Imaging longitudinale intravitale della dinamica vascolare nel midollo osseo calvariale

Questa ricerca si concentra sulla comprensione delle dinamiche vascolari nel macroambiente del midollo osseo utilizzando la microscopia intravitale, con l'obiettivo di rivelare come i vasi sanguigni rispondono all'emopoiesi normale e patologica. Utilizziamo tecnologie di imaging avanzate come la fotomicroscopia, modelli animali transgenici e analizziamo un tracciante per visualizzare e quantificare i cambiamenti vascolari dinamici nei tessuti viventi nel tempo. Il progresso chiave è un perfezionamento del nostro protocollo per migliorare il benessere degli animali e allinearsi con le tre R. Il nostro approccio longitudinale riduce al minimo le fasi chirurgiche e riduce significativamente il numero di animali necessari per il nostro studio.

Il nostro protocollo risponde alla necessità di un imaging intravitale non tossico a lungo termine utilizzando un microscopio a due fotoni, che consente la penetrazione profonda dei tessuti e la visualizzazione ad alta risoluzione del comportamento e dell'interazione cellulare. L'utilizzo dell'impianto della testa stampato in 3D renderà molto facile trovare l'area di interesse durante la sessione di imaging longitudinale senza mirare a modificare l'altezza, l'angolo o l'ordine. Attualmente stiamo utilizzando questo protocollo per tracciare specifici sottotipi endoteliali e la loro risposta allo sviluppo della leucemia e al trattamento farmacologico per comprendere meglio il loro contributo sulla patogenesi della malattia.

Per iniziare, avvia il software di segmentazione e importa i file DICOM micro-CT per isolare il cranio. Esegui la segmentazione basata su soglie per separare il tessuto osseo dalle strutture circostanti. Regola manualmente le regioni complesse o rumorose per perfezionare la segmentazione.

In 3D Slicer, importare i file DICOM e caricare il set di dati. Osservare le sezioni CT nelle viste assiale, sagittale e coronale. Apri l'editor di segmenti e fai clic su Aggiungi per creare una nuova segmentazione, quindi fai di nuovo clic su Aggiungi per creare un nuovo segmento per la soglia.

Nel pannello dell'editor dei segmenti, fai clic sull'effetto soglia. Regolare i cursori della soglia inferiore e superiore o immettere valori numerici per evidenziare la regione segmentata in rosso. Per esportare il teschio segmentato come file stl, passare al modulo di segmentazione.

Assicurati che il segmento con soglia sia selezionato. Nella sezione esporta/importa modelli e mappe etichettate, imposta il tipo di esportazione su modelli e il formato del file su stl, quindi fai clic su Esporta per salvare il file. Per la preparazione del modello del cranio in CAD, importare prima il modello del cranio semplificato in formato stl nel software CAD come nuova parte o modello.

Nel piano mediano, creare un asse tangente alla calvaria, quindi salvare il modello di cranio preparato. Create uno schizzo nel piano calvariale e disegnate una spline a forma di pera da PA più 6,5 a meno due. Con una larghezza di sei millimetri a AP 0,0, questo sarà il contorno della superficie osservabile.

Progettare la coda dell'impianto assicurandosi che si adatti alla struttura del cranio per una corretta fissazione rispettando il volume disponibile. Infine, creare una copertura protettiva per salvaguardare la finestra di osservazione quando non viene utilizzata. Posiziona un mouse anestetizzato su un termoforo impostato a 37 gradi Celsius e monitora visivamente la frequenza respiratoria.

Radi la testa del topo con un rasoio elettrico. Quindi applicare una goccia di gel oftalmico sugli occhi del topo. Assicurarsi che tutti i peli siano stati rimossi per evitare artefatti di imaging e ridurre il rischio di infezione della ferita.

Ora, usa un paio di pinze sterili e forbici per praticare una piccola incisione nella parte centrale del cuoio capelluto per esporre la cicatrice ossea centrale. Rimuovere il tessuto connettivo tra il cranio e il cuoio capelluto. Mescola una quantità sufficiente di cemento dentale in una capsula di Petri per ottenere una pasta.

Applicarlo rapidamente alla base dell'impianto di fissazione della testa. Senza permettere al cemento dentale di entrare nell'area di imaging, posizionare il supporto per la testa sul cranio esposto e lasciarlo solidificare. Attivare il flusso di isoflurano verso la maschera stereotassica del microscopio.

Ora, porta rapidamente il mouse al microscopio. Inserire con cautela i denti del topo nella maschera per garantire una corretta penetrazione dell'isoflurano sollevando il naso con una mano. Tenendo il mouse con una mano, infilare delicatamente la coda di rondine dell'impianto di fissazione della testa nel supporto di fissaggio usando l'altra mano.

