Name: Presentazione delle proteoforme istoniche con lelettroforesi su gel 2D-TAU (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Impara a caratterizzare le proteoforme istoniche con l'elettroforesi 2D-TAU per studiare la correlazione tra modificazioni epigenetiche e metabolismo. Questo metodo facilita l'identificazione di nuovi target terapeutici per il trattamento del cancro.

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<meta charset="utf8"></head><body>Separazione su gel 2D per l'arricchimento delle isoforme istoniche e la caratterizzazione PTM

<ol><li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li>
<li>Cutter, A. R., Hayes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+review+of+nucleosome+structure%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A brief review of nucleosome structure.</a> FEBS Lett. 589 (20 Pt A), 2914-2922 (2015).</li>
<li>Millán-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+post-translational+modifications+-+cause+and+consequence+of+genome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function.</a> Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+and+epigenetic+modifications+on+the+path+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer.</a> Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).</li>
<li>Kinnaird, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+control+of+epigenetics+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metabolic control of epigenetics in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 16 (11), 694-707 (2016).</li>
<li>Díaz-Hirashi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+and+signaling+to+chromatin+modifications+in+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming and signaling to chromatin modifications in tumorigenesis.</a> Adv Exp Med Biol. 1219, 225-241 (2020).</li>
<li>Panatta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+by+p53+prevents+R-loop-associated+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation by p53 prevents R-loop-associated genomic instability.</a> Cell Rep. 41 (5), 111568(2022).</li>
<li>Scumaci, D., Zheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+meets+metabolism%3A+novel+vulnerabilities+to+fight+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">Epigenetic meets metabolism: novel vulnerabilities to fight cancer.</a> Cell Commun Signal. 21 (1), 249(2023).</li>
<li>Chiaradonna, F., Scumaci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metabolism+as+a+new+real+target+in+tumor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cancer metabolism as a new real target in tumor therapy.</a> Cells. 10 (6), 1393(2021).</li>
<li>Scumaci, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DJ-1+proteoforms+in+breast+cancer+cells%3A+The+escape+of+metabolic+epigenetic+misregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">DJ-1 proteoforms in breast cancer cells: The escape of metabolic epigenetic misregulation.</a> Cells. 9 (9), 1968(2020).</li>
<li>Olivo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+beyond+the+tip+of+the+iceberg%3A+DJ-1+implications+in+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Moving beyond the tip of the iceberg: DJ-1 implications in cancer metabolism.</a> Cells. 11 (9), 1432(2022).</li>
<li>Zheng, Q., Maksimovic, I., Upad, A., David, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-enzymatic+covalent+modifications%3A+a+new+link+between+metabolism+and+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Non-enzymatic covalent modifications: a new link between metabolism and epigenetics.</a> Protein Cell. 11 (6), 401-416 (2020).</li>
<li>Maksimovic, I., David, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-enzymatic+covalent+modifications+as+a+new+chapter+in+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Non-enzymatic covalent modifications as a new chapter in the histone code.</a> Trends Biochem Sci. 46 (9), 718-730 (2021).</li>
<li>Lowe, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3+mutations%3A+an+updated+view+of+their+role+in+chromatin+deregulation+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Histone H3 mutations: an updated view of their role in chromatin deregulation and cancer.</a> Cancers. 11 (5), 660(2019).</li>
<li>Karsli-Ceppioglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epigenetic+landscape+of+promoter+genome-wide+analysis+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The epigenetic landscape of promoter genome-wide analysis in breast cancer.</a> Sci Rep. 7 (1), 6597(2017).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methyltransferase+and+drug+resistance+in+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Histone methyltransferase and drug resistance in cancers.</a> J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 173(2020).</li>
<li>Vardabasso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+variants%3A+emerging+players+in+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Histone variants: emerging players in cancer biology.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (3), 379-404 (2014).</li>
