Name: Assemblaggio e quantificazione di co-colture che combinano lieviti eterotrofi con cianobatteri fototrofi secernenti zucchero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Scopri come assemblare e quantificare co-colture di cianobatteri fototrofi secernenti zucchero con lieviti eterotrofi. Questo metodo consente di monitorare le interazioni microbiche in consorzi sintetici per applicazioni biotecnologiche.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocollo per la co-coltura di cianobatteri secernenti saccarosio con partner fungini

<table><tbody><tr><td>Obiettivo 10x Ph1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>46 04 01-9904</td><td></td></tr><tr><td>525/40 nm Filtro passa-banda</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A01-1-0051</td><td>Filtro FITC (in laser a 488 nm)</td></tr><tr><td>Filtro passa-banda 660/10 nm</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A01-1-0055</td><td>Canale APC (in laser a 638 nm)</td></tr><tr><td>Filtro passa-banda 710/50 nm</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B71092</td><td>PC5.5 canali (in laser a 561 nm)</td></tr><tr><td>Accuvette per Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A35473</td><td>Coppe per campioni con coperchi</td></tr><tr><td>Tubo di apertura 30 &mu; M per Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>C92760</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td> capillare <td>Lab Associates</td><td>EQM-ARBP</td><td>per la sterilizzazione di materiale</td></tr><tr><td>Palloni deflettori ROTILABO®, collo dritto, 250 ml</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>LY95.1</td><td></td></tr><tr><td>BG11 / CoYBG11 componenti</td><td>diversi fornitori</td><td></td><td>vedi Tabella 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtro sterile per flacone</td><td>Sigmaaldrich</td><td>Z222593</td><td>a terreni sterili se non si desidera utilizzare l'autoclave</td></tr><tr><td>Capillary 45 & micro; m</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651738</td><td></td></tr><tr><td>CASY Cell Counter Modello TTC</td><td>Schaerfe Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tazze CASY</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651794</td><td></td></tr><tr><td>CASYclean</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651786</td><td>Soluzione detergente</td></tr><tr><td>CASYton Soluzione</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651808</td><td>Soluzione isotonica&nbsp;</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga (50 mL)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>BOC</td><td>270182-L</td><td>per l'alimentazione di cianobatteri colture axeniche e co-colture</td></tr><tr><td>CONTRAD&reg; 70</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>81911</td><td>Soluzione di pulizia profonda</td></tr><tr><td>Vetro di copertura 20 & 26 x 0,4 mm</td><td>VWR International GmbH</td><td>631-1190</td><td>Vetro di copertura per camera di conteggio</td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Sarstedt</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>Cianobatteri BG-11 Soluzione d'acqua dolce</td><td>Merck KGaA</td><td>C3061</td><td></td></tr><tr><td>CytExpert Software v. 2.6</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Software applicativo per citometro</td></tr><tr><td>CytoFLEX Sheath Fluid</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B51503</td> Citometro <td>per fluido di sheat</td></tr><tr><td>CytoFLEX S</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Detergente BE51180</td></tr><tr><td>DxH per Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>628022</td><td>Soluzione detergente</td></tr><tr><td>Eppendorf tube centrifuge (small)</td><td>Labstac</td><td>CEN16-15</td><td>per centrifugare meno di 2mL di coltura</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>K928.1</td><td></td></tr><tr><td>FACS provette</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>2523749</td><td>tubi per la modalità semiautomatica</td></tr><tr><td>FlowClean Cleaning Agent, 500ml</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>C48093</td><td>Soluzione di pulizia quotidiana</td></tr><tr><td>Cilindri graduati</td><td>Sigmaaldrich</td><td>Z131121</td><td>per la preparazione di terreni</td></tr><tr><td>HEPPSO</td><td>Merck KGaA</td><td>R426725</td><td></td></tr><tr><td>Infors MultiTron fotoincubatore</td><td>Infors AG</td><td></td><td>luce LED bianca</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Merck KGaA</td><td>I6758</td><td>Preparare le aliquote, conservare a -20&deg; C, scongelare e tenere sul ghiaccio&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoton II per Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>8448011</td><td>Soluzione isotonica&nbsp;</td></tr><tr><td>Kaluza v. 2.2</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B16406</td><td>Software di analisi dei dati citometrici</td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>VWR International GmbH</td><td>115-2221</td><td>Tessuti privi di lanugine</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Merck KGaA</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>KPO3</td><td>Noah Chemicals</td><td>7790-53-6</td><td></td></tr><tr><td>Becher di misurazione</td><td>VWR</td><td>213-3747</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per microtest, 96 pozzetti, coperchio slip-on, base piatta, PS, trasparente</td><td>SARSTEDT AG & Co. KG</td><td>82.1581.001</td><td></td></tr><tr><td>Base per microscopio</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>47 09 18-9902/16</td><td></td></tr><tr><td>Testa per microsope</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>47 30 14</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di purificazione dell'acqua Milli-Q</td><td>Merck Millipore</td><td>C85358</td><td></td></tr><tr><td>Contatore di particelle Mulitisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B23005</td><td>Alternativa al contatore di celle CASY</td></tr><tr><td>Neubauer migliorato, profondità 0,02 mm</td><td>Assistent Germany</td><td></td><td>Camera di conteggio</td></tr><tr><td>Neubauer migliorata, profondità 0,1 mm</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>640010</td><td>Camera di conteggio</td></tr><tr><td>Pronto all'uso Daily QC Fluorospheres</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>C65719</td><td>Riferimento per bottiglie QC</td></tr><tr><td>SCHOTT</td><td>Dutscher</td><td>90347</td><td>per la conservazione</td></tr><tr><td>Specord&reg; 200 Plus Spettrofotometro</td><td>Analitico Jena GmbH</td><td></td><td>OD600/750</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Merck KGaA</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da tavolo (grande)</td><td>Labstac</td><td>CEN18-06R</td><td>raccogliere biomassa di coltura</td></tr><tr><td>Lievito Base azotata, senza aminoacidi, senza solfato di ammonio</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>11743014</tr></tbody></table>

