Identificazione e quantificazione di metaboliti squilibrati in pazienti critici utilizzando la metabolomica basata sulla risonanza magnetica nucleare

La nostra ricerca utilizza la metabolomica basata sulla risonanza magnetica nucleare per identificare i metaboliti disregolati e le vie biochimiche che vengono alterate nei pazienti in terapia intensiva in condizioni critiche, e abbiamo incluso anche pazienti con ARDS, che è una grave condizione polmonare. Attraverso la profilazione e il confronto delle firme metaboliche, miriamo a scoprire i disturbi biochimici legati alla progressione della malattia e personalizzare i trattamenti per migliorare i risultati. In realtà, stiamo cercando di colmare il divario nella comprensione della disregolazione metabolica in tutte le categorie di pazienti con ARDS, che include i pazienti con ARDS lieve, moderata e grave.

Migliorare le nostre intuizioni, per una migliore comprensione della malattia, della sua progressione, con l'obiettivo generale di migliorare l'esito del paziente fornendo una medicina di precisione e personalizzata. La risonanza magnetica nucleare consente di preparare facilmente i campioni, preservando l'integrità del siero per la rianalisi e rilevando metaboliti noti e sconosciuti senza derivatizzazione chimica. Fornisce dati quantitativi riproducibili, garantendo una misurazione affidabile dei metaboliti.

A differenza degli approcci mirati, la risonanza magnetica nucleare consente un'esplorazione sensibile e imparziale dei cambiamenti metabolici, rendendola ideale per scoprire firme e percorsi nella progressione della malattia. La nostra scoperta migliorerà la ricerca sull'ARDS scoprendo i cambiamenti metabolici in diverse fasi, che sono poco studiati. Utilizzando la metabolomica basata sulla risonanza magnetica, miriamo a identificare metaboliti e percorsi disregolati, portando a potenziali firme per la diagnosi precoce, la prognosi, la previsione più tempestiva e i trattamenti.

Questo approccio migliora la gestione personalizzata e approfondisce le conoscenze sulla profilazione metabolica multistato. I nostri risultati hanno aperto la strada a nuove domande scientifiche, come ad esempio: In che modo i metaboliti specifici identificati nelle diverse fasi dell'ARDS influenzano la progressione della malattia? Questi percorsi disregolati possono essere presi di mira per interventi terapeutici precoci?

Inoltre, in che modo questi cambiamenti metabolici variano in altre condizioni respiratorie o infiammatorie? Per iniziare, utilizzando un ago sterile, raccogliere due millilitri di sangue dalle arterie di un paziente con diagnosi di sindrome da distress respiratorio acuto lieve o moderato o ARDS. Trasferire il sangue in una fiala sterile e lasciarlo coagulare per 30 minuti a temperatura ambiente.

Centrifugare il sangue coagulato a 3, 100 g per 15 minuti per separare il siero. Trasferire il siero in provette sterili da microcentrifuga, facendo aliquote da 400 a 500 microlitri. Etichettare le provette con i dettagli del paziente e conservarle a 80 gradi Celsius.

Per gli esperimenti NMR, mescolare 250 microlitri di aliquota sierica con 250 microlitri di tampone fosfato salino per ridurre al minimo la variazione di pH. Agitare il composto per circa 15 secondi per garantire una miscelazione omogenea. Trasferire il campione preparato in una provetta NMR pulita con un inserto coassiale contenente TSP a una concentrazione di 0,05 millimolari.

Quindi, posiziona il tubo NMR nel magnete. Digita WRPA e seleziona il numero di esperimento appropriato per impostare un esperimento protonico con il programma di impulsi CPMG. Fare clic sull'opzione Titolo per inserire il nome del paziente e altri dettagli necessari.

Digitare lock e premere Invio per bloccare il campo magnetico. Quindi, seleziona le opzioni 90% acqua e 10% ossido di deuterio. Quindi, digitare ATMM e premere Invio per eseguire la regolazione e la corrispondenza della sonda.

Successivamente, dall'opzione Parametri di acquisizione, selezionare i parametri come 64.000 punti su 128 scansioni per raccogliere i dati di ottimizzazione. Impostate il ritardo di rilassamento di cinque secondi, un'ampiezza di scansione spettrale di 12 PPM e un tempo di eco di 200 microsecondi, ripetuto 300 volte. Applica l'allargamento della linea di 0,3 hertz utilizzando una funzione finestra esponenziale.

Successivamente, utilizzando gli strumenti di elaborazione e analisi NMR, acquisire gli spettri NMR. Una volta ottenuti gli spettri finali, digitare APK e ABSN per eseguire rispettivamente la correzione di fase e la correzione della linea di base. Quindi, fare clic sull'opzione Calibra asse nel pannello superiore e calibrare il picco TSP a 0 PPM, automaticamente o manualmente.