<li>Ilango, S., Paital, B., Jayachandran, P., Padma, P. R., Nirmaladevi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+alterations+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic alterations in cancer.</a> Front Biosci. 25 (6), 1058-1109 (2020).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H2AX+promotes+metastatic+progression+by+preserving+glycolysis+via+hexokinase-2%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Histone H2AX promotes metastatic progression by preserving glycolysis via hexokinase-2.</a> Sci Rep. 12 (1), 3758(2022).</li>
<li>Nowsheen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZNF506-dependent+positive+feedback+loop+regulates+H2AX+signaling+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ZNF506-dependent positive feedback loop regulates H2AX signaling after DNA damage.</a> Nat Commun. 9 (1), 2736(2018).</li>
<li>Ribeiro-Silva, C., Vermeulen, W., Lans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF%3A+Complex+complexes+in+genome+stability+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF: Complex complexes in genome stability and cancer.</a> DNA Repair. 77, 87-95 (2019).</li>
<li>Yang, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+epigenetic+regulation+in+plasticity+of+tumor+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of epigenetic regulation in plasticity of tumor immune microenvironment.</a> Front Immunol. 12, 640369(2021).</li>
<li>Miranda Furtado, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidrugs%3A+targeting+epigenetic+marks+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Epidrugs: targeting epigenetic marks in cancer treatment.</a> Epigenetics. 14 (12), 1164-1176 (2019).</li>
<li>Thomas, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+for+analysis+of+histone+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry%3A+best+practices+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide for analysis of histone post-translational modifications by mass spectrometry: best practices and pitfalls.</a> Methods. 184, 53-60 (2020).</li>
<li>Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+characterization+of+histones+in+clinical+samples%3A+applications%2C+progress%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges.</a> FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).</li>
<li>Kwak, H. G., Dohmae, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+histone+variants+in+the+mouse+testis+by+mass+spectrometry-based+top-down+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Trends%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of histone variants in the mouse testis by mass spectrometry-based top-down analysis.</a> Biosci Trends. 10, 357-364 (2016).</li>
<li>Sidoli, S., Simithy, J., Karch, K. R., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+resolution+data-independent+acquisition+in+an+LTQ-Orbitrap+allows+for+simplified+and+fully+untargeted+analysis+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-Orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications.</a> Anal Chem. 87, 11448-11454 (2015).</li>
<li>Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction%2C+purification+and+analysis+of+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Extraction, purification and analysis of histones.</a> Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).</li>
<li>Basak, S. K., Ladisch, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+electrophoretic+mobilities+of+proteins+and+peptides+with+their+physicochemical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Correlation of electrophoretic mobilities of proteins and peptides with their physicochemical properties.</a> Anal Biochem. 226 (1), 51-58 (1995).</li>
<li>Nuccio, A. G., Bui, M., Dalal, Y., Nita-Lazar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+methodology+for+identification+of+native+histone+variant+modifications+from+mammalian+tissues+and+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based methodology for identification of native histone variant modifications from mammalian tissues and solid tumors.</a> Methods Enzymol. 586, 275-290 (2017).</li>
<li>Zhang, S., Roche, K., Nasheuer, H. P., Lowndes, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+histones+by+sugar+%CE%B2-N-acetylglucosamine+%28GlcNAc%29+occurs+on+multiple+residues%2C+including+histone+H3+serine+10%2C+and+is+cell+cycle-regulated%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Modification of histones by sugar β-N-acetylglucosamine (GlcNAc) occurs on multiple residues, including histone H3 serine 10, and is cell cycle-regulated.</a> J Biol Chem. 286 (43), 37483-37495 (2011).</li>
<li>Perri, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+proteomics+reveals+novel+post-translational+modifications+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Histone proteomics reveals novel post-translational modifications in breast cancer.</a> Aging. 11, 11722-11755 (2019).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Omenn, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+on+the+human+proteome+reaches+a+major+milestone%3A+%3E90%25+of+predicted+human+proteins+now+credibly+detected%2C+according+to+the+HUPO+human+proteome+project%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Research on the human proteome reaches a major milestone: >90% of predicted human proteins now credibly detected, according to the HUPO human proteome project.</a> J Proteome Res. 19 (12), 4735-4746 (2020).</li>