assemblaggio e quantificazione di co-colture che combinano lieviti eterotrofi con cianobatteri fototrofi secernenti zucchero

Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria

Instaurazione di co-colture di S. elongatus fototrofico e lieviti eterotrofi Abbiamo precedentemente riportato risultati dettagliati dalla co-coltivazione di Synechococcus elongatus PCC 7942 con una varietà di sottoceppi di S. cerevisiae. Per una descrizione completa dei risultati della co-coltura con questa coppia cianobatteri/lievito, vedere8. Per motivi di brevità e precisione, questi risultati non sono riprodotti qui. In breve, i risultati precedenti indicano una serie di considerazioni importanti per la creazione di co-colture cianobatteriche-lieviti a lungo termine. Di primaria importanza, la capacità del lievito di sopravvivere in condizioni in cui i cianobatteri forniscono le uniche forme di carbonio fisso dipende fortemente dall'efficienza con cui il ceppo di lievito può utilizzare il saccarosio. I ceppi di S. cerevisiae che sono stati evoluti o ingegnerizzati per metabolizzare in modo più efficiente il saccarosio27,28 avevano maggiori probabilità di sopravvivere alla transizione alla modalità di crescita di co-coltura, hanno raggiunto densità cellulari più elevate e hanno mostrato una maggiore robustezza negli esperimenti di co-coltura cianobatterica a lungo termine (da giorni a settimane)8. La fase iniziale dell'inoculazione di una co-coltura è stata particolarmente importante per la vitalità del lievito, probabilmente a causa di stress dovuti alla diluizione della coltura, al cambio di composizione del terreno e/o al ritiro di una fonte di carbonio più concentrata. Pertanto, gli sforzi per facilitare la transizione da un terreno di coltura più ricco a una minima disponibilità di carbonio all'inizio della co-coltura possono migliorare le prestazioni e la coerenza sperimentale (vedi passaggio 1.2.1.1). Inoltre, S. cerevisiae ha mostrato risposte allo stress coerenti con l'iperossia quando inoculato in colture dense di S. elongatus, coerenti con la formazione di O2 come sottoprodotto primario della fotosintesi ossigenata. Pertanto, gli sforzi per prevenire la crescita eccessiva del partner cianobatterico e/o l'alternanza di cicli di luce "giorno/notte" potrebbero estendere sostanzialmente la vitalità di S. cerevisiae in co-colture a lungo termine. Si veda la sezione Discussione per un ulteriore riassunto dei fenomeni comuni nelle co-colture relative ai campioni di controllo axenico.
Monitoraggio della crescita delle co-colture utilizzando diverse metodologie Nella sezione seguente, viene descritta la quantificazione esemplare di un consorzio tripartito miscelato artificialmente di Synechocystis e dei due lieviti S. cerevisiae e U. maydis utilizzando tre diversi metodi. Per la miscela, OD750 (per i cianobatteri) e OD600 (per gli eterotrofi) di singole colture sono stati determinati e regolati a OD 0,1. Le singole colture sono state mescolate in un rapporto di 1:1:1 utilizzando la densità ottica (che è distinta dalla conta delle cellule, vedi sopra). Per facilitare la discriminazione dei lieviti nel citometro, i ceppi reporter di S. cerevisiae geneticamente modificato FY1679-O1B29 che producono costitutivamente mKate2 citoplasmatico (genotipo: URA3Δ/pTDH3::mKate2; ceppo: S. cerevisiae mKate230) e il ceppo AB3331 di U. maydis che producono costitutivamente eGFP (genotipo: pep4Δ/pRpl40::egfp; ceppo: U. maydis eGFP32). Da notare che il ceppo cianobatterico era dotato di un plasmide replicativo che promuoveva la forte espressione costitutiva della proteina fluorescente gialla mVenus (Synechocystis sp. PCC 6803 pSHDY-Pcpc560-mVenus, ceppo Synechocystis mVenus, simile a33) e inoltre, mostra la tipica forte autofluorescenza dovuta alla presenza del macchinario fotosintetico.