Fissarlo con mezzo giro della manopola a vite. Successivamente, introdurre una sonda rettale pre-incorporata con un gel a base d'acqua per monitorare la temperatura del topo. Riempire la camera di imaging della testa con una grande quantità di gel a base d'acqua, o PBS.

Abbassare l'obiettivo a immersione in acqua fino a quando non è completamente immerso per un'eccitazione e un rilevamento ottimali del segnale durante l'eccitazione a due fotoni. Sposta lo stadio x, y e l'unità z per concentrarti sull'osso centrale nella cicatrice dell'impalcatura. Identificare il tessuto contrassegnato dalla superficie ossea e dalla vena centrale.

Spegnere la luce nella stanza e chiudere la scatola attorno al supporto del microscopio. Dopo l'attivazione dei rivelatori non TOSCAN. Impostare PMT1 per rilevare il secondo SHG da 423 a 461 nanometri, D2 alto per GFP da 485 a 548 nanometri e D3 alto per TD D'Amato da 551 a 645 nanometri.

Lasciate l'offset a zero. Ora, imposta il guadagno PMT SHG a 850 volt e l'alto guadagno D al 100%Aumenta la potenza del laser a infrarossi fino a quando un'immagine con una gamma dinamica di 200 livelli di grigio è visibile sul più basso dei tre canali. Nel software di acquisizione, la regione del localizzatore contiene tasche di midollo osseo, indicate racchiuse all'interno delle superfici ossee.

Per identificare le diverse regioni di interesse, o ROI, attivare Loss Navigator e creare una panoramica utilizzando la modalità a spirale. Fare clic sull'icona dell'immagine singola per registrare le posizioni ROI selezionate e rinominare ciascuna posizione nell'elenco delle attività. Per acquisire un volume di stack Z, selezionare la modalità stack Z e definire la dimensione del passo a tre micrometri.

Deseleziona l'opzione della stessa dimensione della pila per tutte le regioni, quindi premi inizio per iniziare e fine per finire. Dopo l'acquisizione, fate clic su Ridefinisci pila. Premere start per avviare la raccolta delle immagini e salvare le immagini nella cartella appropriata.

Per misurare una caratteristica dinamica, come la permeabilità vascolare, modificare la modalità di acquisizione in XYZT per acquisire un intervallo di tempo. Nel modulo T, regolare l'intervallo di tempo a tre minuti e la durata a un'ora. Ora, iniettare 100 microlitri di destrano TRITC da 70 kilodalton per via endovenosa a una concentrazione di quattro milligrammi per millilitro e iniziare l'acquisizione.

Dopo aver trasferito il mouse su un segno chirurgico su un termoforo a 37 gradi Celsius, applicare il gel intrasite sul cranio per mantenerlo idratato. Chiudere l'area di imaging dell'impianto cranico con l'apposito coperchio e fissare accuratamente il coperchio con una vite. Posiziona il mouse nella scatola di riscaldamento impostata a 37 gradi Celsius e attendi che si risvegli.

Una volta che il topo si è completamente ripreso, trasportarlo alla struttura per animali e sistemarlo in una gabbia pulita con idrogel e arricchimento ambientale. Per le acquisizioni longitudinali, posizionare una piccola goccia di gel oftalmico sugli occhi di un topo con un supporto per la testa già installato. Ottenere l'immagine di panoramica come illustrato in precedenza.

Se necessario, riallineare le immagini precedenti e nuove utilizzando il modulo di caricamento e allineamento delle immagini. Apri l'immagine di cattura dello schermo per contrassegnare le posizioni nella loro posizione originale. Il modello CAD di un impianto di fissazione della testa in titanio è stato progettato per adattarsi alla struttura anatomica del cranio, garantendo un fissaggio stabile al tavolino del microscopio per l'imaging a livello cellulare.

L'impianto è stato attaccato con successo al cranio del topo e ha consentito un imaging stabile nel tempo, consentendo al topo di mantenere le normali attività. La vascolarizzazione del midollo osseo calvario è stata visualizzata utilizzando una scansione a piastrelle, rivelando una complessa rete di arteriole, capillari di transizione e sinusoidi. L'analisi quantitativa dei vasi ha dimostrato la segmentazione delle strutture vascolari, consentendo la misurazione del diametro, della lunghezza e della rettilineità dei vasi e la loro correlazione.

L'imaging longitudinale ha catturato il rimodellamento progressivo della vascolarizzazione calvariale durante la progressione della leucemia con aumento della densità vascolare osservato nel tempo. La permeabilità vascolare è stata valutata dinamicamente, mostrando una ritenzione differenziale del colorante fluorescente nel tempo, mostrando una permeabilità differenziale di diversi vasi del midollo osseo.