<li>Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+characterization+of+histones+in+clinical+samples%3A+applications%2C+progress%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges.</a> FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).</li>
<li>Starkova, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+profile+of+post-translational+modifications+of+histone+H1+in+chromatin+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">The profile of post-translational modifications of histone H1 in chromatin of mouse embryonic stem cells.</a> Acta Naturae. 11 (2), 82-91 (2019).</li>
<li>García-Giménez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+carbonylation+occurs+in+proliferating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Histone carbonylation occurs in proliferating cells.</a> Free Radic Biol Med. 52 (8), 1453-1464 (2012).</li>
<li>García-Saura, A. G., Schüler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP10+multi-site+auto-+and+histone+MARylation+visualized+by+acid-urea+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">PARP10 multi-site auto- and histone MARylation visualized by acid-urea gel electrophoresis.</a> Cells. 10, 654(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,4-ditioeritritolo</td><td>SIGMA- ALDRICH</td><td>D8255&nbsp;</td><td>Reagente per il mantenimento &minus; Gruppi SH allo stato ridotto; riduce quantitativamente i disolfuri.</td></tr><tr><td>1,5 M tampone Tris-HCL, pH 8,8</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0798</td><td>tampone in gel risolutivo</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS&nbsp;</td><td>BIO-RAD&nbsp;</td><td>1610772</td><td>Utilizzare questo tampone di corsa premiscelato 10x Tris/glicina/SDS per separare i campioni di proteine mediante SDS-PAGE.</td></tr><tr><td>2-propanolo</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>33539</td><td>2-propanolo (isopropanolo) è un alcol secondario. È stato testato come sostituto del carburante per l'uso in varie celle a combustibile. La polvere di CuO disciolta in 2-propanolo è stata utilizzata per la sintesi assistita da ablazione laser di colloidi di Cu. La sospensione di 2-propanolo con Zn(NO3)2 è stata impiegata per la fabbricazione di fotoanodi in acciaio inossidabile rivestito di biossido di titanio (P25-TiO2/SS) rivestito con uno strato uniformemente spesso di P25-TiO2.Questo fotoanodo è stato utilizzato per il processo di degradazione fotocatalitica elettrochimica (ECPC).</td></tr><tr><td>Soluzione di acrilammide/bis al 30%&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1610158</td><td>2,6% di reticolante. Reagente di purezza per elettroforesi&nbsp;</td></tr><tr><td>Acido Acetico Glaciale</td><td>Carlo Erba Reagennts</td><td>401392</td><td>L'acido acetico è un importante reagente chimico con molte applicazioni industriali.</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Panreac Applichem</td><td>211007.1214</td><td>Acetone&nbsp; è un solvente, rinomato per la sua versatilità in varie applicazioni di laboratorio, produzione e pulizia.</td></tr><tr><td>Acetonitile</td><td>VWR</td><td>83640320</td><td>per HPLC &nbsp; Grado LC-MS</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td>Agarosio è un&nbsp; eteropolisaccaride&nbsp; Frequentemente usato in biologia molecolare.</td></tr><tr><td>Bicarbonato di ammonio</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A6141</td><td>minimo 99,0%</td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A3678</td><td>Per biologia molecolare, per elettroforesi, &ge; 98%&nbsp;</td></tr><tr><td>Bioruptor plus</td><td>Diagenode</td><td>B01020001 - B01020002- B01020003</td><td>sonicatore</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>SIGMA- ALDRICH</td><td>D9163-5G</td><td>Agente riducente utilizzato per ridurre i legami disolfuro nelle proteine.</td></tr><tr><td>Kit per macchie d'argento Dodeca&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0480</td><td>Il kit per la colorazione all'argento Dodeca è facile da usare per il rilevamento dei livelli di nonagram delle proteine nei gel di poliacrilammide.</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>GE - Healthcare Life Sciences</td><td>171325010L</td><td>Il glicerolo è un semplice composto triolo, è coinvolto per aiutare nella colata di gel a gradiente, stabilizzatore proteico e componente tampone di conservazione.</td></tr><tr><td>Fermare l'inibitore della fosfatasi&nbsp;</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>78428</td><td>Thermo Scientific Cocktail di inibitori della fosfatasi di arresto preserva lo stato di fosforilazione delle proteine durante e dopo la lisi cellulare o l'estrazione delle proteine tissutali. Cocktail monouso (100X).