Name: Microbiota dei giardini delle formiche di Attine: visualizzazione di un paesaggio microbico mediante microscopia elettronica a scansione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Esplora il microbiota dei giardini fungini di formiche attine mediante microscopia elettronica a scansione. Questo metodo ottimizzato preserva le delicate strutture dei biofilm e rivela l'organizzazione spaziale dei microrganismi.

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<meta charset="utf8"></head><body> Analisi SEM su microscala delle comunità microbiche in colture di formiche che coltivano funghi

Gli ecosistemi sono composti da organismi interconnessi da processi in una specifica posizione geografica (ad esempio, l'ambiente). Gli organismi interagiscono con il loro ambiente nel tempo, da cui emergono modelli spaziali complessi ed eterogenei. La modellazione spaziale determina la diversità e la stabilità ecologica e, in ultima analisi, il funzionamento dell'ecosistema 1,2,3,4. Negli ecosistemi su macroscala, come le zone umide, le savane, le barriere coralline e gli ecosistemi aridi, i modelli spaziali sono correlati al flusso e alla concentrazione delle risorse. Consentendo l'ottimizzazione delle risorse, l'eterogeneità spaziale e la modellizzazione si ottengono ecosistemi più resilienti rispetto a quelli omogenei2. La localizzazione spaziale degli organismi, essendo alla base dell'ecologia di comunità, viene tradotta anche nel mondo microbico.
Gli ecosistemi microbici, lontani da organismi mescolati casualmente e in modo omogeneo in tutti i microhabitat, mostrano modelli spaziali che definiscono gran parte del loro funzionamento 5,6,7. Dalle colonne di Winogradsky al microbiota associato all'ambiente e all'ospite, questi ecosistemi sono organizzati in modo eterogeneo nello spazio, con disposizioni spaziali che suscitano diverse risposte fenotipiche. Le specie conviventi hanno maggiori probabilità di interagire e influenzare la fisiologia dell'altra. Così, l'organizzazione spaziale della comunità, più che la sua composizione di per sé, delimita le proprietà dell'ecosistema e le nicchie ecologiche 5,7,8. Illustrando questi concetti, i cambiamenti nel pattern spaziale sembrano correlati alla progressione patologica delle placche dentali, della carie, delle malattie gengivali 9,10, delle malattie infiammatorie intestinali11, delle infezioni polmonari da fibrosi cistica, delle infezioni croniche delle ferite12,13, del cancro del colon-retto e degli adenomi14.
Nell'ambito della biogeografia microbica (lo studio della distribuzione e della modellizzazione della biodiversità nello spazio e nel tempo su microscala), la conoscenza degli ecosistemi microbici è enormemente avvantaggiata dalla comprensione dei loro modelli spaziali 6,13,15,16,17. Abbiamo esaminato i modelli spaziali di un ecosistema microbico costruito da insetti, che si trova al centro delle carismatiche colonie di formiche attine (Hymenoptera: Formicidae: Myrmicinae: Attini: Attina) che crescono funghi. Lì risiede un "giardino microbico", incentrato su un fungo basidiomicete della tribù Leucocoprinae (Basidiomycota: Agaricaceae) o della famiglia Pterulaceae (Basidiomycota: Agaricales)18,19,20,21,22. Il giardino è una struttura spugnosa che emerge da una rete intrecciata di ife che cresce metabolizzando il substrato per lo più vegetale incorporato dalle formiche (Figura 1). Questi possono includere, secondo i generi attini: parti secche di piante, escrementi e carcasse di insetti, foglie appena tagliate, semi e parti floreali23,24. Analogamente a un intestino erbivoro esterno, l'orto converte enzimaticamente e chimicamente i polimeri recalcitranti in risorse nutritive labili, fornendo alle formiche aminoacidi essenziali, lipidi e zuccheri solubili 21,25,26,27,28.
