Name: Interferenza dellRNA larvale nel baco da seta Bombyx mori attraverso la somministrazione di nanoparticelle di chitosano/dsRNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Scopri l'interferenza dell'RNA larvale nel baco da seta Bombyx mori mediante nanoparticelle di chitosano/dsRNA somministrate per via orale. Questo metodo facilita studi di regolazione genica e screening genico ad alto rendimento.

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<meta charset="utf8"></head><body>Alimentazione del dsRNA mediata da nanoparticelle per il silenziamento genico nelle larve del baco da seta

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Provetta da centrifuga da 1,5 mL</td><td>Sangon</td><td>F601620</td><td>per la reazione di dsRNA o nanoparticelle</td></tr><tr><td>10 &mu; l. pipetta</td><td>Eppendorf</td><td>P13473G</td><td>per aspirare o risospendere il liquido</td></tr><tr><td>100 &mu; l. pipetta</td><td>Eppendorf</td><td>Q12115G</td><td>per aspirare o risospendere il liquido</td></tr><tr><td>2,5 &mu; l. pipetta</td><td>Eppendorf</td><td>P20777G</td><td>per aspirare o risospendere il liquido</td></tr><tr><td>20 &mu; l. pipetta</td><td>Eppendorf</td><td>H19229E</td><td>per aspirare o risospendere il liquido</td></tr><tr><td>200 &mu; l. pipetta</td><td>Eppendorf</td><td>H20588E</td><td>per aspirare o risospendere liquidi</td></tr> a <tr><td>6 pozzetti Piastre a pozzetti multipli trasparenti trattate con TC Costar</td><td></td><td>3516</td><td>per l'allevamento di bachi da seta singolarmente</td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>A116165 di Aladino</td><td></td><td>per fare TAE</td></tr><tr><td>Agarosio M</td><td>BBI Life Sciences</td> A610013 <td>per l'elettrofosi su gel di agarosio</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia analitica</td><td>Sartorius</td><td>BSA224S</td><td>al peso ingredienti</td></tr><tr><td>Centrifuga&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td>Centrisart A-14C</td><td>per centrifugare per formare dsRNA o nanoparticelle</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3646</td><td>per combinare con dsRNA per la preparazione di nanoparticelle</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sangon</td><td>A500895</td><td>per fare TAE</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Aladino</td><td>E130059</td><td>per fare TAE, o per la precipitazione di dsRNA</td></tr><tr><td>Congelatore</td><td>Siemens</td><td>iQ300</td><td>per immagazzinare dsRNA o nanoparticelle</td></tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix</td><td>Promega</td><td>M712</td><td>per la reazione PCR</td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>per la reazione qRT-PCR</td></tr><tr><td>Isopropanolo&nbsp;</td><td>Aladdin</td><td>I112011</td><td>per la precipitazione del dsRNA</td></tr><tr><td>Spettrofotometro UV-Vis a microvolume NanoDrop</td><td>ThermoFisher</td><td>One</td><td>per determinare la concentrazione del ph metro di dsRNA</td></tr><tr><td></td><td>Sartorius</td><td>&nbsp; PB-10</td><td>per preparare tamponi Kit</td></tr> di <tr><td>purificazione del prodotto per PCR in colonna SanPrep</td><td>B518141 Sangon</td><td></td><td>per la purificazione del prodotto PCR</td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>per produrre 100 mM di tampone in acetato di sodio</td></tr><tr><td>Solfato di sodio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313</td><td>per produrre 100 mM di tampone solfato di sodio</td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express RNAi System</td><td>Promega</td><td>P1700</td><td>per la sintesi di dsRNA</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td>C</td><td>per la generazione di dsRNA o il riscaldamento di nanoparticelle</td></tr><tr><td></td><td>Tris Sangon</td><td>A501492</td><td>per fare TAE</td></tr><tr><td>Vortex.</td><td>IKA</td><td>Vortex 3</td><td>per preparare nanoparticelle di chitosano/dsRNA</td></tr></tbody></table>

interferenza dell'rna larvale nel baco da seta bombyx mori attraverso la somministrazione di nanoparticelle di chitosano/dsrna

Larval RNA Interference in Silkworm Bombyx mori through Chitosan/dsRNA Nanoparticle Delivery

Per valutare l'efficienza dell'RNAi, è stato scelto per l'analisi un gene immunitario che ha come bersaglio BmToll9-2 . Il gene BmToll9-2 è ben caratterizzato in laboratorio e il silenziamento genico mediante iniezione di dsRNA si traduce in larve più leggere e più piccole nella nostra recente pubblicazione20. Per confermare l'efficacia dell'RNAi mediante ingestione attraverso nanoparticelle di chitosano/dsRNA, sono state utilizzate nanoparticelle di chitosano come controllo e allo stesso tempo è stato confrontato il dsRNA nudo.
Rispetto al controllo, le nanoparticelle di chitosano senza dsRNA, il dsRNA nudo che ha come bersaglio il gene BmToll9-2 non mostra alcun effetto di silenziamento. L'alimentazione di nanoparticelle di chitosano/dsRNA nel baco da seta inibisce significativamente il trascritto, con un knockdown del 79% (Figura 1). L'inibizione del relativo trascritto indica che il gene BmToll9-2 è stato silenziato con successo attraverso l'ingestione di chitosano/dsRNA.
Il knockdown del gene BmToll9-2 influisce in modo significativo sulla crescita del baco da seta. Quando si osservano le larve, le larve silenziate da BmToll9-2 sono più piccole delle larve di controllo (Figura 2A). Quando si confrontano i bozzoli, anche i bozzoli silenziati BmToll9-2 sono più piccoli (Figura 2B). Le nanoparticelle di chitosano/dsRNA mostrano effetti RNAi di successo sia nel trascritto che nel fenotipo nel baco da seta.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67360/67360fig01v2.jpg"> Figura 1: Trascritto relativo di BmToll9-2 dopo l'ingestione di nanoparticelle chitosano/dsBmToll9-2 in larve di B. mori 5th instar. I livelli relativi di mRNA di BmToll9-2 nelle larve alimentate con nanoparticelle di chitosano come controllo, dsRNA nudo e nanoparticelle di chitosano/dsRNA. I dati sono stati rappresentati come medie ± deviazione standard di tre repliche biologiche. Per ogni replicazione biologica, c'erano tre repliche tecniche. Lettere diverse sulle barre indicano differenze significative in base all'analisi ANOVA unidirezionale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67360/67360fig01largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67360/67360fig02v2.jpg"> Figura 2: Osservazione del fenotipo dopo l'alimentazione con nanoparticelle chitosano/dsBmToll9-2. Le nanoparticelle di chitosano sono utilizzate come controllo. (A) La comparsa di larve di baco da seta dopo l'ingestione di nanoparticelle. (B) La comparsa di bozzoli di bachi da seta dopo l'ingestione di nanoparticelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67360/67360fig02largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Interferenza dell'RNA larvale nel baco da seta Bombyx mori attraverso la somministrazione di nanoparticelle di chitosano/dsRNA

The silkworm, Bombyx mori, is an important economic insect with thousands of years of history in China. Meanwhile, the silkworm is the model insect of ...

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