Name: Estrazione in ununica fase e analisi zimografica delle gelatinasi batteriche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Scopri un metodo semplificato per estrarre e caratterizzare le gelatinasi attive da Leptospira utilizzando la zimografia. Questa tecnica consente di confermare l'attività enzimatica e superare le sfide dell'isolamento delle proteine di membrana batteriche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Yue, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Glaucoma%22%5BJournal%5D)">Biology of the extracellular matrix.</a> J Glaucoma. 23 (8 Suppl 1), S20-S23 (2014).</li>
<li>Cabral-Pacheco, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The roles of matrix metalloproteinases and their inhibitors in human diseases.</a> Int J Mol Sci. 21 (24), 1-53 (2020).</li>
<li>Ambili, M., Jayasree, K., Sudhakaran, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((60K+gelatinase+involved+in+mammary+gland+involution+is+regulated+by+%CE%B2-oestradiol%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">60K gelatinase involved in mammary gland involution is regulated by β-oestradiol.</a> Biochim Biophys Acta. 1403 (3), 219-231 (1998).</li>
<li>Zhang, Y. -Z., Ran, L. -Y., Li, C. -Y., Chen, X. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+structures%2C+and+collagen-degrading+mechanisms+of+bacterial+collagenolytic+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diversity, structures, and collagen-degrading mechanisms of bacterial collagenolytic proteases.</a> Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6098-6107 (2015).</li>
<li>Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+collagenases+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial collagenases - A review.</a> Crit Rev Microbiol. 42 (1), 106-126 (2016).</li>
<li>Madathiparambil, M. G., Cattavarayane, S., Perumana, S. R., Manickam, G. D., Sehgal, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+46+kDa+gelatinase+on+the+outer+membrane+of+Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Presence of 46 kDa gelatinase on the outer membrane of Leptospira.</a> Curr Microbiol. 62 (5), 1478-1482 (2011).</li>
<li>Kramer, R. A., Zandwijken, D., Egmond, M. R., Dekker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+folding%2C+purification+and+characterization+of+Escherichia+coli+outer+membrane+protease+OmpT%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">In vitro folding, purification and characterization of Escherichia coli outer membrane protease OmpT.</a> Eur J Biochem. 267 (3), 885-893 (2000).</li>
<li>Kum, S. L., Ho, J. C. S., Parikh, A. N., Liedberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+membrane+environments+regulate+enzymatic+behaviors+of+Salmonella+outer+membrane+protease%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Bio+Med+Chem+Au%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic membrane environments regulate enzymatic behaviors of Salmonella outer membrane protease.</a> ACS Bio Med Chem Au. 2 (1), 73-83 (2022).</li>
<li>Sarma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+proteome+analysis+shows+the+abundance+of+histidine+kinase+sensor+protein%2C+DNA+helicase%2C+putative+lipoprotein+containing+peptidase+M75+domain+and+peptidase+C39+domain+protein+in+Leptospira+interrogans+grown+in+EMJH+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Extracellular proteome analysis shows the abundance of histidine kinase sensor protein, DNA helicase, putative lipoprotein containing peptidase M75 domain and peptidase C39 domain protein in Leptospira interrogans grown in EMJH medium.</a> Pathogens. 10 (7), 852(2021).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li>
<li>Levy, D., Gulik, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+vesicle+solubilization+and+reconstitution+by+detergents.+Symmetrical+analysis+of+the+two+processes+using+octaethylene+glycol+mono-n-dodecyl+ether%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phospholipid vesicle solubilization and reconstitution by detergents. Symmetrical analysis of the two processes using octaethylene glycol mono-n-dodecyl ether.</a> Biochemistry. 29 (40), 9480-9488 (1990).</li>
<li>Lichtenberg, D., Ahyayauch, H., Alonso, A., Goñi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent+solubilization+of+lipid+bilayers%3A+a+balance+of+driving+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Detergent solubilization of lipid bilayers: a balance of driving forces.</a> Trends Biochem Sci. 38 (2), 85-93 (2013).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Zeug, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+microscopic+methods+for+the+neural+ECM+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Current microscopic methods for the neural ECM analysis.</a> Prog Brain Res. 214, 287-312 (2014).</li>
<li>Madathiparambil, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zymography+analysis+of+proteinase+activity+present+in+Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A zymography analysis of proteinase activity present in Leptospira.</a> Curr Microbiol. 62 (3), 917-922 (2011).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>acido 6-amminocaproico</td><td>Merck</td><td>Codice: A2504</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; 695092</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; 32201</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamide</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; A-3553</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; A-3678</td><td></td></tr><tr><td>Bis Acrilammide</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; Codice: M7279</td><td></td></tr><tr><td>Frazione V dell'albumina sierica bovina (BSA)</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; A-8022</td><td></td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; B-8026</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>Visualizzazione del materiale C4901</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie blu brillante</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>1.12553</td><td></td></tr><tr><td>Desossicolato</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Ellinghausen&ndash; McCullough&ndash; Johnson&ndash; Harris (EMJH) medio, Difco</td><td>&nbsp; Difco</td><td>&nbsp; 279410</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Merck</td><td>G9382</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Merck</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Glicina G8790</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; G-8898</td><td></td></tr><tr><td>Leptospira interrogans sierovariante Copenhageni ceppo Fiocruz L1-130 (ATCC BAA-1198)&nbsp;, conservato nel biorepository dell'ICMR-RMRC Portblair</td><td>Conservato nel biorepository dell'ICMR-RMRC Port Blair</td><td></td><td>Temperatura di crescita ottimale 30 gradi C</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio M8266</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; Codice: M8266</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; 17995-7</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>P4417&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Strumento di separazione delle piastre</td><td>Meraviglia Wedgle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotore</td><td>Termoscientifico</td><td>FIBERLite F15 8x50 cy</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil solfato di sodio (SDS)</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; L-4396</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; T-9281</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Base Trizma (TRIS)&nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; Codice: T6066</td><td></td></tr></tbody></table>