Le analisi ultrastrutturali, enzimatiche e trascrittomiche effettuate per giardini dei generi Atta e Acromyrmex suggeriscono che questi ambienti strutturano un continuum di degradazione del substrato e macchie nutrizionali 26,29,30,31,32. Le parti giovani del giardino tendono ad essere più scure a causa del substrato appena incorporato dopo essere stato frammentato. Questi substrati aggiunti di recente sono spesso colonizzati dai bordi, che sono stati tagliati dalle formiche operaie e inoculati con grumi miceliali. Irradiandosi dai bordi tagliati, le ife fungine si diffondono sul substrato 29,32,33. L'abbondanza ife aumenta con il progredire della degradazione del substrato, con conseguente comparsa di regioni biancastre e metabolicamente attive 30,31,32. Le regioni più vecchie, con substrato più degradato e un abbondante microbiota29,32, tendono a presentare toni brunastri e maggiore umidità. I lavoratori rimuovono i frammenti di questa regione, separandoli in cumuli di rifiuti, dove prendono anche substrati che danneggiano il simbionte fungino 34,35,36. I cumuli di rifiuti, anche se fisicamente staccati dal giardino, sono un punto di continua degradazione del substrato e di ciclo dei nutrienti da parte dell'abbondante microbiota abitante 29,32,37,38,39.
Un microbiota composto principalmente da Enterobacter, Klebsiella, Pantoea, Pseudomonas e Serratia, abita anche il giardino, apparentemente condiviso da diversi sistemi di fungicoltura attina. Codificando vie metaboliche che potrebbero integrare il metabolismo fungino, il microbiota partecipa potenzialmente alle risposte fisiologiche del giardino 40,41,42,43,44. Non solo i dati metagenomici indicavano che il microbiota era presente 41,42, ma anche l'analisi al microscopio elettronico a scansione (SEM) della fungicoltura delle formiche tagliafoglie ha mostrato per lo più batteri a forma di bastoncino sul substrato vegetale32. Sebbene i batteri (compresi i ceppi cellulolitici) fossero isolati dall'intero giardino, venivano visualizzati solo nelle parti più vecchie del giardino e nei cumuli di rifiuti, così come nel pellet iniziale trasportato dalle regine fondatrici29,32. Era anche incerto se il microbiota potesse formare biofilm in vivo (cioè in giardino e nei rifiuti), come suggerito dalla loro capacità metabolica42 e osservato in vitro44.
Qui, abbiamo impiegato il SEM per comprendere ulteriormente l'organizzazione spaziale del microbiota nelle regioni del giardino, dettagliando le interazioni fisiche microbiota-substrato e microbiota-ife. Fornendo immagini con una maggiore profondità focale, il SEM consente osservazioni di strutture microscopiche tridimensionali ad alta risoluzione, consentendo un'analisi approfondita dei modelli spaziali del microbiota del giardino. Descriviamo in dettaglio i passaggi per fissare, disidratare, asciugare, polverizzare il pelo e visualizzare campioni a base fungina così eterogenei e delicati. Rimuovendo la fase di postfissazione utilizzando tetrossido di osmio (OsO4) e riducendo il tempo di disidratazione, abbiamo semplificato i protocolli 32,33,45 per la preparazione di campioni di giardino e rifiuti per l'analisi SEM. Questo protocollo adattato preserva i modelli strutturali ifali, nonché l'organizzazione spaziale del microbiota e del biofilm, e potrebbe essere applicato ad altri delicati ecosistemi microbici e biofilm.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67334/67334fig01v2.jpg"> 
Figura 1: Giardini microbici di Attine. Il giardino è una struttura spugnosa risultante da una rete intrecciata di ife che cresce metabolizzando il substrato per lo più vegetale incorporato dalle formiche. Abita il giardino anche il microbiota, che codifica le vie metaboliche che potrebbero integrare il metabolismo fungino. I dati metagenomici e le precedenti analisi di microscopia elettronica a scansione indicavano la sua presenza, anche se avevamo scarsa conoscenza della sua organizzazione spaziale e delle interazioni fisiche con il substrato e le ife fungine. Abbiamo impiegato il SEM per svelare l'organizzazione spaziale e il pattern del microbiota e del biofilm. Illustrazioni di Mariana Barcoto (giardino e microbiota adattati da Barcoto e Rodrigues 94) e foto di Mariana Barcoto ed Enzo Sorrentino. