Name: Radici avventizie di pioppo indotte da patogeni del cancro del fusto: un sistema sperimentale per lo studio della biologia delle radici e dei processi correlati alla risposta alla luce (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Scopri un protocollo per indurre radici avventizie nel pioppo mediante inoculazione di patogeni fungini attraverso il floema o l'epidermide. Questo metodo sperimentale permette di studiare la biologia delle radici e le risposte fisiologiche alla luce.

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<meta charset="utf8"></head><body>Studio dell'impatto dei patogeni fungini sul cancro del fusto di pioppo e sul trasporto vascolare

<ol><li>Xing, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+pathogens+of+canker+disease+trigger+canopy+dieback+in+poplar+saplings+by+inducing+functional+failure+of+the+phloem+and+cambium+and+carbon+starvation+in+the+xylem%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Mol+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Fungal pathogens of canker disease trigger canopy dieback in poplar saplings by inducing functional failure of the phloem and cambium and carbon starvation in the xylem.</a> Physiol Mol Plant Pathol. 101523, 112(2020).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Distretto di Solarbio</td><td>A8190&nbsp; &nbsp;</td><td>Fornire nutrimento per la crescita dei funghi</td></tr><tr><td>Alluminio</td><td>Biosharp</td><td>BS-QT-027B</td><td>Per fornire ombreggiatura all'area infetta</td></tr><tr><td>Coltello da cintura</td><td>MoGong Aziende di strumenti hardware</td><td></td><td>Cingere l'epidermide di steli/rami di pioppo</td></tr><tr><td>Nastro da innesto</td><td>CAPI</td><td>5 cm</td><td>Per fissare i funghi sulle piante</td></tr><tr><td>PD (Estrazione di patate, destrosio)&nbsp;</td><td>Distretto di Solarbio</td><td>P7360</td><td>Fornire nutrimento per la crescita dei funghi</td></tr><tr><td>Film plastico PE</td><td>MiaoJie</td><td>413703</td><td>Per fissare i funghi sulle piante</td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>Bkman biologico Co., Ltd</td><td>90 millimetri</td><td>Preparare il terreno PDA</td></tr><tr><td>Incubatrice termostatica</td><td>Shanghai Kuntian Laboratory Instrument Co., Ltd</td><td>KTD-6000</td><td>Fornire un ambiente per la crescita dei funghi</td></tr></tbody></table>

radici avventizie di pioppo indotte da patogeni del cancro del fusto: un sistema sperimentale per lo studio della biologia delle radici e dei processi correlati alla risposta alla luce

Poplar Adventitious Roots Induced by Stem Canker Pathogens: An Experimental System for Studying Roots Biology and Light Response-Related Processes

