Studio multimodale del rimodellamento cardiovascolare murino: ecografia quadridimensionale e spettrometria di massa

Il nostro laboratorio utilizza l'ecografia preclinica per studiare la biomeccanica cardiovascolare in varie malattie e stati fisiologici. Utilizziamo anche la spettrometria di massa per studiare la distribuzione spaziale dei lipidi nel tessuto cardiovascolare e cerebrale. Stiamo cercando di vedere dove nei tessuti ci sono cambiamenti funzionali e molecolari.

Sebbene le comuni tecniche di imaging molecolare, come l'istologia e l'immunoistochimica, possano fornire dati molecolari, sono limitate dalle colorazioni e dagli anticorpi attualmente disponibili. D'altra parte, l'imaging con spettrometria di massa è un approccio non mirato per gli studi multiomici che mantiene comunque l'integrità spaziale del tessuto. Con la nostra tecnica, possiamo espandere la multiomica per includere lipidi, glicani e peptidi e accoppiarli con tecniche di imaging funzionale, come gli ultrasuoni.

Con queste tecniche, i ricercatori possono ora accoppiare l'imaging funzionale con le tecniche di imaging molecolare. Nel nostro laboratorio, abbiamo due aree di interesse principali per le malattie cardiovascolari, e una di queste è il rimodellamento cardiaco con attacchi di cuore o trattamenti contro il cancro, quindi la cardiotossicità. E il nostro secondo grande obiettivo cardiovascolare è guardare all'invecchiamento e al modo in cui l'invecchiamento influisce sulla vascolarizzazione.

Per eseguire l'ecografia cardiaca quadridimensionale, posizionare il mouse in posizione supina sulla piastra ai fosfori. Quindi, posizionare il trasduttore nel supporto in una posizione semibloccata. Allineare il punto in rilievo sul trasduttore con il punto blu sullo schermo, posizionandolo verso il lato destro del mouse.

Ruotare il trasduttore per allinearlo lungo il piano sagittale del mouse con la tacca rialzata rivolta caudalmente. Applicare una generosa quantità di gel per ultrasuoni sulla superficie ventrale della cavità toracica per l'accoppiamento acustico con un trasduttore. Abbassare il trasduttore fino a quando non tocca il gel per ultrasuoni.

Effettua regolazioni precise con le manopole XY alla base della piastra per la messa a punto. Quindi, assicurati che la vista dell'asse lungo peristernale sullo schermo includa l'apice, il tratto di efflusso ventricolare sinistro e l'aorta, allineati orizzontalmente per un imaging accurato. Seleziona Nome immagine nell'angolo inferiore dello schermo per salvare l'immagine nella serie corrente.

Ruotare il trasduttore di 90 gradi in senso orario per ottenere una vista peristernale dell'asse corto. Assicurarsi che il ventricolo sinistro sia chiaramente definito nell'immagine e che i muscoli papillari siano visibili. Seleziona l'icona del cubo nell'angolo in alto a sinistra dello schermo per impostare un'immagine quadridimensionale.

Dopo aver resettato il trasduttore, regolare la posizione di partenza appena sotto l'apice e la posizione di arresto verso l'arco aortico. Impostate la dimensione del passo su 0,08-0,13 millimetri e la frequenza fotogrammi su 200-300 hertz. Assicurarsi che i segni vitali e il segnale ECG rimangano stabili prima di iniziare la scansione.

Dopo aver completato la scansione e l'elaborazione, attiva Salva dati EKV/4D e Respiration Gating per la post-elaborazione. Seleziona Nome immagine nell'angolo in basso a destra e includi l'ID del mouse nel nome. Per visualizzare ogni piano visivo del ciclo cardiaco, selezionare Altri controlli e scegliere Carica in quadridimensionale.

Esamina ogni vista piana del cuore, confermando che il centro del cuore rimane stabile per tutto il ciclo cardiaco. Per iniziare, prepara le barchette di alluminio per il congelamento rapido dei fazzoletti di topo. Usando una pinza, tendi la pelle del topo soppresso e taglia la pelle con le forbici sul collo per l'accesso vascolare o appena sotto lo sterno per l'accesso cardiaco.

Continua a tagliare la pelle e gli strati muscolari per esporre il sistema vascolare. Per la rimozione del cuore, tagliare l'osso per esporre il cuore. Usando la dissezione smussata con tamponi di cotone, isolare il cuore o il sistema vascolare dai tessuti circostanti, compreso il grasso.