&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Fermare l'inibitore della proteasi&nbsp;</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>78430</td><td>Thermo Scientific Halt Protease Inhibitor Cocktail (100X) sono soluzioni madre concentrate pronte all'uso di inibitori della proteasi da aggiungere ai campioni per prevenire la degradazione proteolitica durante la lisi cellulare e l'estrazione delle proteine. Cocktail monouso (100X).&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H1758</td><td>BioReagent, per biologia molecolare</td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I6125</td><td>&ge; 99% (NMR),</td></tr><tr><td>cristallino KCl</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9541</td><td>Cloruro di potassio, KCl, è&nbsp; generalmente utilizzato nelle routine di laboratorio. Il suo utilizzo come tampone di conservazione per gli elettrodi di pH e come soluzione di riferimento per le misure di conducibilità è ben consolidato.</td></tr><tr><td>Linea cellulare MCF10</td><td>atcc</td><td>CRL-10317&nbsp;</td><td>linea cellulare epiteliale isolata nel 1984 dalla ghiandola mammaria di una donna bianca di 36 anni con mammelle fibrocistiche. Questa linea cellulare è stata depositata dalla Michigan Cancer Foundation.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>208337</td><td>Il cloruro di magnesio è un solido cristallino incolore.</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetrametiletilene-diammina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T9281</td><td>Per elettroforesi, circa il 99%</td></tr><tr><td>Tampone salino fosfato 1X</td><td>Corning</td><td>15373631</td><td>1 X PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) è&nbsp; un buffered&nbsp; soluzione salina bilanciata&nbsp; Utilizzato per una varietà di applicazioni biologiche e di coltura cellulare, come il lavaggio delle cellule prima della dissociazione, il trasporto di cellule o tessuti, la diluizione delle cellule per il conteggio e la preparazione dei reagenti.</td></tr><tr><td>Esacianoferrato di potassio</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>60299</td><td>Accettore di elettroni, impiegato in sistemi che coinvolgono il trasporto di elettroni,</td></tr> <tr><td>soluzione SDS 20% (p/v)&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0418</td><td>Sodio dodecil solfato. Reagente di purezza per elettroforesi&nbsp;</td></tr><tr><td>Tiosolfato di sodio, ReagentPlus 99%</td><td>SIGMA- ALDRICH</td><td>21,726-3</td><td>Tiosolfato di sodio, ReagentPlus 99%</td></tr><tr><td>Acido solforico</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>339741</td><td>Acido solforico, Reagente, è&nbsp; Un acido estremamente corrosivo che si presenta come un liquido giallo, leggermente viscoso. È solubile in acqua ed è un acido diprotico. Ha proprietà corrosive, disidratanti e ossidanti molto forti oltre ad essere igroscopico.</td></tr><tr><td>Acido tricloroacetico</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T6399-5G</td><td>L'acido tricloroacetico (TCA) è&nbsp; utilizzato come reagente per la precipitazione di proteine1,2 e acidi nucleici3.&nbsp;</td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico</td><td>Riedel-de Ha&euml; n</td><td>34957</td><td>Acido trifluoroacetico</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA- ALDRICH</td><td>T9284-1L</td><td>Triton X-100 è un tensioattivo poliossietilene non ionico che viene utilizzato più frequentemente per estrarre e solubilizzare le proteine.</td></tr><tr><td>Tripsina dal pancreas suino</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T6567</td><td>Proteomics Grade, BioReagent, Dimetilata</td></tr><tr><td>UREA</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>33247</td><td>L'urea è un agente caotropico e viene utilizzata per la denaturazione delle proteine. Disturba i legami idrogeno nella struttura secondaria, terziaria e quaternaria delle proteine. Può anche disturbare il legame idrogeno presente nella struttura secondaria del DNA</td></tr></tbody></table>

presentazione delle proteoforme istoniche con l'elettroforesi su gel 2d-tau

Unveiling Histone Proteoforms using 2D-TAU Gel Electrophoresis

Nella Figura 1A, è possibile osservare come le proteine istoniche migrano in un gel 1D. Questo è un importante passo preliminare per comprendere il tempo di esecuzione della prima dimensione. Una volta determinato il momento giusto di separazione, esegui la seconda dimensione. La mappa 2D delle proteoforme istoniche mostra un modello topografico distintivo (Figura 1B). Ogni punto nella Figura 1B rappresenta un tipo di istono specifico. Osservare l'esatta regione del gel in cui si trova ogni proteoforma istonica. L'identificazione della spettrometria di massa per ogni proteoforme istonico è riportata in Perri et al.32. Pertanto, ogni punto in questa condizione è associato a un tipo specifico di istodio. La presenza di ulteriori macchie, accanto a quelle canoniche, può indicare l'esistenza di nuove modificazioni. Le immagini su gel possono essere acquisite utilizzando la densitometria e l'immagine risultante può essere analizzata utilizzando un software di analisi delle immagini.