Quantificazione microscopica mediante camere di conteggio: Tutti i tipi di cellule nella miscela artificiale utilizzata di tre microrganismi possono essere facilmente discriminati al microscopio (Figura 2A): Synechocystis e S. cerevisiae sono rappresentati da cellule sferiche che tuttavia differiscono notevolmente nel loro diametro (Synechocystis: diametro circa 1,5-3 μm, S. cerevisiae: diametro circa 3-6 μm), mentre le cellule U. maydis hanno una morfologia allungata, a forma di sigaro e una lunghezza di almeno 10 μm (Figura 2A). Questi chiari tratti morfologici consentono l'esatta quantificazione di ciascun partner della miscela. Come esempio illustrativo, 37, 18, 36 e 21 cellule di S. cerevisiae sono contate rispettivamente nei quattro grandi quadrati (Figura 2B). Il valore medio è di 28 celle. Poiché un grande quadrato dell'emocitometro utilizzato ha un'area di 1 mm2 e la profondità della camera era di 0,02 mm, ciò si traduce in 28 cellule per 0,02 μL. Ciò corrisponde a 1.400 cellule/μL, che equivale a 1,4 x 106 cellule/mL. Gli altri tipi di cellule sono stati contati e le concentrazioni sono state determinate di conseguenza (Figura 2C, Tabella 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig02.jpg"> 
Figura 2: Quantificazione microscopica di un consorzio tripartito costituito da Synechocystis e dai lieviti S. cerevisiae e U. maydis. (A) Immagine microscopica a contrasto differenziale (DIC) di una miscela combinata artificialmente dei microrganismi indicati. Tutte le specie possono essere facilmente distinte dalla loro morfologia. Barra della scala: 10 μm. (B) Risultati di conteggio esemplari per una miscela assemblata artificialmente dei ceppi indicati sulla base di colture axeniche con una OD di 0,1. Sono stati analizzati i quattro grandi quadrati ai bordi della griglia (segno rosso nella Figura 1D). (C) Il valore medio delle diverse celle contate nei quattro quadrati è stato utilizzato per calcolare la concentrazione delle cellule nella sospensione utilizzando la seguente equazione: Valore medio/(profondità della camera [0,02 mm] x dimensione del quadrato contato [1 mm2] x 1.000). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Quantificazione mediante contatori di particelle: I contatori di particelle determinano il numero di particelle in una sospensione in base alle loro dimensioni. Nel set di dati di esempio, è stato utilizzato un contatore di particelle con un capillare di 45 μm. Poiché le cellule di S. cerevisiae e U. maydis mostrano dimensioni simili, non possono essere distinte nel contatore di particelle, mentre le cellule più piccole di Synechocystis possono essere chiaramente separate. L'analisi delle singole colture mostra quindi picchi in posizioni identiche riferiti a 3-6 μm per i due lieviti (Figura 3A). Durante la misurazione, viene applicata una pressione negativa, che fa sì che le cellule entrino nel capillare. Questo cambia brevemente la resistenza elettrica in modo che il dispositivo possa determinare la dimensione delle particelle in base all'alterazione. Nella coltura mista, possono essere rilevati due picchi distinti, uno associato alle cellule cianobatteriche più piccole e l'altro che rappresenta una frazione congiunta delle due specie di lievito (Figura 3B). È importante sottolineare che, oltre ai picchi che riflettono le cellule viventi, sono stati rilevati ulteriori picchi a circa 1 μm (Figura 3), corrispondenti a detriti cellulari e particelle più piccole. I segnali che apparirebbero a diametri maggiori del previsto possono essere causati da aggregazioni cellulari. Da notare che la forma dei picchi riflette l'omogeneità delle cellule: un picco acuto mostra cellule molto omogenee, il che è improbabile per una co-coltura. In una co-cultura, ci si aspetta di vedere un picco molto ampio o anche due picchi se i partner della co-cultura sono chiaramente di dimensioni diverse. Per le colture axeniche di funghi eterotrofi, il picco potrebbe essere un picco medio largo.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig3v2.jpg"> 
