Screening e isolamento dei batteri intestinali che scindono il glicoside C

Lo scopo della nostra ricerca è il micro test virale per la medicina. Stiamo cercando di stabilire una SOP efficace per lo screening e l'isolamento dei batteri intestinali. Ad oggi, sono stati trovati un totale di 18 ceppi batterici con funzione di glicina.

Il vantaggio del nostro protocollo è l'uso di un terreno di origine a basse emissioni di carbonio per indurre l'attività batterica e quindi aumentare il tasso di successo dello screening. Per iniziare, preparare le soluzioni A, B e C separatamente, utilizzando gli appositi reagenti. Mescolare tutte e tre le soluzioni in un pallone da 1.000 millilitri e aggiungere acqua distillata fino a ottenere un volume finale di 1.000 millilitri.

Quindi regolare il pH a 7,2, utilizzando una soluzione di idrossido di sodio al 10%. Distribuire il terreno in fiasche da 250 millilitri. Quindi, aggiungere da una al 2% di coclea al mezzo anaerobico generale in una delle fiasche di Erlenmeyer da 250 millilitri.

Autoclavare il fluido a 121 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo che il terreno si è raffreddato a temperatura ambiente, conservarlo a quattro gradi Celsius. Prepara un terreno a basso tenore di carbonio, allo stesso modo, ma ometti l'estratto di lievito, il glucosio e l'amido solubile.

Per le soluzioni di riferimento, pesare cinque milligrammi, ciascuno di orientina e luteolina. Scioglierli separatamente in un millilitro di dimetilsolfossido per ottenere una concentrazione di cinque milligrammi per millilitro. Per iniziare, prepara tutti i terreni e i reagenti necessari per la procedura.

Raccogli uno o due grammi di feci umane fresche in una provetta sterile monouso per la raccolta delle feci, riempita con azoto gassoso. Aggiungere cinque millilitri di terreno anaerobico generale al tubo. Sigillare accuratamente la provetta e incubarla a 37 gradi Celsius per 24 ore in un'incubatrice anaerobica sterile.

Dopo 24 ore, trasferire 0,5 millilitri di sospensione batterica intestinale umana in una nuova provetta per microcentrifuga, contenente 4,5 millilitri di GAM fresco. Sigillare la provetta e incubarla a 37 gradi Celsius per 24 ore in condizioni anaerobiche per ottenere una flora intestinale umana mista attiva. Successivamente, mescolare 260 microlitri di flora intestinale attivata con sei millilitri di terreno fresco a basso tenore di carbonio contenente 40 microlitri di soluzione di riferimento orientante.

Incubare il terreno inoculato a 37 gradi Celsius. Includere un controllo e un gruppo vuoto oltre al campione. Dopo 24 ore e 48 ore, pipettare un millilitro della soluzione di reazione in una provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Centrifugare la provetta a 13, 400 g per 15 minuti a temperatura ambiente per rimuovere i batteri. Aggiungere 200 microlitri di surnatante a 600 microlitri di metanolo. Mescolare accuratamente e centrifugare la provetta a 13, 400 g per 15 minuti a temperatura ambiente per eliminare le proteine.

Ora, filtra il surnatante, usando una membrana microporosa da 0,22 micrometri. Analizza il filtrato tramite cromatografia liquida ad alte prestazioni o HPLC. Utilizzare l'acetone nitrolo come fase mobile A e lo 0,1% di acido formico in acqua purificata come fase mobile B.Mantenere la colonna di temperatura a 40 gradi Celsius durante l'analisi HPLC e impostare la portata a un millilitro al minuto.

Per isolare i singoli ceppi, attivare la flora batterica intestinale umana mista in grado di scindere l'orientina, come descritto in precedenza. Riscaldare il GAM solido per scioglierlo e versarlo in piastre di Petri sterili monouso all'interno di un incubatore anaerobico. Lasciare solidificare il fluido per ottenere piastre GAM solide.

Pipettare 100 microlitri di soluzione batterica attivata in una provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri, contenente un millilitro di soluzione fisiologica normale. Inoculare un volume appropriato della soluzione batterica su una capsula di Petri, utilizzando un anello di inoculazione monouso. Sigillare la capsula e incubarla in un'incubatrice anaerobica a 37 gradi Celsius.

Dopo 48 ore di incubazione, osservare le dimensioni, la morfologia e il colore delle colonie sulla piastra. Selezionare singole colonie batteriche distinte e coltivarle in provette da microcentrifuga da 10 millilitri, contenenti 4,5 millilitri di GAM fresco. Incubare in condizioni anaerobiche a 37 gradi Celsius per 24 ore per ottenere ceppi singoli.

Verificare l'attività dei singoli ceppi come descritto in precedenza ed eseguire la verifica dell'attività utilizzando l'HPLC. Un campione fecale su 10 ha dimostrato la capacità di deglicosilare l'orientina durante gli esperimenti di trasformazione, confermando la fattibilità dello screening per i campioni attivi.