L'affidabilità della mappa TAU 2D dipende dalla rotondità del luogo. Se la corsa è stata eseguita correttamente, i punti appariranno come segnali distinti e non saranno visibili striature orizzontali e verticali. Al contrario, le impurità nel campione, nelle soluzioni e nella sovrapposizione di agarosio potrebbero causare striature e/o strisce nel gel. La qualità del gel influirà sulla digitalizzazione dell'immagine e sulla successiva analisi quantitativa e qualitativa. Inoltre, potrebbe influenzare il successo dell'analisi Western Blot e delle indagini sulla SM. Per verificare l'affidabilità del metodo, abbiamo sondato la membrana nitrocellulosica dei proteoformi istonici risolti con l'anticorpo primario Acetilato-Lisina (Ac-K2-100) Rabbit mAb32 (Figura 2). Un anticorpo secondario HRP anti-coniglio è stato utilizzato per rilevare i segnali istonici. Come previsto, utilizzando un densitometro, è possibile quantificare la peculiare modificazione post-traduzionale su ogni variante istonica presente nel blot.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67321/67321fig01.jpg"> 
Figura 1: TAUgel 1D e 2D. (A) Immagine rappresentativa del modello topografico degli istoni ottenuta utilizzando TAUgel 1D. (B) Immagine rappresentativa del pattern topografico istonico ottenuta utilizzando 2D TAUgel. Le identificazioni dei dati sono riportate da Perri et al. 32. Come previsto, ogni punto rappresenta una specifica proteoforma istonica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67321/67321fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67321/67321fig02.jpg"> 
Figura 2: Western blot rappresentativo di 2DTAU. Nell'immagine è possibile osservare il livello di acetilazione della lisina in ogni proteoforme istonico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67321/67321fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagenti</td>
			<td>Concentrazione: 15%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrilammide/bis</td>
			<td>3.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,5 M Tris pH 8,8</td>
			<td>2,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ acqua</td>
			<td>3,6 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% APS</td>
			<td>50 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>5 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Risoluzione della composizione della soluzione in gel.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Passo</td>
			<td>Ore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fissaggio 50% metanolo / 5% acido acetico</td>
			<td>1 ora</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lavare con etanolo al 30%</td>
			<td>2 x 20 minuti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lavare l'acqua deionizzata</td>
			<td>1 x 20 minuti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sensibilizzante Reagente tiosolfato</td>
			<td>1 minuto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lavare l'acqua deionizzata</td>
			<td>3 x 20 secondi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argento Nitrato d'argento</td>
			<td>30 minuti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lavare l'acqua deionizzata</td>
			<td>3 x 1 minuto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sviluppo Sviluppatore</td>
			<td>25-30 min Nota: sviluppare il gel fino a quando le macchie sono visibili (marrone chiaro)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>soluzione di arresto</td>
			<td>1 x 10 minuti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lavare l'acqua deionizzata</td>
			<td>2 x 5 minuti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lavare l'acqua deionizzata</td>
			<td>1 ora</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2: Metodo di colorazione dell'argento.

Presentazione delle proteoforme istoniche con l'elettroforesi su gel 2D-TAU

Histones undergo various post-translational modifications (PTMs) such as methylation, acetylation, phosphorylation, acylation, and ubiquitination, which ...

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