Figura 3: Quantificazione di un consorzio tripartito costituito da Synechocystis mVenus e dai lieviti S. cerevisiae mKate2 e U. maydis eGFP utilizzando un contatore di particelle. (A) Output visivo delle analisi delle colture assiniche dei tre ceppi come indicato nei grafici (contatore cellulare con capillare da 45 μm). (B) File di output visivo esemplare per l'analisi del consorzio tripartito artificiale utilizzando condizioni identiche. Il contatore di particelle non supporta la discriminazione delle due specie di lievito che sono entrambe rappresentate dal secondo picco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig3v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Quantificazione mediante citometria a cellula singola: Con il citometro a flusso a cellula singola, è possibile distinguere facilmente le diverse popolazioni cellulari in base alle proprietà di (auto)fluorescenza e diffusione della luce. Le cellule fototrofiche (Synechocystis) possono essere differenziate dalle cellule eterotrofe (U. maydis e S. cerevisiae) in base all'autofluorescenza rossa dei pigmenti fotosintetici che viene misurata nel canale APC-H (Figura 4A). Sulla base di questa separazione iniziale di cellule fototrofe ed eterotrofe, le due popolazioni eterotrofe possono essere distinte in base ai loro marcatori fluorescenti eGFP nel canale FITC-H e mKate2 nel canale PC5.5 (Figura 4B, C). In un grafico a punti che mostra le proprietà di scattering di tutte e tre le popolazioni (FSC-H e FSC-Width), le popolazioni possono anche essere distinte con solo alcune sovrapposizioni minori delle popolazioni (Figura 4D).
Con questo metodo, 10 μL dei campioni diluiti sono stati analizzati con una velocità di flusso di 10 μL/min, consentendo una quantificazione di circa 70.000 cellule in 1 minuto. Circa il 60% di queste cellule è stato assegnato a Synechocystis (4,23 x 106 cellule/mL), mentre il restante 40% è stato equamente distribuito tra U. maydis (1,35 x 106 cellule/mL) e S. cerevisiae (1,36 x 106 cellule/mL, Figura 4E, Tabella 2).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig04.jpg"> 
Figura 4: Quantificazione di un consorzio tripartito costituito dal cianobatterio Synechocystis mVenus e dai lieviti U. maydis eGFP e S. cerevisiae mKate2 utilizzando la citometria a flusso a singola cellula. Esempi di grafici ottenuti dopo la misurazione di una coltura mista di Synechocystis mVenus (verde scuro), U. maydis eGFP (verde chiaro) e S. cerevisiae mKate2 (rosso) in un rapporto di 1/3 OD750 / 1/3 OD600 / 1/3 OD600 su un citometro (A) che mostra un istogramma del conteggio degli eventi e della fluorescenza nel canale APC-H (es.: 638 nm, em.: 660/10 nm) di tutte le cellule utilizzate per differenziare le cellule fototrofe ed eterotrofe in base alla loro autofluorescenza. (B) Un istogramma del conteggio degli eventi e della fluorescenza nel canale FITC-H (es.: 488 nm, em.: 525/40 nm) di tutte le cellule eterotrofe utilizzate per differenziare le cellule mKate2 di U. maydis eGFP e S. cerevisiae in base alle loro proprietà di fluorescenza verde. (C) Un istogramma del conteggio degli eventi e della fluorescenza nel canale PC5.5-H (es.: 561 nm, em.: 710/50 nm) di tutte le cellule eterotrofe utilizzate per differenziare le cellule mKate2 di U. maydis eGFP e S. cerevisiae in base alle loro proprietà di fluorescenza rossa. (D) Un grafico a punti dei