Name: Delezione genica mediata da CRISPR-Cas9 in cellule staminali pluripotenti umane coltivate in condizioni prive di alimentatore (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 21 s
Description: Scopri la delezione genica mediata da CRISPR-Cas9 in cellule staminali pluripotenti umane H9 coltivate in condizioni prive di alimentatore. Questo metodo consente knockout stabili senza compromettere la pluripotenza e il potenziale differenziativo.

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<ol><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
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<li>Smith, C., Gore, A., Yan, W., Abalde-Atristain, L., Li, Z., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+sequencing+analysis+reveals+high+specificity+of+CRISPR%2FCas9+and+TALEN-based+genome+editing+in+human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-genome sequencing analysis reveals high specificity of CRISPR/Cas9 and TALEN-based genome editing in human iPSCs.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 12-13 (2014).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>2-MERCAPTOETANOLO&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>38,5 mL, sterile + certificato libero Open-Top Provette ultratrasparenti</td><td>Coulter Beckman</td><td>C14292</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Tecnologie delle cellule staminali</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>bFGF Invitrogen umano ricombinante</td><td></td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Corpo monoclonale di coniglio</td><td>Abclonale</td><td>A5078</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI-v2</td><td>NEB</td><td>R0739S</td><td></td></tr><tr><td>chir99021</td><td>Tocris</td><td>4423/10</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matrice di membrana basale, senza LDEV</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Ciclopamina</td><td>Tecnologie delle cellule staminali</td><td>72074</td><td></td></tr><tr><td>Terreni DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>DMEM MIX DI NUTRIENTI F12&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DPBS senza: Ca e Mg</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FoxA2/HNF3&beta; &nbsp;</td><td>CST</td><td>8186</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) Anticorpo mAb di coniglio</td><td>CST</td><td>2118S</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di dissociazione cellulare delicata</td><td>Tecnologie delle cellule staminali</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Aminoacidi non essenziali (NEAA) 100x Soluzione</td><td>GE healthcare</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 (D3B5) Coniglio mAb</td><td>CST</td><td>9129</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Siero di ricambio</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L GLUTAMMINA, 100x</td><td>Invitrogen</td><td>2924190090</td><td></td></tr><tr><td>L2H-BMSBSP-F1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG</td></tr><tr><td>L2HGDH Anticorpo policlonale</td><td>Proteintech</td><td>15707-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA1-F</td><td>Macrogen</td><td></td><td>CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA1-R</td><td>Macrogen</td><td></td><td>AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA2-F</td><td>Macrogen</td><td></td><td>CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA2-R</td><td>Macrogen</td><td></td><td>AAACCCGGCGAA AAGCCCGGGGC</td></tr><tr><td>L2H-SeqF1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG</td></tr><tr><td>L2H-SeqR1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG</td></tr><tr><td>L2H-UMSBSP-R1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG</td></tr><tr><td>LentiCRISPRv2</td><td>Addgene</td><td>52961</td><td></td></tr><tr><td>mTesR1 terreno completo</td><td>Tecnologie delle cellule staminali</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Nanog Antibody</td><td>CST</td><td>3580</td><td></td></tr><tr><td>NEUROBASAL MEDIUM 1x CTS</td><td>Invitrogen</td><td>A1371201</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 2 Integratore 100x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-11050</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 27 Integratore 50x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-07200</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4 Anticorpo</td><td>CST</td><td>2750</td><td></td></tr><tr><td>Pax6 (D3A9V) XP Coniglio mAb</td><td>CST</td><td>60433</td><td></td></tr><tr><td>PENICILLINA STREPTOMICINA SOL</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Reagente per l'infezione da polibrene</td><td>Sigma</td><td>TR1003- G</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimmina, ramificata</td><td>Sigma</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2.0</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Kit per titoli Lentivirus Abm</td><td></td><td>LV900</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della roccia Y-27632 dicloridrato&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614/10</td><td></td></tr><tr><td>Sox2 Anticorpo</td><td>CST</td><td>2748</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>TRIPSINA .05% EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>U6-459F</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GAGGGCCTATT TCCCATGATTC</td></tr><tr><td>Wizard Kit di purificazione del DNA genomico</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>XAV 939</td><td>Tocris</td><td>3748/10</td><td></td></tr></tbody></table>

delezione genica mediata da crispr-cas9 in cellule staminali pluripotenti umane coltivate in condizioni prive di alimentatore

