiare la rigenerazione ossea e il ruolo del sistema immunitario. Questo metodo permette di analizzare i meccanismi cellulari coinvolti nella guarigione.

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Il protocollo di studio ha ricevuto l'approvazione dalla Landesdirektion Sachsen, numeri di permesso 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. I ceppi di zebrafish utilizzati sono stati mantenuti secondo la legge nazionale e in condizioni standardizzate come descritto in precedenza27,28. I dettagli di tutti i reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Preparazione dei materiali e delle soluzioni
<ol><li>Mantenere gli embrioni in 1x terreno E3. Preparare il terreno E3 1x diluendo 170 mL di un stock E3 60x in 10 L di acqua deionizzata e aggiungendo 2 mL di blu di metilene allo 0,1%.<ol><li>Preparare il terreno di coltura E3 60x mescolando 17,2 g di NaCl, 0,76 g di KCl, 2,90 g di CaCl2·2 H2O, 4,90 g di MgSO4·7 H2O in 1 L di acqua autoclavata deionizzata.</li>
	</ol></li>
	<li>Per l'inclusione delle larve, preparare in anticipo aliquote di agarosio a basso punto di fusione (LMA) all'1% e conservarle a temperatura ambiente.<ol><li>Per preparare le aliquote, sciogliere l'LMA in 1 terreno E3, ad esempio 500 mg di LMA in 50 ml di 1x E3 in un pallone di Erlenmeyer, riscaldare la soluzione nel microonde fino a quando l'agarosio non si dissolve completamente e dispensarla in aliquote da 1 ml in provette da 1,5 mL.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Allevamento di zebrafish e raccolta di embrioni
NOTA: Qui sono state utilizzate larve di zebrafish transgeniche doppie che riportano la presenza di osteoblasti impegnati [osterix:nGFP = Tg(Ola.Sp7:NLS-GFP)zf132]29 e macrofagi [mpeg:mCherry = Tg(mpeg:mCherry)gl23]30 (Figura 1A).
<ol><li>Prepara il pesce zebra parentale con i singoli transgeni desiderati in gabbie di accoppiamento standard la sera prima dell'accoppiamento. NOTA: Le gabbie standard per l'accoppiamento consentono alle uova di passare in uno scomparto inferiore dove i genitori del pesce zebra non possono raggiungerle.<ol><li>Tenere separati maschi e femmine fino all'accoppiamento utilizzando un divisorio nella gabbia di accoppiamento. Rimuovere il divisore la mattina del giorno successivo per iniziare l'accoppiamento.</li>
	</ol></li>
	<li>Al più tardi a mezzogiorno, rimuovete i genitori del pesce zebra dalle vasche di riproduzione e raccogliete gli embrioni, filtrando l'acqua dalla gabbia di accoppiamento attraverso un setaccio. NOTA: Nel caso in cui l'età esatta delle larve sia decisiva, raccogliere gli embrioni a intervalli regolari di circa 30 minuti. I clutch mate dovrebbero essere utilizzati in esperimenti con diversi gruppi sperimentali.</li>
	<li>Mettere gli embrioni in un piatto di 100 mm di diametro contenente 1x terreno E3 e conservarli in un'incubatrice a 28 °C31.</li>
	<li>Rimuovere gli ovuli non fecondati e gli embrioni morti dal piatto utilizzando una pipetta di plastica con l'aiuto di uno stereomicroscopio e cambiare 1 terreno E3 al giorno.</li>
	<li>Prima dell'esperimento, selezionare le larve positive per i transgeni reporter utilizzando uno stereomicroscopio a fluorescenza.</li>
</ol>3. Larve che si incastrano nell'agarosio a basso punto di fusione
<ol><li>Fondere le aliquote LMA in un termoblocco o in un bagno d'acqua a 65 °C. Una volta che l'LMA è fuso, mantenerlo a 42 °C fino all'inclusione (Figura 1B). Aggiungere 50 μL di MS-222 allo 0,4% di aliquota LMA fusa per ottenere una concentrazione di MS-222 dello 0,02% per l'anestesia.</li>
	<li>Anestetizzare 4 larve dpf (giorni dopo la fecondazione) (o larve più vecchie) in terreno MS-222 E3 allo 0,02%.</li>
