Name: Un test tossicologico ed ecotossicologico basato sulla motilità degli emociti delle cozze (Mytilus galloprovincialis) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Scopri un metodo in vitro per valutare la tossicità degli inquinanti analizzando la motilità degli emociti di Mytilus galloprovincialis. Questa tecnica offre un'alternativa etica ai test sui vertebrati per il biomonitoraggio ambientale.

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<ol><li>Di Paolo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioassay+battery+interlaboratory+investigation+of+emerging+contaminants+in+spiked+water+extracts+-+Towards+the+implementation+of+bioanalytical+monitoring+tools+in+water+quality+assessment+and+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Bioassay battery interlaboratory investigation of emerging contaminants in spiked water extracts - Towards the implementation of bioanalytical monitoring tools in water quality assessment and monitoring.</a> Water Res. 104, 473-484 (2016).</li>
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<li>Connon, R. E., Geist, J., Werner, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect-based+tools+for+monitoring+and+predicting+the+ecotoxicological+effects+of+chemicals+in+the+aquatic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Effect-based tools for monitoring and predicting the ecotoxicological effects of chemicals in the aquatic environment.</a> Sensors. 12 (9), 12741-12771 (2012).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>0,2 &micro; m filtro (diametro 25 mm)</td><td>ABLUO&nbsp;</td><td></td><td>materiale da laboratorio</td></tr><tr><td>siringa ipodermica da 2,5 ml needdle 22G</td><td>Rays</td><td>2522CM32</td> materiale <td>da laboratorio</td></tr><tr><td>96 pozzetti in polistirene a fondo piatto trattato TC micropiastra</td><td>Corning</td><td>3916</td><td>materiale da laboratorio</td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>C3881-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Software per strumenti di chemiotassi chimica e migrazione&nbsp;</td><td>(Ibidi GmbH)</td><td></td><td>software</td></tr><tr><td>Cytation 5&nbsp;</td><td>Agilent BioTeck</td><td>Cytation 5</td><td>Apparecchiature: Lettore multimodale per imaging cellulare</td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)&nbsp;</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>472301</td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Tubo Fondo Conico Corning</td><td></td><td>352196</td><td>articoli da laboratorio</td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>B0394</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro chimico a lettura rapida 102</td><td>Biosigma</td><td>BVS100</td><td>materiale da laboratorio</td></tr><tr><td>HEPES (acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazina-etansolfonico)</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>Software H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chemical ImageJ</td><td>Software</td><td>NIH</td><td></td></tr><tr><td>KBr</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>P9881</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merk</td><td>104936</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>G7513</td><td>Aminoacido essenziale per terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>Microscopio chimico</td> <td>M7506</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse E600</td><td>Nikon</td><td></td><td>Attrezzatura: Imaging cellulare&nbsp;</td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Riedel-de Haen</td><td>31481</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>31434-1KG-R</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fluka</td><td>71519 500g</td><td>Chimico</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>S5761-1KG</td><td>Merk</td></tr><tr><td>rosso chimico neutro</td><td>(Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>N4638-1G</td><td>Colorante a cellule vitali</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>P0781-100ML</td><td>Antibiotici per colture cellulari</td></tr><tr><td>SrCl2&middot; 6H2O</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>255521</td><td></td></tr><tr><td>Chimico Trypan blue&nbsp;</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>T8154</td><td>Colorante cellulare</td></tr></tbody></table>

un test tossicologico ed ecotossicologico basato sulla motilità degli emociti delle cozze (mytilus galloprovincialis)

A Toxicological and Ecotoxicological Assay Based on Mussel (Mytilus galloprovincialis) Hemocytes Motility