CRISPR-Cas9 Mediated Gene Deletion in Human Pluripotent Stem Cells Cultured Under Feeder-Free Conditions

Clonaggio di sgRNA L2HGDH in lentiCRISPRv2 puro Il vettore puro lentiCRISPRv2 è stato ottenuto commercialmente (vedi Tabella dei materiali) e digerito con BsmB1, che ha portato al rilascio di un frammento di stuffer da 1,8 Kb. Come mostrato nella Figura 2A, è stata osservata una digestione completa del vettore. Per ogni costrutto, sei cloni sono stati sottoposti a screening per verificare la presenza o l'assenza di inserto utilizzando una sequenza di sgRNA inversa come primer e un primer diretto (U6-459F) dall'interno della sequenza vettoriale. Utilizzando questo approccio, solo i cloni che avevano l'inserto hanno prodotto un prodotto PCR di 288 bp e i cloni negativi che non contenevano la sequenza inversa di sgRNA non hanno prodotto alcun prodotto PCR, come mostrato nella Figura 2B.
Infezioni da H9, selezioni stabili e Western blot Le hESC sono state infettate con particelle lentivirali che esprimono due diversi sgRNA che hanno come bersaglio l'esone 1 del gene L2HGDH e selezionate con puromicina. L'analisi del western blot è stata eseguita da popolazioni eterogenee di cellule sgRNA e Cas9 stabilmente co-esprimenti per stabilire quale dei due sgRNA utilizzati fosse più efficiente nell'indurre la delezione genica. Come mostrato nella Figura 3A, L2HGDH-sgRNA-1 è risultato più efficiente dell'altra sequenza nel ridurre l'espressione di L2HGDH in popolazioni cellulari eterogenee.
Selezione clonale, espansione e analisi delle proteine La selezione di singole cellule e l'espansione clonale sono state effettuate per le cellule che esprimono L2HGDH-sgRNA-1. I pozzetti che hanno prodotto singoli cloni sono stati contrassegnati e cresciuti fino a raggiungere una dimensione sufficiente per consentire alle colonie (di solito 2 settimane) di espandersi ulteriormente, crioconservare e analizzare (Figura 3B). Un totale di 22 cloni sono stati analizzati utilizzando l'analisi Western blot, che ha prodotto cinque knockout omozigoti (23%) per L2HGDH. Questo risultato mostra un'elevata efficienza del knockout genico utilizzando la consegna genica mediata da lentivirali per una co-espressione stabile di sgRNA e Cas9 da una singola cassetta. La Figura 4 mostra un'analisi Western blot dei cinque cloni knockout omozigoti insieme alle cellule di controllo, mostrando un'espressione ridotta del 100% rispetto al controllo nei cloni selezionati.
Analisi a livello del DNA Al fine di mappare il sito di mutazione CRISPR a monte della sequenza di riconoscimento PAM di Cas9, è stata eseguita la reazione a catena della polimerasi basata su primer specifici basati su siti di mutazione (MS-BSP PCR) utilizzando DNA genomico da cellule di controllo e da cinque diversi cloni. Come mostrato nella Figura 5, due cloni (A5 e B4) hanno mutazioni immediatamente vicine alla sequenza di riconoscimento della PAM, mentre gli altri tre cloni (A1, A9 e B12) hanno mostrato che la mutazione potrebbe non essere molto vicina al sito PAM ed è più a monte della sequenza di sgRNA da 20bp all'interno dell'esone 1 del gene L2HGDH .
Al fine di trovare le mutazioni esatte nel DNA, i prodotti di PCR purificati da cellule di controllo (H9 infettato solo dal vettore) e tre diversi cloni CRISPR, A5, A1 e B4, sono stati sottoposti a sequenziamento Sanger e i siti di mutazione sono stati mappati utilizzando lo strumento di allineamento multiplo clustalw a monte del sitoPAM 8. I risultati hanno rivelato una mutazione di delezione nel clone A5 a monte del sito PAM. Gli altri due cloni, A1 e B4, hanno mostrato mutazioni inserzionali a monte del sito PAM, come evidenziato nella Figura 6.