	<li>Trasferire le larve anestetizzate in una capsula a micropozzetti con fondo di vetro utilizzando una pipetta Pasteur di plastica da 3 ml e rimuovere il terreno E3 in eccesso con la stessa pipetta (Figura 1B). Evitare l'essiccazione delle larve. NOTA: Più di una larva può essere incorporata in un piatto contemporaneamente; Si consiglia di incorporare da 3 a 5 larve per consentire un tempo sufficiente per il posizionamento.</li>
	<li>Prelevare l'agarosio LMA fuso dal bagnomaria/termoblocco e aggiungere una goccia (di raffreddamento) di LMA al piatto, coprendo il fondo di vetro dove erano posizionate le larve. Prestare attenzione che l'LMA non sia troppo caldo ma comunque liquido.</li>
	<li>Quindi, posizionare le larve nella posizione laterale desiderata prima che l'agarosio si solidifichi. Qui, assicurarsi di una posizione laterale in cui l'opercolo sia il più vicino possibile al fondo di vetro del piatto come preparazione per la configurazione del microscopio inverso (Figura 1B).</li>
	<li>Lasciare solidificare l'agarosio e quindi aggiungere il terreno E3 (contenente un massimo dello 0,02% di MS-222) alla piastra per evitare l'essiccazione dell'agarosio (Figura 1B).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig01.jpg"> Figura 1: Rappresentazione schematica della procedura di inclusione. (A) Doppia Tg(osterix:nGFP; Sono state utilizzate 29,30 larve di zebrafish con osteoblasti opercolari marcati in verde e macrofagi marcati in rosso. (B) Il flusso di lavoro della procedura di incorporamento, come descritto nella fase 3 del protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
4. Imaging in vivo delle larve e ablazione laser
<ol><li>Per l'ablazione laser di osteoblasti nell'opercolo in via di sviluppo del pesce zebra transgenico Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30, utilizzare un microscopio a scansione laser a due fotoni invertito con un obiettivo ad acqua 25x/0.95 o una configurazione equivalente.</li>
	<li>Posizionare la capsula con le larve incorporate sul tavolino microscopico al microscopio invertito e posizionare la regione desiderata per l'ablazione al centro del campo visivo. L'opercolo può essere facilmente identificato con l'aiuto del segnale di fluorescenza GFP.</li>
	<li>Una volta che l'opercolo è stato messo a fuoco e centrato nel campo visivo del microscopio, scegliere le impostazioni z-stack (spesso vengono utilizzati intervalli z di 1-2 μm) per visualizzare l'intera larghezza dell'opercolo. Allo stesso tempo, scegliere l'area in uno specifico piano z da ablare (di solito nella zona posteriore dell'opercolo). L'ablazione laser a due fotoni viene esercitata solo su questo piano. NOTA: Una risoluzione più elevata nella dimensione z porterà a tempi di imaging più lunghi, ma consentirà analisi volumetriche dei dati acquisiti in un secondo momento.</li>
	<li>Visualizzare l'area dell'opercolo di interesse prima dell'ablazione. Per il rilevamento della GFP, utilizzare un laser a luce bianca a 488 nm e un rivelatore ibrido da 495 nm a 550 nm o equivalente. Imaging dei macrofagi utilizzando un'eccitazione a 555 nm (laser a luce bianca), con un intervallo di rilevamento mCherry da 595 a 780 nm su un rivelatore ibrido (o equivalente).<ol><li>Utilizzare il formato immagine 512 x 512 per un buon rapporto qualità/tempo (altri formati possono essere utilizzati se si desidera una risoluzione più elevata o in alternativa una velocità maggiore). NOTA: È possibile utilizzare e regolare un'incubatrice a temperatura controllata installata sul microscopio, ad es. a 28 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Disegna una regione circolare con un diametro di 25 μm (altre forme e dimensioni possono essere selezionate a seconda dell'esperimento) in un piano 2D selezionato, focalizzando l'opercolo utilizzando lo strumento ROI.</li>
