Name: Isolamento e registrazione con patch-clamp a cellule intere della microglia ippocampale da topi adulti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:47:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Scopri l'isolamento e la registrazione patch-clamp a cellule intere della microglia ippocampale da topi adulti. Questo metodo consente di studiare l'attività dei canali ionici in condizioni fisiologiche native.

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<meta charset="utf8"></head><body>Registrazione elettrofisiologica della microglia ippocampale da topi adulti

<ol><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li>
<li>Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+interactions+with+synapses+are+modulated+by+visual+experience%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience.</a> PLoS Biol. 8 (11), e1000527(2010).</li>
<li>Voet, S., Prinz, M., Van Loo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+central+nervous+system+inflammation+and+multiple+sclerosis+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Microglia in central nervous system inflammation and multiple sclerosis pathology.</a> Trends Mol Med. 25 (2), 112-123 (2019).</li>
<li>Salter, M. W., Beggs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublime+microglia%3A+Expanding+roles+for+the+guardians+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sublime microglia: Expanding roles for the guardians of the CNS.</a> Cell. 158 (1), 15-24 (2014).</li>
<li>Wohleb, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-microglia+interactions+in+mental+health+disorders%3A+For+better%2C+and+for+worse%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neuron-microglia interactions in mental health disorders: For better, and for worse.</a> Front Immunol. 7, 544(2016).</li>
<li>Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratskya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Physiology of microglia.</a> Physiol Rev. 91 (2), 461-553 (2011).</li>
<li>Sarkar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+ion+channels%3A+Key+players+in+non-cell+autonomous+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Microglial ion channels: Key players in non-cell autonomous neurodegeneration.</a> Neurobiol Dis. 174, 105861(2022).</li>
<li>Hanisch, U. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+Active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia: Active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nat Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).</li>
<li>Collins, H. Y., Bohlen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rodent+microglia+to+promote+a+dynamic+ramified+morphology+in+serum-free+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rodent microglia to promote a dynamic ramified morphology in serum-free medium.</a> J Vis Exp. 133, e57122(2018).</li>
<li>Lyons, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+physiologic+properties+of+microglia+and+blood-borne+cells+in+rat+brain+slices+after+permanent+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Distinct physiologic properties of microglia and blood-borne cells in rat brain slices after permanent middle cerebral artery occlusion.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 20 (11), 1537-1549 (2000).</li>
<li>Li, Q., Lan, X., Han, X., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+tmem119%2FSALL1+and+CCR2%2FCD69+in+FACS-sorted+microglia-+and+monocyte%2Fmacrophage-enriched+cell+populations+after+intracerebral+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Expression of tmem119/SALL1 and CCR2/CD69 in FACS-sorted microglia- and monocyte/macrophage-enriched cell populations after intracerebral hemorrhage.</a> Front Cell Neurosci. 12, 520(2018).</li>
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<li>Maezawa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv1.3+inhibition+as+a+potential+microglia-targeted+therapy+for+Alzheimer%27s+disease%3A+Preclinical+proof+of+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Kv1.3 inhibition as a potential microglia-targeted therapy for Alzheimer's disease: Preclinical proof of concept.</a> Brain. 141 (2), 596-612 (2018).</li>
<li>Delbridge, A. R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+culture+microglia+exhibit+molecular+similarity+to+acutely+isolated+adult+microglia+and+provide+a+platform+to+study+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice culture microglia exhibit molecular similarity to acutely isolated adult microglia and provide a platform to study neuroinflammation.</a> Front Cell Neurosci. 14, 592005(2020).</li>
<li>Volden, T. A., Reyelts, C. D., Hoke, T. A., Arikkath, J., Bonasera, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+flow+cytometry+and+magnetic+bead-based+methods+to+enrich+cns+single+cell+suspensions+for+quiescent+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Validation of flow cytometry and magnetic bead-based methods to enrich cns single cell suspensions for quiescent microglia.</a> J Neuroimmune Pharmacol. 10 (4), 65-665 (2015).</li>
<li>Wulff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+voltage-gated+kv1.3+k%28%2B%29+channel+in+effector+memory+t+cells+as+new+target+for+ms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The voltage-gated kv1.3 k(+) channel in effector memory t cells as new target for ms.</a> J Clin Invest. 111 (11), 1703-1713 (2003).</li>
<li>Tan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocytin-labeling+in+whole-cell+recording%3A+Electrophysiological+and+morphological+properties+of+pyramidal+neurons+in+CYLD-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Biocytin-labeling in whole-cell recording: Electrophysiological and morphological properties of pyramidal neurons in CYLD-deficient mice.</a> Molecules. 28 (10), 4092(2023).</li>