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67334/67334fig01largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Provetta da 2 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C-BRA</td><td>Per fissare e disidratare i campioni</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio anidro</td><td>Merck</td><td>C4901</td><td>CaCl2 anidro per preparare Karnovsky' s fissativo</td></tr><tr><td>Essiccatore per punti critici</td><td>Leica</td><td>EM CPD 300</td><td>Per l'essiccazione dei punti critici</td></tr><tr><td>Nastro biadesivo conduttivo in carbonio, 12 mm (L) X 5 M (L)</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>77819-12</td><td>Per il montaggio di campioni</td></tr><tr><td>Pinze entomologiche</td><td>Nessun fornitore</td><td></td> specifico <td>Per manipolare campioni da giardino</td></tr><tr><td>Alcool etilico (=etanolo), puro (&ge; 99,5%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td>Per la disidratazione</td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Nessun fornitore</td><td></td> specifico <td>Per manipolare campioni da giardino</td></tr><tr><td>Bicchiere di vetro</td><td>Nessun fornitore</td><td></td> specifico <td>Per la disidratazione</td></tr><tr><td>Piastra di Petri in vetro</td><td>Nessun fornitore</td><td></td> specifico <td>Per manipolare campioni da giardino</td></tr><tr><td>Pipetta in vetro</td><td>Nessun fornitore</td><td></td> specifico <td>Per fissare e disidratare i campioni</td></tr><tr><td>Glutaraldeide (Glutaraldeide acquosa EM Grado 25%)</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>16220</td><td>Per preparare Karnovsky' s fissativo</td></tr><tr><td>Obiettivo dell'oro&nbsp;</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>8071</td><td>Per spruzzare con oro</td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Per regolare le soluzioni pH</td></tr><tr><td>Editor di immagini</td><td>Photoshop</td><td>qualsiasi versione</td><td>Per regolare le immagini</td></tr><tr><td>Paraformaldeide (Paraformaldeide 20% Soluzione acquosa Grado EM)</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>15713</td><td>Per preparare Karnovsky' s fissativo</td></tr><tr><td>Destinatario di propilene</td><td>Nessun fornitore</td><td></td> specifico <td>Per il mantenimento in vita di colonie di formiche</td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a scansione</td><td>JEOL&nbsp;</td><td>IT300 SEM</td><td>Per l'imaging del campione&nbsp;</td></tr><tr><td>Cacodilato di sodio triidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td>Per la preparazione di tampone di cacodilato di sodio</td></tr><tr><td>Spatola</td><td>Nessun fornitore</td><td></td> specifico <td>Per manipolare campioni da giardino</td></tr><tr><td>Contenitori per campioni con diametro 15 mm x 10 mm di altezza</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>4591</td><td>Per l'essiccazione del punto critico</td></tr><tr><td>Sputter coater</td><td>Baltec&nbsp;</td><td>SCD 050</td><td>Per rivestire con oro</td></tr><tr><td>Stub (montaggio in alluminio, perno a estremità piatta) 12,7 mm x 8 mm&nbsp;</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>75520</td><td>Per il montaggio di campioni</td></tr></tbody></table>

microbiota dei giardini delle formiche di attine: visualizzazione di un paesaggio microbico mediante microscopia elettronica a scansione

Microbiota of Attine Ants' Gardens: Visualizing a Microbial Landscape by Scanning Electron Microscopy

Qui, abbiamo presentato un protocollo semplificato per visualizzare i componenti del giardino di attine e i campioni di scarto, come ife fungine, substrato, microbiota e biofilm. Il SEM ha migliorato la nostra comprensione di come il giardino e i rifiuti impalcano i modelli strutturali del microbiota (Figura 3). Nei giardini attini, le ife fungine sono strutture simili a rami che coprono porzioni della superficie del substrato. Poiché le ife fungine tendono ad essere molto sensibili alla disidratazione e alla rottura, l'utente può essere guidato dall'aspetto delle ife per valutare i risultati della preparazione del campione. Come osservato anche nei lavori precedenti 32,33,45, le ife presentano un aspetto tubolare; ife intatte a forma di tubo indicano un'efficace preparazione del campione (Figura 3A e Figura 4C). Quando le ife sono a forma di nastro, tale appiattimento è probabilmente un artefatto della tecnica (Figura 4C).