	<li>Per eseguire l'ablazione, applicare la potenza di ablazione (misurata senza obiettivo) a 450 mW ed esporre l'area selezionata al laser a due fotoni a una velocità di scansione di 400 Hz e una durata totale di 10 s. Durante l'ablazione, l'area può essere visualizzata utilizzando un rivelatore ibrido nell'intervallo 401-443 nm o equivalente.</li>
	<li>Dopo l'ablazione, confermare l'ablazione strutturalmente visualizzando nuovamente lo stesso z-stack con le stesse impostazioni utilizzate prima dell'ablazione. L'area ablata non contiene più cellule fluorescenti.</li>
</ol>5. Recupero delle larve e imaging per monitorare il reclutamento delle cellule immunitarie
<ol><li>Se l'imaging del reclutamento delle cellule immunitarie deve essere eseguito con un ritardo, recuperare le larve dall'imaging e dall'anestesia. Rimuovere con cura le larve dall'LMA utilizzando una pinza o un ago da dissezione.<ol><li>Per prima cosa, rimuovi uno strato di agarosio che copre le larve. In secondo luogo, rimuovere l'agarosio a diretto contatto con le larve. Omettere questo passaggio se è in corso l'imaging immediato del reclutamento delle cellule immunitarie.</li>
	</ol></li>
	<li>Rimettere le larve in un piatto con terreno E3 puro e verificarne il recupero. Il recupero è evidente nuotando delle larve.</li>
	<li>A 4 o 6 hpl (ore dopo la lesione), visualizzare nuovamente l'area opercolare utilizzando le stesse impostazioni allo stesso microscopio per verificare gli effetti dell'ablazione sul reclutamento dei macrofagi. A tale scopo, ripetere l'incorporamento (passaggio 3) e l'imaging come eseguito in precedenza (passaggio 4).</li>
	<li>Dopo l'imaging, rimuovere le larve dall'LMA. Il sacrificio delle larve può essere eseguito mediante incubazione in acqua ghiacciata o con un sovradosaggio di MS-222 in E3, a seconda dei requisiti di legge. I campioni possono quindi essere utilizzati per studi di follow-up o smaltiti.</li>
</ol>6. Analisi delle immagini e analisi statistiche
<ol><li>Elabora le immagini utilizzando un software di elaborazione delle immagini come Fiji32. A seconda della risoluzione z dei dati acquisiti, le analisi possono essere eseguite in 2D o 3D.</li>
	<li>Quantificare manualmente i macrofagi includendo cellule chiaramente separate, ad esempio distinguendo i corpi cellulari principali, o in alternativa quantificando le cellule con un'etichetta nucleare o misurando l'area nel caso in cui le cellule si sovrappongano (passaggio successivo).</li>
	<li>Per quantificare l'area, creare una maschera che includa i macrofagi. A tale scopo, utilizza lo strumento Regola &gt; soglia &gt; immagine e crea un ROI (Strumenti di analisi &gt; &gt; Gestore ROI &gt; Aggiungi) nelle Fiji. Escludere piccole particelle sullo sfondo per la quantificazione.<ol><li>Quindi, misurare l'area (Analizza &gt; misura). Considerare se le aree di fluorescenza cellulare sovrapposta devono essere incluse nella misurazione. NOTA: Qui, l'area di ablazione circolare è stata omessa dalle misurazioni dell'area poiché i macrofagi reclutati non possono essere distinti in quest'area.</li>
	</ol></li>
	<li>Genera grafici che tracciano i risultati della misurazione utilizzando un software adatto. Per confrontare i dati prima e dopo l'ablazione, eseguire un test statistico appropriato (qui è stato eseguito un test t accoppiato a una coda). NOTA: Le figure possono essere preparate utilizzando software di fotoritocco e progettazione grafica.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Metodo di ablazione laser per studiare la rigenerazione ossea nelle larve di zebrafish