Separare con cura il vaso carotideo dal nervo. Quindi, rimuovere il cuore o il sistema vascolare utilizzando strumenti chirurgici. Posiziona il vaso carotideo, il cuore e il sistema vascolare su una barchetta di alluminio pre-etichettata.

Quindi, immergere le barche nell'azoto liquido per il congelamento rapido. Per iniziare, riempi un becher con acqua HPLC e mettilo da parte insieme a siringhe da cinque e un millilitro. Quindi, impostare la temperatura del criostato a meno 25 gradi Celsius e inserire la lama.

Posizionare un paio di pinze all'interno della camera del criostato per farle raffreddare prima di montare il tessuto. Aspirare cinque millilitri di acqua HPLC in una siringa e metterla nel criostato per congelare parzialmente l'acqua. Prima che l'acqua nella siringa si congeli completamente, erogarla sul mandrino di metallo e lasciarla congelare completamente.

Ora, riempi una siringa da un millilitro con acqua HPLC e mettila nel criostato. Dopo 30-60 secondi, posizionare una piccola quantità di acqua parzialmente solidificata al centro del mandrino. Usando una pinza, posiziona rapidamente il cuore di topo estratto nella gocciolina d'acqua e tienilo lì fino a quando l'acqua circostante non è completamente congelata.

Per iniziare, rimuovere il vetrino con il cuore del mouse montato dal congelatore e metterlo in un essiccatore ad asciugare. Accendi lo spruzzatore HTX M3+. Apri l'app HTX sul laptop e, nel Metodo, imposta la temperatura dell'ugello a 75 gradi Celsius, la portata a 100 microlitri al minuto e la pressione a 10 psi.

Registrare il nome del campione, la polarità, la matrice, il solvente e la concentrazione nel quaderno di laboratorio. Quindi, calcolare la quantità di matrice necessaria per la concentrazione desiderata. Quindi, pesare la quantità desiderata di acido 2,5-diidrossibenzoico per la matrice modale positiva.

Sciogliere la matrice in metanolo al 70% in una provetta da 15 millilitri. Sonicare la soluzione della matrice per 10 minuti. Durante la sonicazione, rimuovere il vetrino dall'essiccatore.

Aprire la vaschetta dello spruzzatore. Quindi, posiziona la diapositiva nell'angolo in basso a sinistra e fissa i bordi con del nastro adesivo. Selezionare la regione di spruzzo del campione e chiudere il vassoio.

Utilizzando una siringa e un filtro, aspirare la soluzione della matrice nella siringa. Filtrare la soluzione di matrice attraverso la siringa nel flaconcino con il coperchio nero situato sul lato sinistro dello spruzzatore. Riposizionare la fiala nel punto designato sullo spruzzatore e inserire saldamente il tubo della linea D nella fiala.

Quindi, accendi il gas inerte e verifica che l'indicatore sullo spruzzatore indichi 10 psi. Premere Start e, una volta che lo spruzzatore raggiunge la temperatura impostata, selezionare il pulsante Start lampeggiante per iniziare a spruzzare. Al termine dello spray, rimuovere il campione dallo spruzzatore e posizionarlo nel supporto per vetrini MALDI.

Scansiona il supporto per vetrini MALDI e il vetrino utilizzando uno scanner. Salvare l'immagine su un'unità flash per utilizzarla con la spettrometria di massa. Selezionare l'opzione Lavaggio sullo spruzzatore e spostare la linea D dalla fiala della matrice al becher di scarto.

Infine, spruzzare il metanolo sulla vaschetta dello spruzzatore e pulirla. Spegni l'azoto. L'imaging con spettrometria di massa MALDI del tessuto miocardico infartuato ha identificato una massa di ioni molecolari con carica 577,52, probabilmente corrispondente a COHb in C o D, suggerendo un coinvolgimento nel rimodellamento miocardico.

L'ecografia quadridimensionale ha mostrato regioni miocardiche con meno del 20% di ampiezza tesa della superficie, visualizzate come tessuto verde-giallo, che indica zone infartuate. Nella vista dell'asse lungo del tessuto dell'infarto del miocardio, la delocalizzazione dei lipidi era visibile, complicando la correlazione tra la biomeccanica dei tessuti e la composizione molecolare.