<li>Manitz, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+microglia+in+the+offspring+of+polyi%3AC+treated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of microglia in the offspring of polyi:C treated mice.</a> Brain Res. 1636, 172-182 (2016).</li>
<li>Xu, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+protocol+of+mouse+hippocampal+primary+microglia+culture+by+using+manual+dissociation%2C+magnetic+activated+cell+sorting+and+tic+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Sheng+Li+Xue+Bao%22%5BJournal%5D)">A modified protocol of mouse hippocampal primary microglia culture by using manual dissociation, magnetic activated cell sorting and tic medium.</a> Sheng Li Xue Bao. 71 (6), 883-893 (2019).</li>
<li>Zelenka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+protocol+for+the+isolation+of+highly+purified+neonatal+murine+microglia+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Novel protocol for the isolation of highly purified neonatal murine microglia and astrocytes.</a> J Neurosci Methods. 366, 109420(2022).</li>
<li>Keren-Shaul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+microglia+type+associated+with+restricting+development+of+alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A unique microglia type associated with restricting development of alzheimer's disease.</a> Cell. 169 (7), 1276-1290.e17 (2017).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Various+cell+populations+within+the+mononuclear+fraction+of+bone+marrow+contribute+to+the+beneficial+effects+of+autologous+bone+marrow+cell+therapy+in+a+rodent+stroke+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Stroke+Res%22%5BJournal%5D)">Various cell populations within the mononuclear fraction of bone marrow contribute to the beneficial effects of autologous bone marrow cell therapy in a rodent stroke model.</a> Transl Stroke Res. 7 (4), 322-330 (2016).</li>
<li>Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocols+for+isolation+of+primary+motor+neurons%2C+astrocytes+and+microglia+from+embryonic+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).</li>
<li>Ramesha, S., Rayaprolu, S., Rangaraju, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+approach+to+characterize+phagocytic+properties+of+acutely-isolated+adult+microglia+and+brain+macrophages+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry approach to characterize phagocytic properties of acutely-isolated adult microglia and brain macrophages in vitro.</a> J Vis Exp. 160, e61467(2020).</li>
<li>Mccarthy, K. D., De Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).</li>
<li>Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+used+for+studying+synaptic+transmission+in+slices+of+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Q+J+Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain.</a> Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Piastra di Petri da 100 mm</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Provette Falcon da 15 mL</td><td>BD</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 24 pozzetti</td><td>Piastra di</td> Petri BD <td>353047</td><td></td></tr><tr><td>35 mm</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>353001-50 mL Provette Falcon</td><td>BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; screening delle cellule m</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-823</td><td>Per rimuovere i grumi cellulari prima della selezione cellulare</td></tr><tr><td>Kit di dissociazione cerebrale del topo adulto</td><td>Miltenyi</td><td>130-107-677</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD11b</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA74</td><td>Capra Anti-topo IgG disponibile. Per bloccare le immunoglobuline endogene.</td></tr><tr><td>Anti-Iba 1 Anticorpo</td><td>SYSY</td><td>234308</td><td>Capra Anti-cavia IgG) disponibile. Per bloccare le immunoglobuline endogene.</td></tr><tr><td>Axon Digidata 1440A</td><td>USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axon MultiClamp 700B Amplificatore</td><td>USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA Frazione di albumina V</td><td>BioFrox</td><td>4240GR500</td><td>Siero</td></tr><tr><td>C57BL/6 topi&nbsp;</td><td>Guangdong Medical Laboratory Animal Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11 b/c MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-105-634</td><td></td></tr><tr><td>Cloralio idrato</td><td>Absin</td><td>abs47051394</td><td>Ampiamente usato come anestesia nei topi</td></tr><tr><td>Clampfit 10.6</td><td>USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Zeiss</td><td>&nbsp; LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di coltura</td><td>Fisher Scientific</td><td></td> <td>C11995500BT-DAPI</td></tr> <tr><td>colorante</td><td>Beyotime</td><td>C1002</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore di elettrodi</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Servicebio</td><td>G4203</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orizzontale</td><td>SCILOGEX</td><td>SLK-O3000-S</td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi delle immagini</td><td>Fiji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonne MACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Separatori MACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td>Utilizzare una soluzione fresca al 4% in 1X PBS, pH 7,2-7,4.</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Beyotime</td><td>&nbsp; C0313</td><td>Rivestimento vetrino coprioggetti</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e registrazione con patch-clamp a cellule intere della microglia ippocampale da topi adulti

Isolation and Whole-Cell Patch-Clamp Recording of Hippocampal Microglia from Adult Mice