Analisi funzionale dei cloni Dopo la generazione di linee cellulari knockout CRISPR nelle hESC, il passo successivo è confermare la loro pluripotenza e il loro potenziale di differenziazione. A tale scopo, abbiamo testato diversi marcatori di pluripotenza per tre diversi cloni, A1, A5 e B4, e abbiamo confrontato i risultati con le cellule di controllo (H9 infettate solo da vettori). I risultati non hanno mostrato alcun cambiamento nel potenziale di pluripotenza delle linee cellulari knockout come determinato dall'immunocolorazione per i marcatori OCT4, NANOG e SOX2. Successivamente, le linee cellulari di controllo e knockout sono state colorate anche per il marcatore di proliferazione cellulare, KI67, che non ha mostrato alcun cambiamento nelle linee cellulari knockout rispetto al controllo. Questi risultati mostrano che il knockout CRISPR non ha influenzato le proprietà di autorinnovamento di queste cellule. Inoltre, anche l'EB e la formazione di colonie non sono state influenzate (Figura 7). Utilizzando metodi in vitro stabiliti nel nostro laboratorio, tutti i cloni sono stati differenziati con successo in tre cellule dello strato germinale, come confermato dall'immunocolorazione per PAX6 (marcatore del neuroectoderma), Brachyury (marcatore del mesoderma) e FOXA2 (marcatore dell'endoderma). Non è stato osservato alcun cambiamento nel potenziale di differenziazione delle linee cellulari knockout rispetto alle cellule di controllo, il che ha dimostrato che le cellule knockout hanno mantenuto il loro potenziale di differenziazione (Figura 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig01.jpg"> 
Figura 1: Diagramma schematico che mostra il disegno dello studio in 5 fasi. Fase 1: Progettazione e clonazione di sgRNA nel vettore CRISPR V2 digerito Bsmb1. Fase 2: Generazione di particelle lentivirali utilizzando il vettore di ingresso che trasporta l'sgRNA insieme ai plasmidi di imballaggio mediante co-trasfezione delle cellule HEK293T utilizzando polifezioni e concentrazione virale mediante ultracentrifugazione. Fase 3: Infezione delle hESC utilizzando particelle lentivirali con MOI di 10-20 e selezione cellulare stabile utilizzando la puromicina seguita da analisi di popolazioni cellulari eterogenee per vedere l'efficienza degli sgRNA. Fase 4: Clonazione di singole cellule mediante metodo di diluizione limitante dalle cellule che hanno mostrato il massimo knockdown in popolazioni eterogenee e selezione di singoli cloni. Fase 5: Espansione di singoli cloni e analisi a livello di DNA, proteine e analisi funzionale dei cloni per la staminalità e il potenziale di differenziazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig02.jpg"> 
Figura 2: Clonaggio di sgRNA nel vettore lentiCRISPR V2.puro. (A) Digestione del vettore lentiCRISPR V2.puro con l'enzima di restrizione BsmB1. La freccia indica un frammento di insaccatrice di 1,8 Kb rilasciato dopo la digestione del vettore. (B) Analisi PCR di colonie per diversi cloni di costrutti 1 e 2 di sgRNA L2HGDH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig03.jpg"> 