Lo studio introduce un nuovo metodo in vitro per valutare in modo rapido e sensibile la tossicità e l'ecotossicità degli inquinanti, utilizzando la motilità degli emociti di Mytilus galloprovincialis. La Figura 1A-C mostra l'imaging time-lapse rappresentativo degli emociti dopo 30 minuti di attacco al fondo del pozzetto. Le cellule nella figura sono state colorate con rosso neutro appena prima della valutazione della motilità. I movimenti delle cellule sono stati monitorati utilizzando la microscopia ottica a una velocità di un'immagine al minuto per 10 minuti, con un ingrandimento inferiore a 20x, con un lettore multimodale. La Figura 1A-C mostra tre degli 11 fotogrammi acquisiti dalla stessa regione di interesse (ROI) a 0 min, 5 min e 10 min. Le stesse celle sono numerate in tutte e tre le figure per evidenziare il loro movimento e la numerazione rimane coerente tra le figure per illustrare chiaramente le loro traiettorie.
Le cellule mostrano movimenti unicellulari basati sull'attività dei lamellipodi e sui rapidi cambiamenti di forma. Le cellule sono state etichettate con il colorante vitale rosso neutro per migliorare la loro visualizzazione durante il tracciamento. Il rosso neutro è un colorante cationico anfifilico e debole che può facilmente permeare la membrana cellulare. Una volta all'interno delle cellule, il colorante rimane intrappolato nei lisosomi a causa della protonazione. Gli emociti delle cozze, in particolare i granulociti, mostrano un sistema lisosomiale ben sviluppato; pertanto, sono ben visualizzati mediante colorazione con rosso neutro, con il citoplasma ricco di diversi lisosomi marcati in rosso e il nucleo (non marcato dal colorante) che appare come un foro traslucido.
Attraverso l'applicazione del protocollo, si possono osservare due principali morfotipi di emociti secondo Udayan et al.23: (1) cellule diffuse con una forma di fagiolo bipolare e talvolta un contorno ameboide, e cellule più piccole a forma di stella rotonda (celle n = 3 e 10). In entrambi i tipi di cellule, il movimento era caratterizzato da continui cambiamenti di forma, con continua estensione e retrazione di pseudopodi e filopodi.
L'applicazione del protocollo consente di valutare con successo la motilità degli emociti costruendo grafici di traiettoria, come riportato in Figura 2, e calcolando i principali parametri velocimetrici come la velocità media e l'immediatezza. Questi corrispondevano rispettivamente a 6,46 ± 0,2 μm/min e 0,56 ± 0,02 (SEM medio ±) per le cellule diffuse e a 5,18 ± 0,34 μm/min e 0,37 ± 0,03 per le piccole cellule, rispettivamente in condizioni fisiologiche basali dopo 30 minuti di attacco al fondo del pozzetto. Pertanto, il protocollo consente la classificazione di diverse popolazioni di emociti in base a parametri velocimetrici.
Attraverso l'applicazione del protocollo, è possibile rilevare alterazioni del parametro velocimetrico della motilità degli emociti in seguito all'esposizione a farmaci o inquinanti. La Figura 3A-D mostra i risultati rappresentativi dell'esposizione in vitro degli emociti delle cozze al paracetamolo, che è uno dei farmaci rilasciati nell'ambiente (PiE) con la più alta concentrazione e le più alte frequenze di rilevamento nei fiumi di tutto il mondo31.
Secondo Udayan et al.23, nelle cellule di controllo, è stato osservato un aumento significativo della velocità con il tempo in entrambi i morfotipi cellulari, suggerendo l'attivazione degli emociti durante la coltura di 24 ore, presumibilmente evocativa della risposta infiammatoria indotta sperimentalmente dal ritiro e dalla placcatura nell'ambiente di coltura. Quando le cellule sono state esposte al farmaco, l'attivazione della motilità degli emociti è risultata significativamente ridotta nelle cellule diffuse (Figura 3A) dopo 24 ore, ma non nelle piccole cellule rotonde (Figura 3C), caratterizzate da una velocità basale media inferiore (valutata al tempo 0). Inoltre, il protocollo ha permesso di rilevare alterazioni della traiettoria cellulare in seguito all'esposizione al farmaco, come indicato dall'aumento significativo dell'immediatezza delle piccole cellule dopo 24 ore e dalla diminuzione dell'immediatezza dopo 1 ora di esposizione nelle cellule diffuse (Figura 3C, D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67285/67285fig01.jpg"> 
Figura 1: Imaging time-lapse rappresentativo di emociti neutri colorati in rosso dopo 30 minuti di attaccamento al fondo del pozzetto. Le cellule sono state colorate con il colorante vitale Neutral Red appena prima della valutazione della motilità. I movimenti delle cellule sono stati monitorati utilizzando la microscopia ottica al ritmo di un'immagine al minuto per 10 minuti con un ingrandimento inferiore a 20x. Per brevità, i pannelli A, B e C visualizzano tre degli 11 fotogrammi acquisiti dalla stessa area di interesse (ROI) a 0 min, 5 min e 10 min. Le stesse celle sono numerate in tutte e tre le figure per illustrare il loro movimento e le frecce indicano gli intervalli di tempo. Le barre della scala rappresentano 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67285/67285fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67285/67285fig02.jpg"> 
Figura 2: Grafico rappresentativo della traiettoria degli emociti di M. galloprovincialis . Le traiettorie mostrate provengono da un singolo pozzo. Vengono mostrate le traiettorie di 25 celle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67285/67285fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67285/67285fig03v2.jpg"> 
Figura 3: Effetto dell'esposizione al paracetamolo (24 ore) sulla velocità e l'immediatezza delle cellule di diffusione (A,B) e delle piccole cellule rotonde a forma di stella (C,D). I dati sono espressi come media ± SEM. La significatività statistica dei dati è stata valutata mediante ANOVA unidirezionale e post-test di Tukey. *P &lt; 0,05 rispetto a controllo (p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67285/67285fig03largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Un test tossicologico ed ecotossicologico basato sulla motilità degli emociti delle cozze (Mytilus galloprovincialis)

Hemocytes are the circulating immune-competent cells in bivalve mollusks and play a key role in several important functions of cell-mediated innate ...

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