In breve, il processo prevede l'isolamento della microglia ippocampale dal cervello del topo adulto, seguita dalla registrazione di queste cellule con patch-clamp a cellula intera (Figura 1). La procedura inizia con la dissezione dell'ippocampo di topi adulti C57BL/6J di età compresa tra 3 e 5 mesi. In particolare, l'intero cervello viene rimosso dopo la perfusione e posto in una piastra di coltura contenente PBS ghiacciato (Figura 2A). Per garantire l'isolamento acuto delle cellule dall'ippocampo, la corteccia cerebrale viene rimossa e il tessuto ippocampale a forma di mezzaluna viene isolato intatto (Figura 2B).
Per una qualità ottimale delle cellule e per le successive registrazioni di alta qualità di patch-clamp su cellule intere, è fondamentale controllare il tempo di digestione durante la preparazione della sospensione a cellula singola. Lo studio ha costantemente agitato manualmente il tessuto ippocampale nella miscela enzimatica e ha limitato rigorosamente il periodo di digestione a non più di 15 minuti (Figura 3). Le cellule sono state quindi isolate utilizzando il metodo MACS, raggiungendo una purezza dell'86,20% ± dello 0,68%19,20. Per confermare che queste cellule selezionate erano microglia, i marcatori di superficie microgliale sono stati testati mediante immunofluorescenza utilizzando anticorpi anti-Iba1 e anti-CD11b, che sono ampiamente utilizzati per rilevare la microglia18. I risultati hanno indicato che le cellule isolate erano CD11b e Iba1 positive, confermando il successo dell'isolamento della microglia (Figura 4).
Infine, per valutare se le microglia isolate in modo acuto sono di alta qualità per gli esperimenti di follow-up, descriviamo come eseguire registrazioni di patch-clamp su cellule intere per valutare le correnti di potassio microgliali. La microglia registrata aveva una capacità media di membrana di 10,42 ± 2,05 (Figura 5). I risultati hanno dimostrato che le correnti di potassio microgliale potrebbero essere registrate, indicando che le microglia isolate in modo acuto sono adatte per studi neurobiologici.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67315/67315fig01.jpg"> 
Figura 1: Panoramica della procedura sperimentale. Ci sono quattro passaggi principali: i tessuti cerebrali vengono estratti con cura e l'ippocampo viene sezionato bilateralmente; i tessuti dell'ippocampo vengono digeriti per preparare una sospensione unicellulare utilizzando una miscela enzimatica come descritto nella sezione del protocollo; le cellule bersaglio sono isolate mediante un metodo di smistamento cellulare attivato magneticamente; e le correnti di potassio nelle cellule isolate in modo acuto vengono analizzate mediante registrazione patch-clamp su cellula intera. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67315/67315fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67315/67315fig02.jpg"> 
Figura 2: Dissezione dell'ippocampo. (A) L'intero cervello di un topo di 3-5 mesi. (B) Ippocampo bilaterale isolato. Barra della scala: 0,5 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67315/67315fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67315/67315fig03.jpg"> 
Figura 3: Diagramma schematico che mostra la digestione dei tessuti ippocampali. Illustrazione delle fasi sperimentali critiche, che assicurano che il tessuto ippocampale venga digerito in una sospensione unicellulare aggiungendo miscele enzimatiche a 37 °C con agitazione continua per un massimo di 15 minuti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67315/67315fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67315/67315fig04.jpg"> 
Figura 4: Identificazione di microglia ippocampali acutamente isolate. Immagini confocali rappresentative che mostrano cellule CD11b (verde) e Iba1 (rosso) positive purificate dall'ippocampo, confermando che le cellule isolate sono microglia. Barra della scala: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67315/67315fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67315/67315fig05.jpg"> 
Figura 5: Registrazione delle correnti di potassio microgliale a cellula intera. (A) Un elettrodo di registrazione è posizionato sulla superficie della microglia ippocampale isolata. Barra della scala: 20 μm. (B) Correnti di potassio rappresentative della microglia ippocampale acutamente isolata in condizioni di voltage clamp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67315/67315fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Isolamento e registrazione con patch-clamp a cellule intere della microglia ippocampale da topi adulti

Microglia are resident immune cells in the brain that interact with neurons to maintain the homeostasis of the central nervous system (CNS). Studies show ...

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La preparazione di fettine cerebrali acute di ippocampo isolato, così come le registrazioni elettrofisiologiche simultanee di astrociti e neuroni...

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Il video dimostra una tecnica per isolare la microglia dalla corteccia del cervello di un topo adulto. In primo luogo, la corteccia subisce la segmentazione e l'omogeneizzazione per rimuovere i neuroni e altre cellule gliali, preservando la microglia. Successivamente, la sospensione cellulare viene esposta a microsfere magnetiche anti-mielina e a un campo magnetico, separando efficacemente le microglia e le cellule mieloidi dai detriti di mielina e dalle cellule contenenti mielina.