Figura 3: Western blot e propagazione clonale mediante selezione di singole cellule. (A) Analisi Western blot da due diverse repliche biologiche (S1 e S2) di popolazioni eterogenee di sgRNA (L2H-1 e L2H-2) e Cas9 stabilmente co-esprimenti insieme a hESCs H9 di controllo (C). (B) Selezione di singole cellule ed espansione clonale di cellule H9 che esprimono stabilmente L2HGDH-sgRNA-1. Le frecce indicano pozzetti di piastre a 96 pozzetti che mostrano solo singoli cloni. Barra della scala = 100 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig04.jpg"> 
Figura 4: Analisi del Western blot da diversi cloni di H9. (A-C) L'analisi del Western blot da lisati cellulari totali di 22 cloni ha prodotto cinque knockout omozigoti (23%) per L2HGDH. (D) Conferma dei knockout per L2HGDH da un diverso esperimento di replicazione biologica utilizzando Western blot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig05.jpg"> 
Figura 5: Analisi PCR MSBSP di diversi cloni di H9. (A) Analisi della sequenza dell'esone 1 di L2HGDH utilizzato per l'analisi MSBSP PCR. (B) Ottimizzazione della temperatura di ricottura per l'analisi MSBSP PCR utilizzando il controllo e il clone H9 V2 L2HGDH KO B4. A 96,8, il controllo mostra una banda, ma B4 non mostra una banda, come mostrato dalle frecce. (C) L'analisi di tutti i cloni KO omozigoti ha portato alla seguente mappatura del sito di mutazione all'interno dell'esone 1. A1 = In/Del non vicino al sito PAM; A5 = In/Del vicino al sito PAM; A9 = In/Del Abbastanza vicino al sito PAM; B4 = In/Del Molto vicino al sito PAM B12 = In/Del non vicino al sito PAM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig06.jpg"> 
Figura 6: Allineamento dei prodotti PCR sequenziati Sanger con la sequenza di riferimento dell'esone 1 L2HGDH . Sono stati eseguiti allineamenti multipli di prodotti PCR sequenziati con Sanger da A1, A5 e B4 e cellule di controllo insieme a una sequenza di riferimento all'interno del primo esone di L2HGDH dal database NCBI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig07.jpg"> 
Figura 7: Caratterizzazione funzionale di linee cellulari knockout per CRISPR. (A) Le cellule sono state immunocolorate per marcatori di pluripotenza (OCT4, NANOG, SOX2), autorinnovamento (KI67), EB e formazione di colonie rispetto alle hESC H9 infettate dal controllo. Barre della scala: 100 μM. (B) La percentuale di cellule che esprimono positivamente (+ve) è stata calcolata rispetto alla colorazione DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig08.jpg"> 
Figura 8: Potenziale di differenziazione di linee cellulari knockout per CRISPR. Caratterizzazione funzionale di linee cellulari knockout CRISPR in termini di potenziale differenziativo utilizzando marcatori per PAX6 (neuroectoderma), Brachiuria (mesoderma) e FOXA2 (endoderma) rispetto alle cellule H9 infettate dal controllo. Barre di scala: 100 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig08large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Passaggio del protocollo</td>
			<td>Tempo necessario</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clonaggio di sgRNA in LentiCRISPRv2</td>
			<td>4 giorni</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Produzione di lentivirus e determinazione del titolo</td>
			<td>5 giorni</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infezioni da hESC, selezioni cellulari stabili ed espansione</td>
			<td>2 settimane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selezione clonale a singola cellula ed espansione</td>
			<td>2 settimane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analisi funzionale dei cloni</td>
			<td>2 settimane</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Sequenza temporale per i passaggi del protocollo e tempo stimato richiesto.