<ol><li>Marques, I. J., Lupi, E., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+for+regeneration%3A+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Model systems for regeneration: Zebrafish.</a> Dev. 146 (18), dev167692(2019).</li>
<li>Dietrich, K., Fiedler, I. A. K., Kurzyukova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+biology+and+disease+modeling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Skeletal biology and disease modeling in zebrafish.</a> J Bone Miner Res. 36 (3), 436-458 (2021).</li>
<li>Geurtzen, K., Knopf, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+zebrafish+injury+models+to+study+the+effects+of+prednisolone+in+regenerating+bone+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue.</a> J Vis Exp. (140), e58429(2018).</li>
<li>Sousa, S., Valerio, F., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+zebrafish+bone+crush+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">A new zebrafish bone crush injury model.</a> Biol Open. 1 (9), 915-921 (2012).</li>
<li>González-Rosa, J. M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryoinjury+as+a+myocardial+infarction+model+for+the+study+of+cardiac+regeneration+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cryoinjury as a myocardial infarction model for the study of cardiac regeneration in the zebrafish.</a> Nat Protoc. 7 (4), 782-788 (2012).</li>
<li>Chassot, B., Pury, D., Jaźwińska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+fin+regeneration+after+cryoinjury-induced+tissue+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Zebrafish fin regeneration after cryoinjury-induced tissue damage.</a> Biol Open. 5 (6), 819-828 (2016).</li>
<li>Singh, S. P., Holdway, J. E., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+amputated+zebrafish+fin+rays+from+de+novo+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Regeneration of amputated zebrafish fin rays from de novo osteoblasts.</a> Dev Cell. 22 (4), 879-886 (2012).</li>
<li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish%3A+a+new+tool+for+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).</li>
<li>Ando, K., Shibata, E., Hans, S., Brand, M., Kawakami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblast+production+by+reserved+progenitor+cells+in+zebrafish+bone+regeneration+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Osteoblast production by reserved progenitor cells in zebrafish bone regeneration and maintenance.</a> Dev Cell. 43 (5), 643-650.e3 (2017).</li>
<li>Geurtzen, K., López-Delgado, A. C., Duseja, A., Kurzyukova, A., Knopf, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-mediated+osteoblast+ablation+triggers+a+pro-osteogenic+inflammatory+response+regulated+by+reactive+oxygen+species+and+glucocorticoid+signaling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Laser-mediated osteoblast ablation triggers a pro-osteogenic inflammatory response regulated by reactive oxygen species and glucocorticoid signaling in zebrafish.</a> Dev. 149 (8), 1998030(2022).</li>
<li>Volpe, B. A., Fotino, T. H., Steiner, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscope-based+laser+ablation+and+regeneration+assay+in+zebrafish+interneuromast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Confocal microscope-based laser ablation and regeneration assay in zebrafish interneuromast cells.</a> J Vis Exp. (159), e60966(2020).</li>
<li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+of+the+zebrafish+pronephros+to+study+renal+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration.</a> J Vis Exp. (54), e2845(2011).</li>
<li>Goldstein, A. M., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notochord+regulates+cardiac+lineage+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Notochord regulates cardiac lineage in zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 201 (2), 247-252 (1998).</li>
<li>Zhang, J., Jeradi, S., Strähle, U., Akimenko, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+of+the+sonic+hedgehog-a-expressing+cells+during+fin+regeneration+affects+ray+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser ablation of the sonic hedgehog-a-expressing cells during fin regeneration affects ray branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 365 (2), 424-433 (2012).</li>
<li>Marshall, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+cell+and+tissue+level+laser+ablation+methods+to+study+morphogenetic+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-photon cell and tissue level laser ablation methods to study morphogenetic biomechanics.</a> Methods Mol Biol. 2438, 217-230 (2022).</li>
<li>Angelo, J. R., Tremblay, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-mediated+cell+ablation+during+post-implantation+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development.</a> Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).</li>
<li>Lee, J., Lee, S., Truong, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+of+pancreatic+cancer+using+a+cylindrical+light+diffuser%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Laser ablation of pancreatic cancer using a cylindrical light diffuser.</a> Lasers Med Sci. 37 (6), 2615-2621 (2022).</li>
<li>Luther, E., Mansour, S., Echeverry, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+for+cerebral+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurg+Clin+N+Am%22%5BJournal%5D)">Laser ablation for cerebral metastases.</a> Neurosurg Clin N Am. 31 (4), 537-547 (2020).</li>
<li>Smutny, M., Behrndt, M., Campinho, P., Ruprecht, V., Heisenberg, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV+laser+ablation+to+measure+cell+and+tissue-generated+forces+in+the+zebrafish+embryo+in+vivo+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">UV laser ablation to measure cell and tissue-generated forces in the zebrafish embryo in vivo and ex vivo.</a> Methods Mol Biol. 1189, 219-235 (2015).</li>
<li>Vogel, A., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+pulsed+laser+ablation+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of pulsed laser ablation of biological tissues.</a> Chem Rev. 103 (2), 577-644 (2003).</li>
<li>Wu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-based+tumor+ablation%3A+Role+of+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Heat-based tumor ablation: Role of the immune response.</a> Adv Exp Med Biol. 880, 131-153 (2016).</li>