Isolamento della microglia dalla corteccia di un cervello di topo adulto

Il video dimostra un protocollo per studiare le interazioni sinaptiche e le risposte neuronali in una fetta di cervello ippocampale di topo trasfettata. Consiste nell'illuminare i neuroni sensoriali a lungo raggio per innescare i potenziali d'azione e nel registrare i potenziali eccitatori post-sinaptici risultanti nel neurone registrato utilizzando la tecnica del patch-clamp a cellula intera.

Fotostimolazione e registrazioni di patch clamp a cellule intere di neuroni in fette di ippocampo di topo

Questo video dimostra la registrazione dell'attività ritmica della rete neuronale, nota anche come oscillazioni theta, in un ippocampo isolato. Gli elettrodi vengono inseriti in vari strati e posizioni spaziali per rilevare e analizzare le oscillazioni theta. Questo mostra le composizioni neuronali uniche e la connettività della rete neuronale attraverso diversi strati dell'ippocampo.

Registrazione in vitro delle oscillazioni theta nell'ippocampo del topo

Una chiave per il successo indagini di biologia microglia è la conservazione dei immunofunction microglia ex vivo durante l'isolamento dal tessuto del sistema nervoso centrale. Isolare microglia via rotanti risultati si stringono in colture cellulari altamente puri e immunofunctional come valutato da immagini fluorescenti, immunocitochimica, ed ELISA dopo l'attivazione della microglia con il lipopolisaccaride stimoli pro-infiammatori (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolamento della corticale Microglia con Immunofenotipo conservato e funzionalità dal murini neonati

Reti corticali sono controllati da un piccolo, ma diverso insieme di interneuroni inibitori. Indagine funzionale degli interneuroni richiede quindi la registrazione mirata e l'identificazione rigorosa. Qui descritto è un approccio combinato che coinvolge le registrazioni whole-cell da coppie singole o sinapticamente-accoppiati di neuroni con etichettatura intracellulare, post-hoc analisi morfologica e immunocitochimica.

Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell&#39;ippocampo

Qui presentiamo un protocollo per registrare la teoria ritmica della rete neuronale e le oscillazioni gamma da una preparazione interamente isolata di ippocampo. Descriviamo le fasi sperimentali dall'estrazione dell'ippocampo ai dettagli del campo, delle registrazioni a blocchi di patch patch unitari e intere cellule, nonché della stimolazione ottogenetica del ritmo theta.

Tuning nella Banda Theta Ippocampale<em&gt; In vitro</em&gt;: Metodologie per la registrazione dal circuito isolante di roditore Septohippocampal

Forniamo un protocollo per l'isolamento della microglia da diverse regioni sezionate di un emisfero cerebrale adulto, seguito dalla preparazione della libreria semiautomatica per il sequenziamento profondo dell'RNA unicellulare di trascrittomi a lunghezza intera. Questo metodo aiuterà a chiarire l'eterogeneità funzionale della microglia in salute e malattia.

Isolamento di Microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dell'RNA a singola cellula

Presentiamo un protocollo per preparare fette acute dall'ippocampo dorsale-intermedio dei topi. Confrontiamo questa preparazione trasversale con l'affezione coronale in termini di qualità delle registrazioni e conservazione delle caratteristiche morfologiche dei neuroni registrati.

Preparazione di fette acute dall'ippocampo dorsale per la registrazione a cellule intere e la ricostruzione neuronale nel giro dentato di topi adulti

Questo articolo descrive un metodo per l'osservazione cronica in vivo della microglia a riposo nell'ippocampo CA1 del topo utilizzando la chirurgia controllata con precisione e la microscopia a due fotoni.

In vivo Imaging cronico a due fotoni della microglia nell'ippocampo del topo

Descriviamo un protocollo per isolare le cellule microgliali dall'ipotalamo del topo (o piccole strutture cerebrali equivalenti) utilizzando il cell sorting attivato magneticamente (MACS), in un tempo relativamente breve. La microglia ipotalamica selezionata con MACS può essere utilizzata per analisi ex vivo e può essere piastrata per eseguire saggi in vitro .

Isolamento della microglia ipotalamica dal cervello di topo adulto appena perfuso mediante smistamento cellulare attivato magneticamente  

Scopri l'isolamento e la registrazione patch-clamp a cellule intere della microglia ippocampale da topi adulti. Questo metodo consente di studiare l'attività dei canali ionici in condizioni fisiologiche native.

Isolamento e registrazione con patch-clamp a cellule intere della microglia ippocampale da topi adulti

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