Delezione genica mediata da CRISPR-Cas9 in cellule staminali pluripotenti umane coltivate in condizioni prive di alimentatore

The CRISPR-Cas9 system for genome editing has revolutionized gene function studies in mammalian cells, including stem cells. However, the practical ...

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Descriviamo un protocollo per la derivazione di cellule staminali pluripotenti umane indotte prive di fattori riprogrammate e caratterizzate su base lentivirale e la conversione in condizioni cliniche putative.

Derivazione e caratterizzazione di un free-Transgene umana indotta pluripotenti staminali Cell Line e Conversione in definite condizioni clinico-grade

La convalida sperimentale dell'attività dell'enhancer è meglio affrontata dall'analisi della perdita di funzione. Viene presentato un protocollo efficiente che utilizza la delezione mediata da CRISPR/Cas9 per studiare la regolazione allele-specifica della trascrizione genica nelle cellule ES F1 che contengono un genoma ibrido (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Generazione CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic eliminazioni per studiare la funzione Enhancer nel topo cellule staminali embrionali

L'editing del genoma delle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) può essere fatto in modo rapido ed efficiente. Qui viene presentata una robusta procedura sperimentale per l'ingegneria genetica delle hPSC, come esemplificato dalla modifica del locus safe harbor AAVS1 per esprimere EGFP e introdurre resistenza agli antibiotici.

Istituzione di Genome-cura pluripotenti umane Linee di cellule staminali: Da Targeting per isolamento

Protocolli per generare linee mutanti HPSC che utilizzano la piattaforma iCRISPR e di differenziare hPSCs in cellule beta-come il glucosio-reattiva sono descritti. La combinazione di tecnologia di editing genoma con differenziazione HPSC-diretto fornisce una piattaforma potente per l'analisi sistematica del ruolo dei determinanti lignaggio nello sviluppo umano e la progressione della malattia.

Genome Editing e di differenziazione Regia di hPSCs per interrogare determinanti Lineage in Sviluppo Umano del pancreas

Questo protocollo descrive in dettaglio la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte privo di impronta (iPSCs) da cellule pancreatiche umane in condizioni prive di alimentatore, seguito da editing con CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine e caratterizzazione del modificati cloni unicellulari.

Efficiente generazione e la modifica di IPSCs privo di alimentatore da cellule pancreatiche umane utilizzando il sistema di CRISPR-Cas9

Un protocollo per la veloce rottura CRISPR/Cas9-mediata del gene nel topo ed emopoietici umani primari è descritto in questo articolo. Cas9-sgRNA ribonucleoproteine vengono introdotti tramite elettroporazione con sgRNAs generato tramite trascrizione in vitro e commerciale Cas9. Alta efficienza di editing si ottiene con tempo limitato e costi finanziari.

Rottura del Gene altamente efficiente di cellule progenitrici ematopoietiche Murine ed umane di CRISPR/Cas9

Descritto qui è un protocollo per l'etichettatura in modo endogeno espresse proteine con tag fluorescente in cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando CRISPR/Cas9. Celle putativamente modificate sono arricchite da ordinamento di attivate la fluorescenza delle cellule e linee clonali della cellula vengono generate.

Proteina endogena Tagging in umani hanno indotto le cellule staminali pluripotenti utilizzando CRISPR/Cas9

Questo protocollo fornisce un metodo per facilitare la generazione di cambiamenti di nucleotidi eterozio o omozigo utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane.

Generazione di modifiche genomiche definite utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane

Qui, descriviamo un metodo dettagliato per l'editing genetico senza soluzione di continuità nelle cellule staminali pluripotenti umane utilizzando un plasmide donatore basato su piggyBac e il mutante nickase Cas9. Due mutazioni puntiformi sono state introdotte nell'esone 8 del locus del fattore nucleare 4 alfa (HNF4α) degli epatociti nelle cellule staminali embrionali umane (hESC).

Introduzione di mutazioni puntiformi nelle cellule staminali pluripotenti umane utilizzando l'editing del genoma senza soluzione di continuità

Il protocollo seguente fornisce istruzioni per l'adattamento umano staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule di alimentazione priva di cultura con completo alimentatore-Free siero sostituzione KnockOut medio (KSR-FF). Una volta adattato, istruzioni per la manutenzione costante sono anche previste.

Alimentatore-Free adattamento, la cultura e Passaging di cellule IPS utilizzando Completa alimentatore-Free siero sostituzione KnockOut Media

Scopri la delezione genica mediata da CRISPR-Cas9 in cellule staminali pluripotenti umane H9 coltivate in condizioni prive di alimentatore. Questo metodo consente knockout stabili senza compromettere la pluripotenza e il potenziale differenziativo.

Delezione genica mediata da CRISPR-Cas9 in cellule staminali pluripotenti umane coltivate in condizioni prive di alimentatore

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