segnali di scattering nell'ampiezza FSC sul canale FSC-H utilizzato per identificare le popolazioni cellulari senza proprietà di fluorescenza. (E) Le statistiche della popolazione, compresi i conteggi degli eventi, le percentuali, le medie aritmetiche e le deviazioni standard (SD) dei canali di fluorescenza pertinenti. La quantità totale di cellule, insieme alle loro dimensioni e fluorescenze, è stata determinata in un volume di 10 μL con una velocità di flusso di 10 μL/min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per visualizzare comparativamente l'output dei diversi metodi di quantificazione, i numeri di cella determinati sono presentati nelle due tabelle seguenti (Tabella 2 e Tabella 3). Le concentrazioni finali delle cellule determinate utilizzando i tre metodi precedentemente descritti sono in un intervallo simile per tutti i metodi. Il citometro fornisce la dimensione massima del campione, seguita dal contatore di particelle e dalla quantificazione microscopica, con una diminuzione di circa un ordine di grandezza tra i metodi.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Co-cultura 1:1:1</td>
			<td>Fotometro</td>
			<td colspan="2">Citometro</td>
			<td colspan="2">Contatore di particelle</td>
			<td colspan="2">Camera di conteggio per microscopia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Organismo</td>
			<td>OD750/600</td>
			<td>Conteggio delle celle</td>
			<td>cellule/mL</td>
			<td>Conteggio delle celle</td>
			<td>cellule/mL</td>
			<td>Conteggio delle celle</td>
			<td>cellule/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Saccharomyces cerevisiae mKate2</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>13,618</td>
			<td>1,36 x 106</td>
			<td rowspan="2">1,546*</td>
			<td rowspan="2">2,58 x 106*</td>
			<td>112</td>
			<td>1,40 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ustilago maydis eGFP</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>13,541</td>
			<td>1,35 x 106</td>
			<td>89</td>
			<td>1,11 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">PCC 6803 mVenus</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>42,330</td>
			<td>4,23 x 106</td>
			<td>3,094</td>
			<td>5,16 x 106</td>
			<td>271</td>
			<td>3,39 x 106</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2: Confronto tra i diversi metodi di quantificazione: Coltura mista artificiale. Si noti che U. maydis e S. cerevisiae non possono essere distinti utilizzando un contatore di particelle (*).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Singola cultura</td>
			<td>Fotometro</td>
			<td colspan="2">Citometro</td>
			<td colspan="2">Contatore di particelle</td>
			<td colspan="2">Camera di conteggio per microscopia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Organismo</td>
			<td>OD750/600</td>
			<td>Conteggio delle celle</td>
			<td>cellule/mL</td>
			<td>Conteggio delle celle</td>
			<td>cellule/mL</td>
			<td>Conteggio delle celle</td>
			<td>cellule/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Saccharomyces cerevisiae mKate2</td>
			<td>0.1</td>
			<td>38,936</td>
			<td>3,89 x 106</td>
			<td>1,928</td>
			<td>3,21 x 106</td>
			<td>403</td>
			<td>4,03 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ustilago maydis eGFP</td>
			<td>0.1</td>
			<td>36,927</td>
			<td>3,69 x 106</td>
			<td>2,465</td>
			<td>4,11 x 106</td>
			<td>307</td>
			<td>3,07 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">PCC 6803 mVenus</td>
			<td>0.1</td>
			<td>127,864</td>
			<td>1,28 x 107</td>
			<td>8,186</td>
			<td>1,36 x 107</td>
			<td>428</td>
			<td>1,07 x 107</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 3: Confronto tra i diversi metodi di quantificazione: Taratura con colture singole/axeniche.