<li>Renvoizé, C., Biola, A., Pallardy, M., Bréard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+Identification+of+dying+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: Identification of dying cells.</a> Cell Biol Toxicol. 14 (2), 111-120 (1998).</li>
<li>Julier, Z., Park, A. J., Briquez, P. S., Martino, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+tissue+regeneration+by+modulating+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Promoting tissue regeneration by modulating the immune system.</a> Acta Biomater. 53, 13-28 (2017).</li>
<li>Petrie, T. A., Strand, N. S., Tsung-Yang, C., Rabinowitz, J. S., Moon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+modulate+adult+zebrafish+tail+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Macrophages modulate adult zebrafish tail fin regeneration.</a> Dev. 141 (13), 2581-2591 (2014).</li>
<li>Geurtzen, K., Vernet, A., Freidin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+suppressive+and+bone+inhibitory+effects+of+prednisolone+in+growing+and+regenerating+zebrafish+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Immune suppressive and bone inhibitory effects of prednisolone in growing and regenerating zebrafish tissues.</a> J Bone Miner Res. 32 (12), 2476-2488 (2017).</li>
<li>Fleischhauer, L., López-Delgado, A. C., Geurtzen, K., Knopf, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+effects+in+the+regenerating+fin+reflect+tissue+homeostasis+disturbances+in+zebrafish+by+affecting+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol.+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid effects in the regenerating fin reflect tissue homeostasis disturbances in zebrafish by affecting Wnt signaling.</a> Front Endocrinol. (Lausanne). 14, 1122351(2023).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon Press. https://books.google.de/books?id=Iy8PngEACAAJ (2002).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+and+Cyp26b1+are+critical+regulators+of+osteogenesis+in+the+axial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton.</a> Dev. 135 (22), 3765-3774 (2008).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Breeding+and+Embryo+Handling%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+II%3A+Mouse%2C+Zebrafish%2C+and+Chick%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Breeding and Embryo Handling.</a> Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. , JoVE. Cambridge, MA. (2023).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-scale+gradient+of+hydrogen+peroxide+mediates+rapid+wound+detection+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish.</a> Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).</li>
<li>Blanchard, G. B., Scarpa, E., Muresan, L., Sanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+combines+with+planar+polarised+patterning+during+metaphase+to+orient+embryonic+epithelial+cell+divisions%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress combines with planar polarised patterning during metaphase to orient embryonic epithelial cell divisions.</a> Dev. 151 (10), dev202862(2024).</li>
<li>Park, W., Wei, S., Kim, B. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+complexity+of+cell+death%3A+A+historical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Diversity and complexity of cell death: A historical review.</a> Exp Mol Med. 55 (8), 1573-1594 (2023).</li>
<li>O'Connor, J., Akbar, F. B., Hutson, M. S., Page-McCaw, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zones+of+cellular+damage+around+pulsed-laser+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zones of cellular damage around pulsed-laser wounds.</a> PLoS One. 16 (9), e0253032(2021).</li>
<li>Griebel, M., Vasan, A., Chen, C., Eyckmans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+clearance+of+damaged+tissue+following+laser+ablation+in+engineered+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Fibroblast clearance of damaged tissue following laser ablation in engineered microtissues.</a> APL Bioeng. 7 (1), 16112(2023).</li>
<li>Matrone, G., Taylor, J. M., Wilson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-targeted+ablation+of+the+zebrafish+embryonic+ventricle%3A+a+novel+model+of+cardiac+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair.</a> Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Cloruro di calcio diidrato, CaCl2&middot; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>5239.1</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari, PS, 100/20 mm</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Foceps</td><td>FST</td><td>11295-51</td><td>Forma della punta diritta, 11 cm, 0,05 x 0,02 mm</td></tr><tr><td>Piastra Falcon a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>353502</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per micropozzetti con fondo in vetro</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Piatto da 35 mm, vetrino coprioggetti n. 1,5, diametro del vetro 14 mm,</td></tr><tr><td>laser multifotone Insight X3</td> non rivestito <td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suite di applicazioni Leica</td><td>LAS X, agarosio</td> a basso punto di fusione Leica Microsystems<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Biozyme</td><td>840101</td><td>Biozym Plaque Agarosio</td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato, MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>Gabbie</td><td></td><td></td> di accoppiamento <td>molte varietà, ad es. Tecniplast</td></tr><tr><td>Methyleneblue</td><td>Carl Roth</td><td>A514.1</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio, KCl</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131494</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio, NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>SP8 FALCON&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Dotato di un laser multifotone Insight X3 e del software Leica Application Suite</td></tr><tr><td>Ago da dissezione in acciaio inossidabile</td><td>Bochem</td><td>12010</td> Sistema di stereomicroscopio da <td>140 mm</td></tr><tr><td>SZX16</td><td>Olympus</td><td></td><td>Dotato di una base di illuminazione a LED SZX2-ILLTQ</td></tr><tr><td>Armadi termostatici TS - WTW</td><td>xilema</td><td>TS 608/2-i</td><td>Per incubazione (embrione</td></tr><tr><td>)Trasferimento pipetta, 3,5 mL</td><td>SARSTEDT</td><td>861171</td><td>155 x 15 mm, LD-PE, trasparente</td></tr><tr><td>Zeiss SteREO Discovery.V12 versione 4.7.1.0.</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Dotato di telecamera Axiocam MRm e software AxioVision</td></tr></tbody></table>

