Disegni microfluidici di laminazione in polietilene tereftalato a basso costo per l'imaging multiplexato di zebrafish

Il nostro laboratorio è interessato ai meccanismi che regolano la migrazione e l'attivazione dei neutrofili nel danno tissutale, nell'infezione e nel cancro, con particolare attenzione alle caratteristiche e al significato biologico della segnalazione intracellulare del calcio nella guarigione delle ferite.

[Conchiglia] I metodi convenzionali di progettazione microfluidica sono costosi e complessi, rallentando così i progressi in campi come la biologia dello sviluppo che richiedono ambienti diversi. Abbiamo riscontrato un approccio più rapido ed efficiente per lo sviluppo e il collaudo dei singoli progetti. Pertanto, questo metodo di costruzione offre una maggiore flessibilità di progettazione e risoluzione spaziale rispetto a protocolli altrettanto semplici, consentendo un'iterazione più rapida e semplice rispetto ai dispositivi PDMS standard. Usandolo, abbiamo sviluppato il RADISH per visualizzare simultaneamente più embrioni di zebrafish all'interno di un unico campo visivo.

Con questo dispositivo di intrappolamento che supporta l'imaging della vita ad alta risoluzione, siamo in grado di capire come i diversi segnali, compresi gli stimoli chimici e meccanici, si integrano per coordinare l'infiammazione e la guarigione delle ferite.

[Istruttore] Per iniziare, progetta il modello per il dispositivo utilizzando il software che preferisci. A seconda dell'età e delle dimensioni dell'embrione, regolare la larghezza del canale e le dimensioni della camera di imaging centrale per ottenere la migliore vestibilità. Salva ogni livello come un singolo file immagine con dimensioni identiche. Ora, inizializza la macchina da taglio secondo le istruzioni del produttore. Nell'area di lavoro di progettazione, seleziona i disegni appena caricati. Raggruppa i modelli destinati allo stesso spessore di foglio di PET nello stesso taglio. Confermare il numero e il tipo di motivi nel taglio, quindi selezionare il materiale tagliato. Quindi, fissare il foglio di PET al tappetino da taglio allo spessore desiderato premendo con decisione per rimuovere le bolle d'aria e caricare il tappetino nella macchina da taglio. Seguire le istruzioni sullo schermo per richiedere alla macchina da taglio di iniziare il taglio. Quindi, rimuovere i tagli finiti dal tappetino da taglio. Ora, allinea gli strati su un vetrino coprioggetti, non assistito o con i segni di registrazione pretagliati. Fissare gli strati con nastro adesivo per ufficio per evitare che si spostino durante la laminazione. A seconda delle dimensioni del dispositivo e della capacità della plastificatrice, montare piccoli disegni su un supporto più grande con più nastro adesivo per evitare inceppamenti o intasare l'alimentazione della plastificatrice. Successivamente, accendere la plastificatrice e laminare secondo le istruzioni del produttore. Rimuovere il nastro adesivo per ufficio prima di allineare lo strato successivo. Utilizzando la colla cianoacrilica, fissare il dispositivo a un piatto da 35 millimetri forato con un foro di tre quarti di pollice. Quindi impermeabilizzare il laminato rivestendo accuratamente i bordi esterni del dispositivo con colla cianoacrilica. Usa abbastanza colla per coprire completamente i bordi esterni senza spazi vuoti. Per iniziare, alleva gli embrioni di zebrafish almeno due giorni dopo la fecondazione in E3 o in un altro mezzo di allevamento embrionale adatto. Quindi, anestetizzare gli embrioni utilizzando 164 milligrammi per litro di MS-222. Quindi, riempire il piatto di contenimento contenente il dispositivo montato con cinque millilitri di E3 o un altro mezzo embrionale contenente 164 milligrammi per litro di MS-222. Utilizzando una pipetta di trasferimento, depositare un embrione anestetizzato in ciascuna camera di contenimento del dispositivo. Quindi, utilizzando un anello per capelli, orientare gli embrioni con la coda di ciascun embrione che sporge nella camera di imaging centrale e il tuorlo immobilizzato nel canale a forma di cuneo. Se lo si desidera, fissare la testa dell'embrione aggiungendo l'1,5% di agarosio a basso punto di fusione nella camera di mantenimento utilizzando una micropipetta. Infine, sposta il dispositivo con gli embrioni sul sistema di imaging scelto per iniziare l'imaging, seleziona il sistema di imaging e l'obiettivo appropriati per l'esperimento. Regola la messa a fuoco del campione e i parametri di imaging per un rapporto segnale/rumore e una velocità di acquisizione ottimali. Per ferire l'embrione tramite transezione manuale, applicare pressione con una lama di bisturi sul tessuto della pinna caudale sulla punta della notocorda sotto uno stereomicroscopio. Quindi, riportare il dispositivo sul tavolino. Per ferire l'embrione tramite stimolazione laser, definire una regione di interesse vicino al bordo della piega della pinna caudale e stimolare in base alla potenza laser disponibile. Visualizzare l'embrione a temperatura ambiente utilizzando il canale GFP e RFP con un intervallo di fotogrammi di un minuto per un totale di un'ora. Se necessario, rilasciare gli embrioni dopo l'imaging aspirando delicatamente vicino alla testa utilizzando una pipetta di trasferimento o facendo roteare il piatto.