Analisi della citometria a flusso dell'espressione dei fattori tissutali nelle piastrine umane

In questo protocollo, proponiamo un tutorial passo-passo per misurare il fattore tissutale associato alle piastrine mediante citometria a flusso sanguigno intero, valutando la proteina nel compartimento intracellulare, le condizioni di arresto e sulla superficie cellulare, sia in condizione di riposo che dopo l'attivazione Con un DP, uno dei più comuni fattori tissutali agonisti piastrinici è espresso da un sottogruppo di piastrine. Se le piastrine positive al fattore tissutale vengono misurate nel plasma ricco di piastrine PRP o nelle piastrine lavate, questo sottogruppo può essere perso durante la preparazione del campione. Questo rischio non si verifica quando questa valutazione viene eseguita in parete.

Il fattore tissutale associato alla piastrina è stato controverso sin dal primo rapporto pubblicato all'inizio del secolo a causa di problemi pre-analitici e metodologici. Questo protocollo fa luce su questi problemi e viene utilizzato anche per condurre un progetto internazionale supportato dalla Società Internazionale di Trombosi ed Emostasi ISDH per standardizzare la misurazione del fattore tissutale associato alle piastrine o la citometria del flusso sanguigno viene eseguita su pochi microlitri di sangue, consentendo l'analisi del fattore tissutale associato alle piastrine adatta in ambito clinico. Inoltre, la possibilità di fissare il campione e di etichettare successivamente, rende questa analisi fattibile per molti ospedali e laboratori.

Per iniziare, preparare una provetta per ogni volume di anticorpi. Per eseguire il test, aggiungere una goccia di perline negative e una goccia di perline positive a ciascuna provetta. Aggiungere 20 microlitri di ciascuna diluizione di anticorpi alla provetta e al vortice.

Incubare immediatamente le provette al buio a temperatura ambiente per 20 minuti. Quindi aggiungere un millilitro di PBS senza calcio e magnesio pH 7,4 a ciascuna provetta e vortice, capovolgere delicatamente il vacutainer citrato di sodio cinque volte per mescolare accuratamente il sangue e l'anticoagulante. Trasferire 50 microlitri di sangue in una provetta da 1,5 millilitri.

Quindi aggiungere 950 microlitri di aldeide paraforme all'1%. Mescolare delicatamente e incubare il campione per 90 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare ora il campione a 1.500 g per cinque minuti con una pausa a temperatura ambiente.

Dopo aver rimosso il surnatante Reese, sospendere il pellet in un millilitro di PBS senza calcio e magnesio. A pH 7,4, erogare 100 microlitri di sangue fisso in ciascuna provetta e centrifugarli a 1.500 G per cinque minuti. Con pausa a temperatura ambiente, quindi rimuovere il residuo surnatante.

Sospendere il pellet in 100 microlitri di Triton PBS allo 0,1% per permeare i campioni e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Per iniziare, preparare una provetta per la fluorescenza meno un controllo e una provetta per la colorazione del fattore tissutale. Aggiungere anticorpi a 100 microlitri di sangue intero fisso e permeabile in ciascuna provetta.

Aggiungere 300 microlitri di PBS senza calcio e magnesio a pH 7,4 in ogni provetta e mescolare. Quindi conservare i campioni colorati al buio fino a quando l'analisi della citometria a flusso non diluisce alfa CD 1 42 HTF un anticorpo monoclonale e Alexa Fluer 6 33 capra anti immunoglobulina G di topo in PBS senza calcio e magnesio. Quindi, preparare tre provette per campioni e dispensare PBS senza calcio e magnesio.

A pH 7,4, erogare 7,5 microlitri di alfa CD 1 42 htf un anticorpo monoclonale diluito e aggiungere cinque microlitri di adenosina difosfato. Capovolgere delicatamente il vacutainer citrato cinque volte per mescolare accuratamente il sangue e l'anticoagulante. Erogare cinque microlitri di sangue intero in ciascuna provetta.

