Isolamento e registrazione con patch-clamp a cellule intere della microglia ippocampale da topi adulti

La nostra ricerca si concentra sull'isolamento acuto delle microglia per le registrazioni di intere cellule, comprese le correnti di potassio per comprendere l'attività dei canali ionici. Il protocollo è anche adattabile per isolare le microglia per varie regioni del cervello, fornendo informazioni sullo zero in diverse condizioni neurologiche.

Gli sviluppi più recenti nel nostro campo di ricerca includono l'uso della tradizionale digestione enzimatica della pancreatite, combinata con la purificazione della microglia attraverso la selezione cellulare attiva a fluorescenza. Questi progressi hanno migliorato l'accuratezza e l'efficienza dell'isolamento di specifiche popolazioni di microglia per ulteriori studi.

Il nostro protocollo studia le proprietà elettrofisiologiche della microglia direttamente dall'ippocampo del topo adulto, piuttosto che fare affidamento su CS primario in coltura. Questo approccio consente un'analisi più accurata delle funzioni delle microglia nel loro ambiente nativo.

I nostri risultati hanno aperto la strada a nuove domande scientifiche sulla proprietà biochimica e funzionale della microglia sia in condizioni fisiologiche che patologiche, offrendo ai ricercatori una guida preziosa per esplorare ulteriormente questi aspetti.

[Presentatore] Per iniziare, posiziona l'animale anestetizzato supino su un tavolo da dissezione e appunta gli arti. Esporre il torace e perfondere il cuore con PBS sterile e ghiacciato per rimuovere le cellule del sangue circolanti intravascolari. Quindi tieni la testa e taglia la pelle lungo la linea mediana del cervello con le forbici per esporre il cranio. Quindi, taglia la parte posteriore del cranio bilateralmente e tra le orbite con piccole forbici. Taglia il cranio lungo la sutura sagittale e rimuovi il cranio con una pinzetta. Successivamente, estrai rapidamente il tessuto cerebrale. Ora, posiziona il tessuto cerebrale in piastre di coltura di 10 centimetri contenenti PBS ghiacciato. Sezionare la corteccia cerebrale bilateralmente con una pinzetta. Isolare il tessuto ippocampale e tagliarlo in pezzi più piccoli. Trasferire i pezzi in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Quindi risospendere i piccoli pezzi di tessuto ippocampale in due millilitri di soluzione salina bilanciata di Hanks ghiacciata o HBSS. E centrifugare a 300 g per tre minuti a temperatura ambiente. Dopo aver scartato il surnatante, aggiungere 1.950 microlitri di miscela enzimatica uno alla provetta da centrifuga da 15 millilitri contenente i pezzi di tessuto ippocampale. Agitare continuamente la provetta da centrifuga a bagnomaria a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, aggiungere 30 microlitri di miscela enzimatica appena preparata due alla provetta da centrifuga da 15 millilitri. Pipettare i frammenti di tessuto su e giù 20 volte con la punta di una pipetta da un millilitro e incubare a bagnomaria per cinque minuti agitando continuamente a 37 gradi Celsius. Dopo aver rimosso la provetta da centrifuga, pipettare la sospensione su e giù più volte con una pipetta da un millilitro fino a quando non rimangono pezzi di tessuto di grandi dimensioni. Quindi filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro di screening cellulare da 70 micrometri e raccogliere il filtrato in una provetta da centrifuga pulita da 50 millilitri. Trasferire il filtrato in una nuova provetta da centrifuga da 15 millilitri e centrifugare a 300 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi scartare il surnatante con una pipetta da un millilitro. Ora, pipettare la sospensione cellulare su e giù 20 volte con 15 millilitri di HBSS per lavarla e centrifugare a 300 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il surnatante, sospendere nuovamente il pellet cellulare in un millilitro di tampone di selezione cellulare attivato magneticamente. Per iniziare, trasferire un millilitro della sospensione a cellula singola preparata in una provetta da microcentrifuga da due millilitri e centrifugare a 300 g per tre minuti a quattro gradi Celsius. Una volta rimosso il surnatante, risospendere il pellet a cellula singola in 90 microlitri di smistamento cellulare attivato magneticamente o tampone massimo. Aggiungere 10 microlitri di microsfere CD11b o c e incubare la sospensione a quattro gradi Celsius per 15 minuti su uno shaker orizzontale. Quindi aggiungere un millilitro di tampone max direttamente al tubo per lavare la sospensione a cella singola. Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di tampone max. Utilizzando una pipetta da un millilitro, trasferire la sospensione cellulare risospesa nella colonna di smistamento nel campo magnetico. Mentre rimane nel campo magnetico, lavare la colonna tre volte con 500 microlitri di tampone massimo. Quindi rimuovere la colonna di smistamento dal campo magnetico. Aggiungere un millilitro di tampone max alla colonna e spingerlo lentamente con il pistone. Raccogli il flusso. Ora, seminare le cellule selezionate in una piastra a 24 pozzetti contenente un vetrino coprioggetti rivestito con poli-L-lisina. Aggiungere 200 microlitri di terreno di coltura e incubare per 20 minuti in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 95% di ossigeno, il 5% di anidride carbonica e il 60-80% di umidità. Per iniziare, prendi la microglia in coltura isolata dal tessuto cerebrale dei topi. Localizzare la microglia sferica al microscopio ad acqua utilizzando l'obiettivo 40x. Quindi, riempire l'elettrodo con la soluzione intracellulare e collegarlo allo stadio di testa dell'amplificatore della configurazione di elettrofisiologia. Applicare una pressione positiva. Passa all'obiettivo 4x e individua l'elettrodo. Quindi abbassare l'elettrodo nella soluzione del bagno. Impostare l'amplificatore in modalità voltage clamp per eseguire il test della membrana in modalità bagno. Dopodiché, torna all'obiettivo 40x e avvicina la punta dell'elettrodo alla microglia. Quindi, applica una piccola pressione negativa per trattenere la cella. Quando la resistenza raggiunge i 100 megaohm, passare dalla modalità bagno a quella patch nel test della membrana. Quando la resistenza raggiunge i 300 megaohm, rilasciare la pressione negativa. Quando la resistenza indica la formazione di una tenuta giga-ohm tra l'elettrodo e la membrana microgliale. Passa dalla modalità patch a quella cella nel test della membrana. Quindi applicare una piccola quantità di aspirazione e avviare una scossa elettrica per rompere la membrana. Dopo di che passare alla modalità voltage clamp, aprire il programma di registrazione e registrare le correnti di potassio per 200 millisecondi.