Assemblaggio e quantificazione di co-colture che combinano lieviti eterotrofi con cianobatteri fototrofi secernenti zucchero

With the increasing demand for sustainable biotechnologies, mixed consortia containing a phototrophic microbe and heterotrophic partner species are being ...

La nostra ricerca mira a comprendere le reti microbiche in consorzi sintetici che coinvolgono cianobatteri secernenti saccarosio e funghi eterotrofi. In passato, i microbiologi di solito studiavano colture pure di singoli microrganismi. In natura, tuttavia, i microbi di solito si trovano in consorzi, e quindi è essenziale comprendere anche le reti microbiche nelle colture miste.Una delle sfide principali consiste nel trovare condizioni di crescita adeguate, compreso un substrato che consenta la crescita di tutti i membri del consorzio. Qui ci concentriamo principalmente sull'ottimizzazione per la massima produzione e secrezione di saccarosio da parte del membro fototrofico, che fornisce la base per la crescita dei membri eterotrofi. Per tracciare la crescita nelle colture axeniche, possono essere utilizzate tecniche comuni come la densità ottica o le misure di retrodiffusione.Tuttavia, queste tecniche non si applicano alle co-colture in cui abbiamo bisogno della conta cellulare delle singole specie. Nel nostro protocollo, applichiamo una combinazione di marcatura fluorescente e conta cellulare per distinguere tra diversi partner di co-coltura. Inoltre, potremmo dimostrare che risultati simili possono essere raggiunti con metodi diversi che vanno da quelli semplici e a basso costo a quelli costosi e ad alto rendimento.Per iniziare, pellettare le cellule cianobatteriche dopo aver coltivato la coltura per tre giorni. Risospendere il pellet in 25 millilitri di terreno sterile CoYBG-11. Centrifugare il campione a 4.000 g per 20 minuti a temperatura ambiente.Quindi scartare il surnatante mediante decantazione. Una volta determinata la densità ottica, aggiungere la quantità calcolata di CoYBG-11 in un pallone deflettore da 250 millilitri in condizioni sterili. Successivamente, aggiungere i volumi calcolati delle sospensioni cellulari cianobatteriche ed eterotrofe per ottenere un volume di coltura finale di 50 millilitri.Utilizzare 50 microlitri dal ceppo IPTG monomolare per una coltura da 50 millilitri. Quindi posizionare il pallone nel fotoincubatore a circa 200 micromoli di fotoni per metro quadrato al secondo. Integrare l'ambiente con il 2% di anidride carbonica a 30 gradi Celsius, agitazione orbitale a 150 giri/min e il 75% di umidità.Per il campionamento, estrarre il pallone dall'incubatore e prelevare un campione da un millilitro dalla coltura in condizioni sterili. Per prepararsi alla quantificazione microscopica, assicurarsi che la camera di conteggio e il vetro di copertura siano privi di polvere e cellule. Posizionare correttamente il vetro di copertura facendolo scorrere sulle due barre di supporto con una leggera pressione evitando rotture.Una volta posizionato correttamente il vetro di copertura, osservare gli anelli di Newton tra le due superfici di vetro, assicurandosi che il vetro di copertura non scivoli. Ora mescola accuratamente la sospensione cellulare