Mescolare delicatamente i campioni e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Per il fissaggio del campione, aggiungere 300 microlitri di PFA all'1% a ciascuna provetta e centrifugare a 1.500 G per cinque minuti con pausa a temperatura ambiente. Una volta rimosso il surnatante, sospendere nuovamente il pellet in 90 microlitri di PBS senza calcio e magnesio.

A pH 7,4, mediante pipettaggio delicato, erogare cinque microlitri di Alexa Fluer 6 33 diluito di immunoglobulina G e cinque microlitri di alfa CD 41 PE in ciascuna provetta. Incubare i campioni per 15 minuti al buio a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 300 microlitri di PBS senza calcio e magnesio a pH 7,4 in ogni provetta e mescolare.

Per iniziare, creare un grafico a punti dell'area di dispersione diretta e laterale su una scala logaritmica che visualizza tutti gli eventi, creare un grafico a punti dell'area di dispersione laterale CD 61 A e laterale su una scala logaritmica che visualizza tutti gli eventi. Per visualizzare la popolazione piastrinica, impostare la soglia a circa 2000 sull'altezza di dispersione laterale e 1000 su quella per CP B sei 90 H.Regolare il guadagno PE Y 5 8 5 e per CP B sei 90 in base al controllo di qualità giornaliero e impostare la velocità di flusso su bassa. Ora disegna una regione tra 10 raggi alla potenza di tre e 10 raggi alla potenza di cinque chiamata CD 61 positivo.

Per identificare la popolazione piastrinica, duplicare l'FMO e rinominarlo TFIC. Acquisire i campioni e registrare un file di dati di 10.000 eventi all'interno del gate positivo CD 61. Crea un grafico a punti dell'area di dispersione diretta e laterale su una scala logaritmica che mostra tutti gli eventi.

Crea un grafico a punti CD 41 A e dell'area di dispersione laterale su una scala logaritmica che mostra tutti gli eventi. Quindi regola il guadagno di Alexa floor 6 33 e il guadagno PE wifi 5 8 5 in base al controllo di qualità giornaliero. Impostare la soglia approssimativamente a 1000 sull'altezza di dispersione laterale e a 2.500 su PEY 5 85 H.To visualizzare la popolazione piastrinica, impostare la velocità di flusso su bassa.

Ora disegna una regione tra 10 raggi alla potenza di quattro e 10 elevata alla potenza di cinque chiamata CD 41 positivo per identificare la popolazione piastrinica. Quindi creare una provetta per ogni campione e denominare TF non stimolato e TF stimolato. Acquisire i campioni e registrare un file di dati di 10.000 eventi all'interno della centrifuga a deambulazione positiva CD 41.

Il vacutainer di citrato di sodio 0,129 molare a 100 G per 10 minuti senza interruzioni a temperatura ambiente. Quindi rimuovere il vacutainer dalla centrifuga. Raccogliere il plasma ricco di piastrine ottenuto, trasferirlo in una provetta di polipropilene da 10 millilitri e registrare il volume raccolto, contare le piastrine due volte nel plasma ricco di piastrine utilizzando un contatore di cellule del sangue.

La popolazione piastrinica identificata mediante colorazione con anticorpi alfa CD 61 ha mostrato che circa il 26,8% delle piastrine circolanti conteneva fattore tissutale intracellulare L'analisi della citometria a flusso ha indicato che il fattore tissutale è espresso da circa il 2,8% delle piastrine a riposo e aumenta al 24,5% dopo l'attivazione con adenosina difosfato. È stato dimostrato che le piastrine di dimensioni maggiori esprimono livelli di fattore tissutale più elevati con i punti verdi che rappresentano il sottogruppo piastrinico più grande. L'analisi della citometria a flusso ha dimostrato che il plasma ricco di piastrine preparato utilizzando la centrifugazione di 100 g preserva una popolazione simile al sangue intero, conservando piastrine di dimensioni maggiori con una maggiore positività del fattore tissutale.

Una forza di centrifugazione più elevata ha portato a una perdita di piastrine positive al fattore tissutale più grande, come indicato dalla ridotta dispersione in avanti nella popolazione PRP.