estrazione in un'unica fase e analisi zimografica delle gelatinasi batteriche

One-step Extraction and Zymographic Analysis of Bacterial Gelatinases

Il risultato mostra lo zimogramma delle proteine leptospirali e delle gelatinasi del siero umano. I risultati, mostrati nella Figura 1, rappresentano le proteasi come bande bianche chiare su sfondo blu. Le bande rappresentano le aree in cui la gelatina copolimerizzata è degradata e quindi non colorata, mentre altre aree dell'intero gel sono colorate di blu a causa della presenza di gelatina. Inoltre, mostra che, anche se la gelatina è anche una proteina, non viene eluita nell'elettroforesi a...

Estrazione in un'unica fase e analisi zimografica delle gelatinasi batteriche

Proteinases of pathogenic bacteria contribute to invasion and pathogenesis by actively degrading the host's extracellular matrix (ECM) components and ...

one-step-extraction-and-zymographic-analysis-of-bacterial-gelatinases

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

Questo protocollo descrive una basata sulle attività di analisi per la rilevazione di metalloproteinasi della matrice in sovranatanti o fluidi corporei.

Rilevamento delle metalloproteinasi della matrice funzionale di zimografia

Un straight-forward insieme di metodi per isolare e determinare l'identità delle proteine ​​più abbondanti espresse nel muscolo scheletrico. Circa 800 punti sono discernimento su un gel bidimensionale da 10 mg muscolare, che ci permette per la determinazione del sesso-specifico l'espressione della proteina. Questi metodi forniscono risultati equivalenti nella maggior parte dei tessuti.