e applica alcuni microlitri sul bordo della camera. Lasciare che la camera si riempia completamente tramite forza capillare.Quindi utilizzare un obiettivo appropriato di un microscopio ottico e mettere a fuoco le linee della griglia della camera di conteggio. Conta le celle nei quadrati in modo appropriato per la dimensione della cella data. Per la quantificazione mediante conteggio delle particelle, regolare la densità ottica del campione su 0,1.Quindi aggiungere 10 microlitri di campione a 10 millilitri di tampone di misura isotonico. Fissare il coperchio della coppa del campione e mescolare delicatamente il campione inclinando leggermente la tazza. Dopo aver posizionato la coppa del campione nel contatore di particelle, inserire un capillare con la dimensione dei pori appropriata per le cellule utilizzate nella tazza del campione e chiudere lo sportello della macchina.Avviare la misurazione e registrare in un intervallo appropriato. In questa fase è possibile discriminare cellule con dimensioni diverse. Per la quantificazione mediante citometria a flusso a cellula singola, regolare la densità ottica dei campioni per adattarli alla misurazione citometrica.Applicare la formula data per garantire che la conta cellulare rimanga compresa tra 1.000 e 10.000 cellule al secondo a una velocità di flusso di 10 microlitri al minuto. Trasferire 300 microlitri di ciascuna sospensione di cellule campione in un singolo pozzetto in una piastra da 96 pozzetti. Quindi trasferire la piastra a 96 pozzetti nel campione automatico del citometro.Grafici a punti aperti e istogrammi per i canali di fluorescenza e di dispersione rilevanti per i campioni. Per determinare la concentrazione delle celle, registrare un volume di campione definito utilizzando la funzione di registrazione. Separare i segnali per gli organismi fotografici ed eterotrofi in base all'autofluorescenza rossa dell'organismo fototrofico utilizzando l'istogramma del canale APC-H.Quindi utilizzare l'istogramma del canale FITC-H che mostra solo la popolazione eterotrofica per identificare le cellule eterotrofe contenenti la proteina fluorescente verde. Utilizzare l'istogramma del canale PC5.5-H per distinguere tra le cellule eterotrofe contenenti la proteina fluorescente rossa e quelle prive.

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Fonte: Jiang, H., Ho, M. Isolamento e caratterizzazione del ficobilisoma intatto nei cianobatteri. J. Vis. Exp.(2021).Questo video mostra la procedura per la coltura dei cianobatteri per ottenere biomassa coltivando cellule sotto illuminazione continua con apporto di anidride carbonica e condizioni ricche di sostanze nutritive, seguita dalla raccolta tramite centrifugazione.

Preparazione di colture cianobatteriche per la produzione di biomassa

Abbiamo progettato una apparecchiatura per le colture in continuo per l'uso con i sistemi optogenetic per illuminare le culture di microbi e regolarmente celle di immagine negli effluenti con un microscopio invertito. La coltura, il campionamento, l'imaging, e l'analisi delle immagini sono completamente automatizzati in modo che le risposte dinamiche a illuminazione possono essere misurati per diversi giorni.

