Assemblaggio e quantificazione di co-colture che combinano lieviti eterotrofi con cianobatteri fototrofi secernenti zucchero

La nostra ricerca mira a comprendere le reti microbiche in consorzi sintetici che coinvolgono cianobatteri secernenti saccarosio e funghi eterotrofi. In passato, i microbiologi di solito studiavano colture pure di singoli microrganismi. In natura, tuttavia, i microbi di solito si trovano in consorzi, e quindi è essenziale comprendere anche le reti microbiche nelle colture miste.

Una delle sfide principali consiste nel trovare condizioni di crescita adeguate, compreso un substrato che consenta la crescita di tutti i membri del consorzio. Qui ci concentriamo principalmente sull'ottimizzazione per la massima produzione e secrezione di saccarosio da parte del membro fototrofico, che fornisce la base per la crescita dei membri eterotrofi. Per tracciare la crescita nelle colture axeniche, possono essere utilizzate tecniche comuni come la densità ottica o le misure di retrodiffusione.

Tuttavia, queste tecniche non si applicano alle co-colture in cui abbiamo bisogno della conta cellulare delle singole specie. Nel nostro protocollo, applichiamo una combinazione di marcatura fluorescente e conta cellulare per distinguere tra diversi partner di co-coltura. Inoltre, potremmo dimostrare che risultati simili possono essere raggiunti con metodi diversi che vanno da quelli semplici e a basso costo a quelli costosi e ad alto rendimento.

Per iniziare, pellettare le cellule cianobatteriche dopo aver coltivato la coltura per tre giorni. Risospendere il pellet in 25 millilitri di terreno sterile CoYBG-11. Centrifugare il campione a 4.000 g per 20 minuti a temperatura ambiente.

Quindi scartare il surnatante mediante decantazione. Una volta determinata la densità ottica, aggiungere la quantità calcolata di CoYBG-11 in un pallone deflettore da 250 millilitri in condizioni sterili. Successivamente, aggiungere i volumi calcolati delle sospensioni cellulari cianobatteriche ed eterotrofe per ottenere un volume di coltura finale di 50 millilitri.

Utilizzare 50 microlitri dal ceppo IPTG monomolare per una coltura da 50 millilitri. Quindi posizionare il pallone nel fotoincubatore a circa 200 micromoli di fotoni per metro quadrato al secondo. Integrare l'ambiente con il 2% di anidride carbonica a 30 gradi Celsius, agitazione orbitale a 150 giri/min e il 75% di umidità.

Per il campionamento, estrarre il pallone dall'incubatore e prelevare un campione da un millilitro dalla coltura in condizioni sterili. Per prepararsi alla quantificazione microscopica, assicurarsi che la camera di conteggio e il vetro di copertura siano privi di polvere e cellule. Posizionare correttamente il vetro di copertura facendolo scorrere sulle due barre di supporto con una leggera pressione evitando rotture.

Una volta posizionato correttamente il vetro di copertura, osservare gli anelli di Newton tra le due superfici di vetro, assicurandosi che il vetro di copertura non scivoli. Ora mescola accuratamente la sospensione cellulare e applica alcuni microlitri sul bordo della camera. Lasciare che la camera si riempia completamente tramite forza capillare.

Quindi utilizzare un obiettivo appropriato di un microscopio ottico e mettere a fuoco le linee della griglia della camera di conteggio. Conta le celle nei quadrati in modo appropriato per la dimensione della cella data. Per la quantificazione mediante conteggio delle particelle, regolare la densità ottica del campione su 0,1.

Quindi aggiungere 10 microlitri di campione a 10 millilitri di tampone di misura isotonico. Fissare il coperchio della coppa del campione e mescolare delicatamente il campione inclinando leggermente la tazza. Dopo aver posizionato la coppa del campione nel contatore di particelle, inserire un capillare con la dimensione dei pori appropriata per le cellule utilizzate nella tazza del campione e chiudere lo sportello della macchina.

Avviare la misurazione e registrare in un intervallo appropriato. In questa fase è possibile discriminare cellule con dimensioni diverse. Per la quantificazione mediante citometria a flusso a cellula singola, regolare la densità ottica dei campioni per adattarli alla misurazione citometrica.

Applicare la formula data per garantire che la conta cellulare rimanga compresa tra 1.000 e 10.000 cellule al secondo a una velocità di flusso di 10 microlitri al minuto. Trasferire 300 microlitri di ciascuna sospensione di cellule campione in un singolo pozzetto in una piastra da 96 pozzetti. Quindi trasferire la piastra a 96 pozzetti nel campione automatico del citometro.

Grafici a punti aperti e istogrammi per i canali di fluorescenza e di dispersione rilevanti per i campioni. Per determinare la concentrazione delle celle, registrare un volume di campione definito utilizzando la funzione di registrazione. Separare i segnali per gli organismi fotografici ed eterotrofi in base all'autofluorescenza rossa dell'organismo fototrofico utilizzando l'istogramma del canale APC-H.

Quindi utilizzare l'istogramma del canale FITC-H che mostra solo la popolazione eterotrofica per identificare le cellule eterotrofe contenenti la proteina fluorescente verde. Utilizzare l'istogramma del canale PC5.5-H per distinguere tra le cellule eterotrofe contenenti la proteina fluorescente rossa e quelle prive.