Il flusso di lavoro dei patogeni del cancro del fusto che inducono radici avventizie attraverso l'inoculazione del cingolo è mostrato nella Figura 1. Gli esperimenti condotti qui hanno dimostrato che sia i patogeni del cancro del fusto, V. sordida, B. dothidea, sia i loro isolati (provenienti da diversi ospiti, regioni o patogenicità) possono indurre la formazione di AR nelle specie di pioppo. In questo protocollo, abbiamo utilizzato l'isolato di V. sordida CZC, CFCC86775 e gli isolati di B. dothidea SD50 e SD81 per produrre AR in P. alba var. V sodida Il CZC è un tipico agente patogeno utilizzato ed è stato depositato nel China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC 40575); V. sordida isolato CFCC86775 è stato acquistato dal China Forestry Culture Collection Center, mentre due isolati SD sono stati raccolti dai pioppi della malattia del cancro nella provincia di Shandong e depositati nel nostro laboratorio. Come mostrato nella Figura 2, il callo si è formato sulla regione del cingolo (Figura 2A, pannello 1) e pochi AR si sono formati durante la doratura e il trattamento di rimozione del cambio (Figura 2A, pannello 2), mentre il rosso, molte radici fibrose sono state prodotte dopo il trattamento di inoculazione del floema (Figura 2A, pannelli 3-6). Abbiamo anche osservato che gli AR sono stati indotti in diverse specie o cloni di pioppo, come P. alba var. pyramidalis, Populus × beijingensis, P. alba × P. tremula var. glandulosa clone 84K, P. euramericana cv. 'Bofeng 3', o altri pioppi ibridi). Tuttavia, in questo protocollo, gli AR sono prodotti solo sugli steli di P. alba var. pyramidalis di 1 anno. Infine, come mostrato nella Figura 2 pannello 7, le strutture ARs sono state indotte anche nei tronchi di P . alba var. pyramidalis di 6 anni dopo l'inoculazione floematica da parte del patogeno V. sordida. I diametri del tronco di pioppo si aggirano intorno ai 6-7 cm e la lunghezza delle radici fibrose più lunghe era superiore a 7,0 cm.
Come mostrato nella Figura 2, i segmenti rossi sono stati prodotti negli AR di pioppo ombreggiante dopo essere stati esposti alla luce solare, dagli AR bianchi lattiginosi o rosso chiaro prodotti sui pioppi avvolti in fogli di alluminio (Figura 2B, pannello 1) agli AR rossi 3 giorni dopo (Figura 2B, pannello 4). Inoltre, abbiamo anche notato che i pigmenti rossi sono stati prodotti in un breve periodo dopo l'esposizione alla luce, e l'analisi dell'espressione genica ha dimostrato che la biosintesi dei pigmenti (principalmente cianidina-3-O-glucoside) è stata trasformata direttamente dai loro substrati di antocianidine, non la nuova biosintesi dall'inizio della via metabolica del fenilpropano6.
In questo protocollo, entrambi i due metodi di cingimento (floema e cingimento dell'epidermide) possono indurre la formazione di AR sugli steli di pioppo dopo l'inoculazione del patogeno. Si sono verificati meno frangivento e meno influenza sulla fisiologia (come il trasporto di acqua e carboidrati) nei pioppi inoculati con cinture di epidermide; tuttavia, sembra che la produzione di AR sia un po' veloce ed efficiente nella cintura del floema. Pertanto, il metodo di inoculazione del cingolo floematico è raccomandato nella ricerca di AR di pioppo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67304/67304fig01.jpg"> 