Progettazione e Realizzazione di un Illuminating automatizzato, Coltura, e di campionamento per microbica optogenetic Applicazioni

Qui, presentiamo un protocollo che descrive come i) assemblare un vettore auto-replicante utilizzando il toolkit di clonazione modulare CyanoGate, ii) introdurre il vettore in un ospite cianobatterico per coniugazione, e iii) caratterizzano ceppi di cianobatteri transgenici utilizzando un lettore di lamele o citometria di flusso.

Modificazione genetica dei cianobatteri mediante congiugazione utilizzando il toolkit di clonazione modulare CyanoGate

Presentiamo un protocollo per l'identificazione e la quantificazione delle principali classi di metaboliti idrosolubili nel lievito Saccharomyces cerevisiae. Il metodo descritto è versatile, robusto e sensibile. Permette la separazione di isomeri strutturali e forme stereoisomeriche di metaboliti idrosolubili l'uno dall'altro.

Metabolomica quantitativa di Saccharomyces Cerevisiae mediante cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa tandem

Il controllo optogenetico del metabolismo microbico offre un controllo dinamico flessibile sui processi di fermentazione. Il protocollo qui mostra come impostare fermentazioni regolate dalla luce blu per la produzione chimica e proteica a diverse scale volumetriche.

Fermentazioni a controllo leggero per la produzione chimica microbica e proteica

L'attuale protocollo descrive in dettaglio l'isolamento dei ficobilisomi dai cianobatteri mediante centrifugazione attraverso un gradiente di densità discontinuo di saccarosio. Le frazioni di ficobilisomi intatti sono confermate dallo spettro di emissione fluorescente 77K e dall'analisi SDS-PAGE. Le frazioni ficobilisomiali risultanti sono adatte per la colorazione negativa del TEM e l'analisi della spettrometria di massa.

Isolamento e caratterizzazione del ficobilisoma intatto nei cianobatteri

In questo studio, lo scopo principale era monitorare l'assorbimento cellulare e l'eventuale esocitosi dei nanotubi di carbonio (CNT). Da questo punto di vista, abbiamo proposto un metodo unico che utilizza la citometria a flusso con imaging multispettrale che consente una quantificazione e localizzazione di CNT in un numero statisticamente rilevante di cellule.

Localizzazione e quantificazione relativa dei nanotubi di carbonio in cellule con immagini multispettrali Citometria a Flusso

Un metodo per ottenere nanofibre e nanostrutture complesse da proteine ​​singole o multiple della matrice extracellulare è descritto. Questo metodo utilizza interazioni proteina-superficie per creare materiali a base di proteine-free-standing con la composizione sintonizzabile e l'architettura per l'uso in una vasta gamma di applicazioni di ingegneria tissutale e delle biotecnologie.

Nanofibre ECM proteine ​​e Nanostrutture Engineered Uso Assembly-Surface avviato

Bistrati lipidici supportati e particelle di membrana naturali sono sistemi convenienti che può approssimare le proprietà delle membrane cellulari e di essere incorporati in una varietà di strategie analitiche. Qui mostriamo un metodo per preparare microarray composto da supportati doppio strato lipidico rivestite SiO 2 perline, vescicole di fosfolipidi di membrana o particelle naturali.

Formazione di microarray di membrana con un metodo di assemblaggio con sede a seccatoio

Questo manoscritto presenta un metodo di stampaggio ad iniezione di progettare microvasi che ricapitolano le proprietà fisiologiche di endotelio. Il processo di microfluidica-based crea reti vascolari brevetto 3D con condizioni tailorable, come il flusso, composizione cellulare, la geometria, e gradienti biochimici. Il processo di fabbricazione ed esempi di possibili applicazioni sono descritte.

Micropatterning e montaggio dei microvasi 3D

Scopri come assemblare e quantificare co-colture di cianobatteri fototrofi secernenti zucchero con lieviti eterotrofi. Questo metodo consente di monitorare le interazioni microbiche in consorzi sintetici per applicazioni biotecnologiche.

Assemblaggio e quantificazione di co-colture che combinano lieviti eterotrofi con cianobatteri fototrofi secernenti zucchero

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