Sesso Dimorfismo muscolo scheletrico da Proteomica

Abbiamo recentemente riportato un nuovo approccio per generare sonde DNAzyme fluorogenici che possono essere applicati per impostare un semplice, "mix-e-leggere" test di fluorescenza per la rilevazione batterica. Queste sonde di DNA specifiche catalizzare il clivaggio di un cromoforo-modificato DNA-RNA chimerico substrato in presenza della miscela grezza extracellulare (CEM) prodotta da un batterio specifico, così traducendo rilevamento batterica nella generazione del segnale di fluorescenza.

Rilevazione di batteri utilizzando DNAzimi fluorogenici

Descriviamo il metodo di prototipo per la produzione di vetrini al microscopio a fluorescenza rivestite con gelatina per la visualizzazione invadopodia-mediata degradazione della matrice. Tecniche di calcolo utilizzando il software disponibile sono presentati per quantificare i livelli risultanti di proteolisi matrice di singole cellule all'interno di una popolazione mista e per gruppi multicellulari che comprende interi campi microscopici.

Misurazione quantitativa della Invadopodia-mediata proteolisi della matrice extracellulare in singoli contesti e pluricellulari

In questo video, eseguiamo la zimografia, una tecnica elettroforetica, per analizzare l'attività proteolitica all'interno di campioni biologici.

Zimografia peptidica fluorescente: una tecnica modificata per rilevare l'attività della proteasi utilizzando substrati fluorogenici in gel per zimogrammi

Questo video mostra la tecnica di elettroforesi su gel per zimografia per valutare l'attività delle metalloproteinasi della matrice (MMP) presenti nel surnatante di coltura cellulare. Le MMP attive degradano il substrato specifico per MMP incorporato in un gel di poliacrilammide, che appare come bande chiare su uno sfondo macchiato scuro dopo la colorazione.

Elettroforesi su gel per zimografia: una tecnica elettroforetica per rilevare le metalloproteinasi della matrice valutando l'attività enzimatica

I membri del genere Burkholderia sono patogeni di importanza clinica. Noi descriviamo un metodo per l'estrazione delle proteine ​​totali batterica, utilizzando distruzione meccanica, e elettroforesi su gel 2-D per la successiva analisi proteomica.

Totale Estrazione di proteine ​​e 2-D elettroforesi su gel Metodi per<em&gt; Burkholderia</em&gt; Specie

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per una tecnica di zymographic modificate in cui peptidi fluorescenti vengono utilizzati come substrato degradabile al posto di proteine native. L'elettroforesi dei campioni biologici in zymograms peptide fluorescente consente il rilevamento di una vasta gamma delle proteasi che tecniche zymographic precedenti.

Rilevazione di attività di proteasi dallo Zymography Peptide fluorescente

Gli analoghi del trealosio stanno emergendo come molecole importanti per applicazioni bio(tecno)logiche e biomediche. Descriviamo un protocollo ottimizzato per la sintesi enzimatica e la purificazione degli analoghi del trealosio che è semplice, efficiente, veloce e rispettoso dell'ambiente. Viene dimostrata la sua applicazione alla rapida produzione e somministrazione di una sonda per la rilevazione di micobatteri.

Rapid One-step enzimatica Sintesi e All-acquosa Purificazione di trealosio analoghi

La composizione proteica della valvola mitrale umana è ancora parzialmente sconosciuta, perché la sua analisi è complicata da basse cellularità e quindi da bassa biosintesi proteica. Questo lavoro fornisce un protocollo per estrarre efficacemente proteine ​​per l'analisi della proteoma della valvola mitrale.

Protocollo ottimizzato per l&#39;estrazione delle proteine ​​dalla valvola mitrale umana

Scopri un metodo semplificato per estrarre e caratterizzare le gelatinasi attive da Leptospira utilizzando la zimografia. Questa tecnica consente di confermare l'attività enzimatica e superare le sfide dell'isolamento delle proteine di membrana batteriche.

Estrazione in un'unica fase e analisi zimografica delle gelatinasi batteriche

Esplora altri video