Figura 1: Il flusso di lavoro schematico della formazione di radici avventizie (AR) indotta dal patogeno del cancro dello stelo attraverso metodi di inoculazione della cintura nei pioppi. In primo luogo, l'agente patogeno del cancro dello stelo (coltivato a 28 °C al buio per 7-10 giorni) è stato tagliato in cinghie di micelio (1,2 cm di larghezza). Gli alberelli di pioppo di un anno o i rami di un anno venivano cinti sugli steli (a ~30 cm sopra il suolo o la base dei rami, indicati dalle frecce blu) attraverso due metodi: cingimento floematico (cingere e scartare gli anelli cinti che includono epidermide, floema e tessuti di cambio parziale sugli steli) o cingimento epidermico (cingere e scartare gli anelli cinti che includono solo l'epidermide degli steli). La larghezza del floema cinto o degli anelli floematici è di 1,0 cm. Quindi, le regioni cinte sono state ricoperte interamente con cinghie di micelio e avvolte immediatamente con nastro di plastica PE; I lati del micelio della cinghia erano rivolti verso la regione cinturata. Per la ricerca sulla biologia delle radici, come la rizogenesi e lo sviluppo delle radici, gli alberelli/rami di pioppo inoculati sono stati coltivati per 14-30 giorni in regime di gestione regolare (Pathway I, evidenziato nelle frecce gialle). Per la ricerca sulla biosintesi dei segmenti, la fotomorfogenesi o la regolazione dell'espressione dei geni legati alla luce, è stato adottato un ulteriore avvolgimento di fogli di alluminio, quindi gli alberelli/rami inoculati sono stati coltivati ~20 giorni per produrre gli AR. Quando gli AR sono stati prodotti, il foglio di alluminio è stato rimosso dagli steli/rami e gli AR di pioppo sono stati esposti alla luce del sole o ad altre condizioni di luce (variate nello spettro luminoso, nell'intensità, nel periodo o nelle loro combinazioni) (Pathway II, evidenziato nelle frecce rosse). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67304/67304fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67304/67304fig02.jpg"> 
Figura 2: I patogeni del cancro del fusto hanno indotto la formazione di radici avventizie (AR) e la biosintesi dei segmenti in condizioni di luce di AR nel pioppo. (A) Diversi patogeni del cancro del fusto inducono la formazione di AR nei fusti di pioppo. A1: controllo della cintura; A2: cingimento e rimozione del cambio (GR); A3-6: Diversi agenti patogeni del cancro dello stelo (V. sordida e B. dothidea) inducono la formazione di AR in alberelli di P. alba var. pyramidalis di 1 anno; A7: AR prodotti sul ramo di P. alba var. pyramidalis di 6 anni. (B) L'esposizione alla luce induce la biosintesi di segmenti su AR di pioppo. B1-B4 rappresentano AR di pioppo esposti in condizioni di luce a 0, 1, 2 e 3 giorni dopo l'esposizione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67304/67304fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Radici avventizie di pioppo indotte da patogeni del cancro del fusto: un sistema sperimentale per lo studio della biologia delle radici e dei processi correlati alla risposta alla luce