Le superfici del substrato vegetale possono essere riconosciute dagli strati cuticolari ed epidermici, nonché dagli stomi e dai tricomi. Tali strutture sono più riconoscibili quando i substrati non sono ancora colonizzati dalle ife fungine e dal microbiota (Figura 3A e Figura 4C). Quando il substrato viene colonizzato, il microbiota e/o le ife fungine coprono la sua superficie in modo tale che le strutture vegetali specifiche non sono facilmente distinguibili (Figura 3A). Il microbiota può colonizzare le ife fungine o il substrato, ognuno di questi in un'organizzazione spaziale apparentemente distinta. Nella Figura 3, tali modelli spaziali sono stati illustrati schematicamente e inscatolati nelle rispettive immagini SEM dove sono stati identificati; ciò può facilitare il collegamento tra i risultati del SEM e la loro interpretazione.
I microbioti colonizzatori ifani sono meno comunemente osservati e, quando trovati, sono composti da bastoncelli o cellule coccoidi che si trovano isolati o in piccoli gruppi attaccati alla superficie ifale. Si può osservare una matrice esopolisaccaridica (EPS) di biofilm, che assomiglia a una struttura di "tessuto di pizzo", che circonda le ife in piccoli grumi (Figura 3A). Abbastanza più comune è il microbiota che colonizza il substrato, che si trova nei giardini di diverse specie di formiche attine. I modelli di colonizzazione sembrano definiti in una certa misura dalle fasi di deterioramento del substrato. Pertanto, durante la colonizzazione di substrati non ancora degradati, il microbiota può presentarsi come singole cellule o riunirsi in piccoli gruppi. Il microbiota può stratificare il substrato quando presenta segni microscopici di deterioramento (ad esempio, quando gli strati cuticolari/epidermici delle piante e altre strutture vegetali non sono distinguibili e i solchi e le rientranze sono abbondanti).
In questi "tappeti microbici", la morfologia delle cellule è più riconoscibile quando la matrice EPS è assente. Nei casi in cui le cellule microbiche sono incorporate nella matrice EPS, la loro morfologia non è facilmente distinguibile. In base alla loro organizzazione spaziale, abbiamo caratterizzato i biofilm come "diffusi" o come "tridimensionali". Quando il biofilm viene diffuso, le cellule microbiche e la matrice EPS coprono in modo intermittente la superficie del substrato, formando uno strato piatto dello spessore di 1-3 cellule (Figura 3B). Quando il biofilm è tridimensionale, le cellule microbiche e la matrice EPS si accumulano, formando cluster con spessori di diverse cellule. Le regioni giardino costituite da substrati deteriorati (come vecchi giardini e rifiuti) ospitano il microbiota nei suoi solchi e nelle sue rientranze, dove formano spesse comunità (Figura 3C). In particolare, i substrati ampiamente degradati nei campioni di rifiuti ospitano un microbiota abbondante, il più morfologicamente diversificato tra tutte le regioni. I lieviti aggiungono più complessità a questa comunità, interagendo fisicamente con i procarioti tramite biofilm. Nei campioni di scarto di Atta sexdens e Acromyrmex sp., le matrici EPS sono state osservate formare un cospicuo reticolo fibrillare che circonda procarioti a forma di bastoncino e coccoidi, nonché lieviti fusiformi e sferici (Figura 3C).
Risultante da una rete intrecciata di ife, la struttura spugnosa del giardino richiede un'ulteriore sputtering per rivestire il campione in modo più uniforme. Tali passaggi evitano la dispersione di elettroni che distorce l'immagine e ne ostacola la risoluzione (Figura 4A). Le fasi di preparazione dei campioni hanno preservato la maggior parte della struttura del giardino, svelando la distribuzione spaziale e l'organizzazione del microbiota. Vale la pena ribadire, però, che strutture come le ife fungine e la matrice EPS sono molto sensibili alla disidratazione e molto difficili da preservare, soprattutto per il SEM. La struttura ifali era relativamente ben conservata, ma è ragionevole considerare che il biofilm visualizzato in alcuni campioni di giardino potrebbe essere privo di alcuni componenti strutturali della matrice EPS. Sebbene lo strato più esterno liscio di polisaccaridi che racchiudeva il microbiota fosse conservato in alcuni campioni (Figura 3A, B), alcuni di essi avevano conservato le caratteristiche morfologiche del microbiota ma non avevano una matrice EPS. Tuttavia, non è chiaro se la matrice EPS fosse effettivamente assente o se sia stata rimossa durante la preparazione del campione.