ablazione mediata da laser a due fotoni di osteoblasti nello sviluppo di larve di zebrafish

Two-Photon Laser-Mediated Ablation of Osteoblasts in Developing Zebrafish Larvae

L'ablazione laser è stata eseguita come indicato nel protocollo di cui sopra. Il segnale GFP degli osteoblasti nell'area ablata è scomparso istantaneamente dopo l'ablazione. Per studiare la risposta dell'ablazione degli osteoblasti in termini di risposta immunitaria, è stata rilevata la presenza di macrofagi in larve di 6 dpf prima e a 6 hpl. Prima dell'ablazione, sono stati osservati pochissimi macrofagi nell'area opercolare10 (Figura 2). A 6 hpl, è stato rilevato un forte accumulo di macrofagi nella regione dell'opercolo ablato e un aumento del numero di macrofagi nel campo visivo, compreso l'opercolo e l'area circostante l'opercolo10 (Figura 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig02v2.jpg"> Figura 2: Reclutamento di macrofagi a 6 hpl in larve di zebrafish 6 dpf. Area opercolare senza ablazione e a 6 hpl. Gli osteoblasti opercolari sono etichettati in verde, i macrofagi in magenta e il cerchio tratteggiato indica l'area ablata con laser. Barra della scala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Il reclutamento dei macrofagi è stato analizzato anche in larve di 4 dpf con opercoli molto più piccoli a 4 hpl, osservando risultati simili (Figura 3). La quantificazione del numero di macrofagi (al di fuori del sito di ablazione laser immediato) ha mostrato un aumento nell'arco di tempo studiato (4,00 ± 2,37 macrofagi prima dell'ablazione rispetto a 7,00 ± 2,76 macrofagi a 4 hpl) (Figura 3B). Allo stesso modo, l'area dei macrofagi (misurata in μm2, 785,8 μm2 ± 723,1 μm2 prima dell'ablazione rispetto a 1553 μm2 ± 869,9 μm2 a 4 hpl) è aumentata (Figura 3C). Poiché i macrofagi a volte sono difficili da distinguere, si raccomanda di misurare l'area dei macrofagi invece del numero dei macrofagi, come è stato fatto qui.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig03.jpg"> Figura 3: Reclutamento di macrofagi a 4 hpl in larve di zebrafish a 4 dpf. (A) Area opercolare senza ablazione e a 4 hpl. Gli osteoblasti opercolari sono etichettati in verde, i macrofagi in magenta e il cerchio tratteggiato indica l'area ablata con laser. Barra della scala: 50 μm. (B) Quantificazione del numero di macrofagi nell'area opercolare direttamente prima (0 hpl) e dopo l'ablazione (4 hpl). (C) Quantificazione dell'area dei macrofagi (sito di ablazione laser escluso). Test t accoppiati a una coda. Ogni punto rappresenta i dati di una larva e viene mostrata la media ± SD, n = 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Ablazione mediata da laser a due fotoni di osteoblasti nello sviluppo di larve di zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) have an outstanding capacity to regenerate different organs and appendages. Bone regeneration in zebrafish has been studied using ...

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Qui si descrive un metodo per il montaggio di embrioni di zebrafish a lungo termine di imaging, due fotoni imaging e tessuti danni tecniche, e time-lapse confocale.

Due fotoni assotomia e time-lapse confocale in embrioni di zebrafish vivo

Danno renale acuto (AKI) negli esseri umani è un problema comune clinico causato da un danno alle cellule epiteliali che costituiscono nefroni renali e AKI è associata ad elevati tassi di mortalità del 50-70% 1. A seguito di distruzione delle cellule epiteliali, nefroni hanno una limitata capacità di rigenerarsi, anche se i meccanismi e le limitazioni che guidano questo fenomeno sono ancora poco compresi. In questo articolo video, descriviamo la nostra tecnica di ablazione laser mirato delle...