Valsa sordida and Botryosphaeria dothidea are two crucial necrotrophic fungal pathogens that damage many plant hosts, particularly species in the genus ...

Lo scopo di questo protocollo di ricerca è quello di descrivere un metodo per produrre radici avventizie attraverso la cintura e l'inoculazione di patogeni fungini agli steli dei rami dei pioppi. Proponiamo questo metodo come sistema sperimentale ideale per lo studio della biologia radicale e dei processi di risposta alla luce nelle interazioni pioppo-patogeno.Sebbene la promozione della crescita di microrganismi benefici sulle radici, come i rizobatteri che promuovono la crescita delle piante, i batteri ecto-endofitici o i funghi micorrizici vascolari o i funghi ectomicorrizici, sia stata segnalata in molte specie vegetali, l'induzione della crescita accidentale da parte di agenti patogeni non è stata documentata. Questo protocollo presenta un normale fenomeno di sviluppo radicale nel pioppo.Lo sviluppo e il comportamento delle radici di pioppo sono stati studiati in vari ambienti e in interazione con microrganismi benefici. Tuttavia, la nostra ricerca introduce una nuova area della biologia della crescita delle piante, l'induzione di radici avventizie nel pioppo da parte di patogeni fungini dello stelo. Crediamo che questa scoperta farà progredire non solo lo studio della biologia della crescita, ma anche la comprensione delle interazioni tra piante e patogeni.Questo protocollo di ricerca ha dimostrato che i patogeni del fusto inducono radici avventizie nei pioppi. Possiamo accettare che i patogeni possano anche modificare i modelli di espressione genica nelle radici avventizie a livello trascrizionale, post-trascrizionale ed epigenetico. Pertanto, i metodi proposti in questo protocollo hanno aperto la strada alle ricerche sulle radici avventizie del pioppo.In futuro, ci concentreremo sui meccanismi fisiologici e molecolari dei patogeni del cancro che inducono la formazione di radici avventizie nel pioppo. Ricercheremo anche il meccanismo di resistenza e la modificazione epigenetica delle radici avventizie di pioppo dopo l'inoculazione di patogeni e cercheremo di scoprire l'applicazione di imboschimento di questo fenomeno.[Narratore] Per preparare l'agar destrosio di patate o il PDA medium, sciogliere sei grammi di estratto di patate, 20 grammi di destrosio e 20 grammi di agar in un litro d'acqua. Sterilizzare il terreno a 121,1 gradi Celsius per 30 minuti. Versare il terreno in piastre di Petri, ciascuna contenente 20 millilitri di terreno PDA. Inoculare il cubo di micelio fungino attivato di Valsa sordida o Botryosphaeria dothidea al centro della capsula di Petri. Incubare la capsula al buio a 28 gradi Celsius per sette-10 giorni. Dopo l'incubazione, tagliare il terreno PDA con micelio fungino a strisce. Successivamente, seleziona un alberello di pioppo vigoroso di uno o due anni e scegli uno stelo maturo dall'alberello. Sterilizzare la regione di inoculazione con etanolo al 75%. Cingere con cura l'epidermide e il floema del gambo di pioppo sterilizzato. Rimuovere gli anelli floematici cinturati, compreso il cambio parziale, per esporre il cambio interno o i tessuti xilematici. Coprire completamente la regione della cintura con cinghie di micelio fungino come trattamento di inoculazione della cintura floematica. Avvolgere lo stelo inoculato con quattro strati di nastro da innesto estensibile e trasparente per trattenere l'umidità. Usando un coltello sterilizzato, raschiare e danneggiare il tessuto del cambio interno dell'area esposta. Quindi, inoculare la cinghia PDA sulla regione di cintura come parte del trattamento di rimozione del cambio. Successivamente, inoculare le regioni di cintura direttamente con cinghie medie PDA non coltivate come controllo della cintura. Avvolgere lo stelo inoculato con quattro strati di nastro da innesto estensibile e trasparente per trattenere l'umidità. Legare il gambo inoculato con un bastoncino per proteggerlo dal frangivento. Dopo 14-30 giorni dall'inoculazione, osservare e registrare la formazione di radici avventizie di pioppo. Cingere con cura l'epidermide del fusto di pioppo per esporre il tessuto floematico verde. Quindi, raschiare verticalmente il tessuto floematico ed esporre la struttura interna del floema. Inoculare la regione dell'epidermide cinta con micelio fungino e cinturino PDA come dimostrato in precedenza. Avvolgere gli steli inoculati con quattro strati di nastro da innesto estensibile e trasparente. Dopo 14-30 giorni dall'inoculazione, osservare e registrare la formazione di radici avventizie di pioppo o radici avventizie. I patogeni del cancro dello stelo V. sordida e B. dothidea hanno indotto la formazione di radici avventizie negli steli di Populus alba var. Le radici avventizie sono state indotte anche sui tronchi di P. alba var. pyramidalis di 6 anni dal patogeno V. sordida dopo la cintura floematica, con lunghezze delle radici superiori a 7,0 centimetri. Dopo aver indotto radici avventizie nel pioppo utilizzando il metodo di inoculazione del cingolo floematico o del cingolo dell'epidermide, avvolgere la regione inoculata dall'agente patogeno con un foglio di alluminio per il trattamento ombreggiante. Lega lo stelo con un bastoncino per proteggerlo dal frangivento. Trascorsi 20 giorni, rimuovere il foglio di alluminio dai gambi. Osserva e fotografa le radici avventizie di pioppo ombreggiate e non ombreggiate in fogli di alluminio. Coltiva le radici avventizie di pioppo ombreggiato alla luce del sole o sotto fonti di luce artificiale. Dopo uno-cinque giorni di esposizione alla luce, rimuovere i nastri di innesto e raccogliere le radici avventizie di pioppo. Avvolgere le radici avventizie con un foglio di alluminio. Immergere i campioni di radice avventizia in azoto liquido e conservarli a meno 80 gradi Celsius. L'esposizione alla luce ha trasformato le radici avventizie bianche o rosso chiaro in radici avventizie rosse su P. alba var. pyramidalis entro tre giorni, con biosintesi del pigmento legata alla formazione di cianidina 3-O-glucoside.