Da un lato, la rimozione dello strato liscio del biofilm compromette la comprensione della struttura precisa del biofilm. D'altra parte, rivela la morfologia, l'organizzazione spaziale e le interazioni fisiche delle cellule che vivono sotto lo strato, che è il nostro principale obiettivo di ricerca. Studi precedenti hanno riportato la conservazione sia delle ife fungine che della matrice del biofilm impiegando il vapore di tetrossido di osmio (OsO4) come fissativo primario 44,50,51,52,53,54. Quindi, abbiamo condotto un esperimento comparativo fissando campioni di giardino fresco con vapore di OsO4, che apparentemente ha preservato l'aspetto liscio dei biofilm (Figura 4B). Questo metodo, tuttavia, ha causato un esteso appiattimento delle ife e del microbiota. Questo appiattimento ha comportato la perdita degli aspetti spaziali generali del giardino descritti in precedenza 29,33,32,45, limitando così ulteriori studi sui modelli strutturali del giardino. Il fissaggio con OsO4 ha reso difficile sia distinguere la morfologia e la distribuzione microbica sia differenziare le strutture cellulari dagli artefatti tecnici, complicando così l'interpretazione dei dati.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67334/67334fig03v2.jpg"> 
Figura 3: Modelli architettonici del microbiota. Il microbiota colonizza le ife fungine e il substrato in un'organizzazione spaziale distinta. Tali pattern spaziali sono stati schematicamente illustrati e sono stati inscatolati nelle rispettive immagini SEM dove sono stati identificati (delimitati nella figura da quadrati bianchi): (A) I microbiota colonizzatori ifali sono composti da isolati o piccoli gruppi di cellule, con matrice esopolisaccaridica biofilm rilevabile in alcuni campioni. (B) Il microbiota che colonizza il substrato si diffonde in tutto il substrato, con la matrice EPS che copre le cellule in modo tale che la loro morfologia non sia facilmente distinguibile. (C) Microbiota che colonizza il substrato formando gruppi tridimensionali, costituenti biofilm mono o multimorfologici, in alcuni casi evidenziando la matrice EPS. Illustrazioni di Mariana Barcoto. Abbreviazione: EPS = matrice esopolisaccaridica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67334/67334fig03largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67334/67334fig04v2.jpg"> 
Figura 4: Imaging infruttuoso. Immagini di bassa qualità che restituiscono risultati inefficaci e/o ostacolano l'interpretazione dei modelli architettonici. (A) La diffusione di elettroni distorce l'immagine, ostacolandone la risoluzione e, di conseguenza, l'identificazione morfologica. Questo è stato osservato frequentemente nei campioni rivestiti con polverizzazione catodica solo una volta ed è stato ridotto da un rivestimento aggiuntivo. (B) Il fissaggio di campioni di giardino fresco con vapore di tetrossido di osmio (OsO4) come fissativo primario 44,50,51,52,53,54 ha apparentemente preservato l'aspetto liscio dei biofilm. Tuttavia, ha causato l'appiattimento esteso delle ife e del microbiota, danneggiando i modelli architettonici dei giardini. (C) La preparazione del campione con il fissativo di Karnovsky ha prodotto immagini di qualità superiore rispetto alle preparazioni con OsO4, preservando la maggior parte della struttura ifale, la distribuzione del microbiota e i modelli spaziali dei giardini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67334/67334fig04largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Microbiota dei giardini delle formiche di Attine: visualizzazione di un paesaggio microbico mediante microscopia elettronica a scansione

In macroscale ecosystems, such as rainforests or coral reefs, the spatial localization of organisms is the basis of our understanding of community ...

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