Infine, trasferire i dati acquisiti dal sistema NMR alla workstation per ulteriori analisi. Dopo aver acquisito gli spettri NMR di pazienti con diagnosi di ARDS lieve o moderata, aprire il software di quantificazione dei metaboliti NMR per l'elaborazione dei dati. Per eseguire la correzione manuale della linea di base utilizzando il metodo Whitaker, aprire il file spettrale nel modulo processore del software di quantificazione dei metaboliti NMR.

Selezionare la correzione della linea di base, quindi scegliere il metodo Whitaker. Posiziona i punti alla base dei picchi in tutti gli spettri. Una volta completato, salvate i file spettrali corretti per la linea di base in un'unica cartella.

Quindi, per eseguire il binning spettrale utilizzando il modulo Profiler, selezionare Strumenti, quindi Elaborazione batch, quindi Binning spettrale. Per generare il foglio di binning finale per l'analisi statistica, selezionare la cartella con tutti i file spettrali corretti per la linea di base. Dividi gli spettri in contenitori di uguali dimensioni con una larghezza spettrale definita che varia da 0,01 a 0,04 parti per milione.

Specificare la dimensione del bucket e i valori PPM di inizio e fine. Scegliere una cartella in cui salvare i fogli di binning di output. Escludere le regioni di spostamento chimico corrispondenti all'acqua e al TSP del solvente per evitare interferenze spettrali.

Il foglio di calcolo finale visualizzerà i nomi dei campioni in una riga e i valori dei contenitori con i PPM corrispondenti nelle altre righe. Prima di eseguire l'analisi statistica, normalizzare i dati utilizzando la normalizzazione, la trasformazione dei log e il ridimensionamento di Pareto. Per l'analisi multivariata, eseguire l'analisi delle componenti principali, l'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali e l'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali ortogonali per osservare la discriminazione tra i gruppi, ottenendo un'importanza variabile dei punteggi di proiezione per ogni metabolita responsabile della differenza nel profilo metabolico.

Eseguire il t-test di Student per identificare i metaboliti significativi con un valore p inferiore a 0,05. I test T producono grafici a scatola che mostrano differenze nelle concentrazioni di metaboliti. Quindi, eseguire l'analisi dei biomarcatori per generare un'area sotto il grafico della curva caratteristica operativa del ricevitore.

Selezionare l'elenco finale dei metaboliti significativi in base a un'importanza variabile del punteggio di proiezione maggiore di uno, un valore p corretto per Bonferroni inferiore a 0,05 e un'area sotto la curva maggiore di 0,8. Utilizzando il database del metaboloma umano, identificare i metaboliti corrispondenti a specifici valori di PPM. Prima di iniziare la quantificazione, utilizzando il modulo processore, calibrare il composto di riferimento selezionato per lo studio.

Fare clic sull'opzione Calibra indicatore di spostamento chimico e inserire la concentrazione del composto di riferimento. Trascinare il picco del software sul picco di riferimento spettrale e regolarne l'altezza e la larghezza. Una volta che i picchi di riferimento spettrale si allineano con il picco del software, fare clic su Accetta.

Quindi, aprire gli spettri desiderati nel modulo Profiler e selezionare la libreria di composti appropriata per lo studio. Nella parte inferiore dello schermo verrà visualizzato un elenco di metaboliti. Seleziona il metabolita di interesse dall'elenco.

Fare clic sul valore PPM nell'angolo superiore dello schermo. Ingrandisci gli spettri fino alla scala PPM specifica del metabolita. A questo punto, sullo schermo compaiono due picchi, uno che rappresenta i dati registrati e l'altro, mostrato come una linea tratteggiata, che rappresenta il picco del software.

Trascina il picco del software per allinearlo al picco registrato, regolando l'altezza e la posizione in modo che corrispondano. Una volta che i picchi sono correttamente allineati, leggere la concentrazione del metabolita dal valore visualizzato sotto la voce Concentrazione in millimolare. Per generare il file di output, nel menu Strumenti, fare clic sull'opzione Operazioni batch e specificare la cartella desiderata per il salvataggio del file di output.

L'analisi delle componenti principali ha mostrato un distinto clustering tra i gruppi di pazienti con ARDS lieve e moderata. L'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali ortogonali ha rivelato una chiara separazione tra i gruppi ARDS lieve e moderato, sottolineando le differenze metaboliche. L'analisi del t-test e dei biomarcatori di Student ha rivelato metaboliti chiave disregolati tra ARDS lieve e moderata.

Il lattato e l'isoleucina sono stati identificati come metaboliti significativamente disregolati correlati alla gravità dell'ARDS.