Ablazione laser del Pronephros Zebrafish allo Studio renale rigenerazione epiteliale

Il metodo qui presentato comprende il pregiudizio preciso di embrioni di zebrafish in diretta con alta energia impulsi laser e la successiva analisi di tali lesioni e il loro recupero con il tempo. Mostriamo anche come geneticamente etichettati singoli o gruppi di cellule muscolari scheletriche possono essere monitorati durante e dopo un danno luce laser indotto.

Laser-lesioni del muscolo scheletrico embrionale Zebrafish

Questo video descrive il metodo per ferire gli assoni negli embrioni di zebrafish utilizzando l'assotomia laser a due fotoni e osservando il recupero assonale da una lesione.

Assotomia laser a due fotoni: un metodo per ferire gli assoni negli embrioni di zebrafish e osservare il recupero assonale

Source: Morsch, M.,  et. al., Triggering Cell Stress and Death utilizzando la microscopia confocale laser UV convenzionale. J. Vis. Exp. (2017) In questo video, esploriamo la tecnica dell'ablazione laser UV ad alta intensità per indirizzare e studiare con precisione i singoli neuroni nel pesce zebra transgenico. Dimostriamo come preparare, immobilizzare e visualizzare le risposte neuronali, evidenziando le dinamiche cellulari della lesione e del recupero.

Ablazione laser selettiva a singolo neurone in una larva di zebrafish utilizzando un microscopio confocale

Fonte: Muto, A., et al. Ablazione di una popolazione neuronale utilizzando un laser a due fotoni e sua valutazione utilizzando l'imaging del calcio e la registrazione comportamentale nelle larve di zebrafish. J. Vis. Exp. (2018) In questo video,  Viene dimostrata una procedura di ablazione laser a due fotoni, che consente la distruzione selettiva dei neuroni fluorescenti in larve di zebrafish immobilizzate con agarosio. L'imaging ad alta risoluzione prima e dopo la procedura conferma...

Ablazione neuronale mirata mediante microscopia a due fotoni in una larava di pesce zebra

Qui, presentiamo un protocollo per l'ablazione di una sottopopolazione geneticamente con etichetta dei neuroni da un laser del due-fotone da larve di Zebrafish.

Ablazione di una popolazione neuronale utilizzando un Laser del due-fotone e sua valutazione usando formazione immagine del calcio e registrazione del comportamento nelle larve di Zebrafish

L'ablazione laser è una tecnologia ampiamente applicabile per lo studio della rigenerazione nei sistemi biologici. Il protocollo presentato descrive l'uso di un microscopio confocale a scansione laser standard per l'ablazione laser e la successiva imaging time-lapse di cellule interneuromast rigeneranti nella linea laterale zebrafish.

Saggio di ablazione e rigenerazione laser a base di microscopio confocale nelle cellule interneuromast zebrafish

Lo sviluppo embrionale richiede una coordinazione su larga scala del movimento cellulare. L'ablazione laser mediata dall'eccitazione a due fotoni consente l'ablazione tridimensionale controllata spazialmente di grandi gruppi di cellule profonde. Inoltre, questa tecnica può sondare la reazione delle cellule che migrano collettivamente in vivo alle perturbazioni nel loro ambiente meccanico.

Ablazioni di volume profonde e controllate spazialmente utilizzando un microscopio a due fotoni nella Zebrafish Gastrula

Presentiamo un protocollo per catturare la dinamica della rigenerazione della pinna caudale larvale del pesce zebra su una scala dell'intero tessuto utilizzando la stereomicroscopia basata sul campo chiaro. Questa tecnica consente di catturare le dinamiche di rigenerazione con la risoluzione di una singola cella. Questa metodologia può essere adattata a qualsiasi stereomicroscopio dotato di una telecamera CCD e di un software time-lapse.

Catturare Tissue Repair in Zebrafish Larve con Time-lapse Brightfield stereomicroscopia

Impara l'ablazione laser a due fotoni di osteoblasti nelle larve di zebrafish per studiare la rigenerazione ossea e il ruolo del sistema immunitario. Questo metodo permette di analizzare i meccanismi cellulari coinvolti nella guarigione.

Ablazione mediata da laser a due fotoni di osteoblasti nello sviluppo di larve di zebrafish

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