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Questo articolo fornisce un protocollo per la coltivazione di piantine di Arabidopsis in RootChip, una piattaforma di imaging microfluidico che combina controllo automatizzato delle condizioni di crescita con il monitoraggio radice al microscopio e FRET-based misura i livelli di metaboliti intracellulari.

Time-lapse imaging di fluorescenza della crescita Root Arabidopsis con manipolazione accelerato dell&#39;ambiente root usando il RootChip

Il Lateral Root Inducible System (LRIS) consente l'induzione sincrona delle radici laterali ed è presentato per Arabidopsis thaliana e mais.

Laterale Root inducibile di sistema in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; E mais

Questo protocollo mostra un metodo di preparazione del campione di piante per la microscopia a foglio di luce. La configurazione è caratterizzata dal montaggio verticale della pianta sulla superficie di un gel e dal lasciarla crescere in condizioni di luminosità controllata. Ciò consente l'osservazione a lungo termine dello sviluppo degli organi vegetali in condizioni standardizzate.

Luce Foglio microscopia a fluorescenza delle radici delle piante che crescono sulle superficie di un gel

Questo protocollo presenta un riepilogo dettagliato delle strategie per inoculare le radici delle piante con microbi trasmessi dal suolo. Esemplificato per i funghi Verticillium longisporum e Verticillium dahliae, vengono descritti tre diversi sistemi di infezione delle radici. Vengono evidenziate le potenziali applicazioni e le possibili analisi a valle e vengono discussi vantaggi o svantaggi per ciascun sistema.

Strategie di inoculazione per infettare le radici delle piante con microrganismi trasmessi dal suolo

Utilizziamo semplici strumenti di laboratorio per esaminare l'architettura del sistema di root (RSA) di Arabidopsis e Medicago. Le piantine vengono coltivate idroponicamente su rete e distribuite usando un pennello artistico per rivelare la RSA. Le immagini vengono scattate utilizzando la scansione o una fotocamera ad alta risoluzione, quindi analizzate con ImageJ per mappare i tratti.

Un semplice protocollo per mappare i tratti dell'architettura del sistema di root delle piante

Forniamo un protocollo passo-passo per valutare la resistenza del pioppo ai patogeni del cancro del fusto utilizzando un metodo di inoculazione fogliare in vivo . Questo metodo è particolarmente adatto per la valutazione su larga scala della resistenza al cancro di Cytospora chrysosperma e Botryosphaeria dothidea nella progenie riproduttiva di pioppo in Cina.

Inoculazione fogliare in vivo: un metodo alternativo per valutare la resistenza alle malattie dei cloni ibridi nell'allevamento dei pioppi del cancro del fusto

Il Stemgent inducibile Dox Mouse Set TF Lentivirus possibile riprogrammare i fibroblasti embrionali di topo (MEF) per pluripotenti indotte staminali (iPS), cellule. Qui mostriamo il protocollo per DOX-inducibile espressione di fattori di trascrizione del mouse riprogrammazione Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc di generare colonie iPS che esprimono i marcatori comune MES pluripotenza.

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da Riprogrammazione fibroblasti embrionali di topo con un fattore quattro trascrizione, Doxiciclina inducibile lentivirali sistema di trasduzione

Combinatorie 5 proteine ​​fluorescenti marcatura di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche consente il monitoraggio in vivo clonale tramite confocale e microscopia a due fotoni, fornendo approfondimenti midollo osseo emopoietico architettura durante la rigenerazione. Questo metodo permette di mappatura destino non invasiva di cellule HSPCs derivate spettralmente-codificati nei tessuti intatti per lunghi periodi di tempo dopo il trapianto.

In vivo clonale Monitoraggio di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici Contrassegnato da cinque proteine ​​fluorescenti che utilizzano confocale e microscopia Multiphoton

La natura delle interazioni tra staminali e progenitrici di cellule ematopoietiche (HSPCs) e nicchie di midollo osseo è poco conosciuta. Modifiche hardware personalizzato e un protocollo di acquisizione multi-step consentono l'utilizzo di due fotoni e microscopia confocale per immagine ex vivo HSPCs etichettati homed all'interno delle aree del midollo osseo, interazioni monitoraggio e movimento.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

La cellulosa cristallina è un importante costituente della parete cellulare delle piante. Tuttavia, la sua quantificazione a una risoluzione cellulare è tecnicamente impegnativa.  Qui, riportiamo l'uso della tecnologia della luce polarizzata e delle sezioni trasversali delle radici per ottenere informazioni sulla composizione della parete cellulare con una risoluzione spazio-temporale.

Risoluzione Quantificazione alta del cristallino cellulosa accumulo in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots a Monitor tessuto-specifica delle cellule parete Modifiche

Scopri un protocollo per indurre radici avventizie nel pioppo mediante inoculazione di patogeni fungini attraverso il floema o l'epidermide. Questo metodo sperimentale permette di studiare la biologia delle radici e le risposte fisiologiche alla luce.

Radici avventizie di pioppo indotte da patogeni del cancro del fusto: un sistema sperimentale per lo studio della biologia delle radici e dei processi correlati alla risposta alla luce (Video) | JoVE Journal

Radici avventizie di pioppo indotte da patogeni del cancro del fusto: un sistema sperimentale per lo studio della biologia delle radici e dei processi correlati alla risposta alla luce

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