Misurazione dell'attività enzimatica degli enzimi deubiquitilanti associati a disturbi dello sviluppo neurologico tramite un saggio in vitro di scissione della catena dell'ubiquitina

Siamo interessati a definire le basi molecolari dei disturbi dello sviluppo neurologico associati a varianti geniche negli enzimi del sistema dell'ubiquitina. Utilizziamo tecniche all'avanguardia per sezionare le vie di segnalazione controllate da questi enzimi e per determinare l'impatto delle varianti geniche sulla biologia delle proteine. Il vantaggio di questo metodo è che si tratta di una tecnica indipendente dal substrato che non richiede una conoscenza preliminare dei substrati regolati da un DOB specifico.

In questo modo possiamo misurare direttamente l'impatto della varianza genica associata al disturbo dello sviluppo neurologico sull'attività catalitica del DUB e suggerire possibili meccanismi patogenetici. Poiché le funzioni cellulari della maggior parte dei DUB sono scarsamente comprese, il nostro laboratorio si concentrerà sull'identificazione delle vie di segnalazione mediate da questi enzimi e su come le varianti genetiche associate alle malattie genetiche influenzano questi processi. Per iniziare, scongelare 20 microlitri di cellule di Rosetta 2 Escherichia coli chimicamente competenti su ghiaccio immediatamente prima dell'uso.

Aggiungere da uno a 10 nanogrammi del plasmide di espressione pGEX6P1 USP27X e incubare per cinque minuti su ghiaccio. Shock termico delle celle per 30 secondi a 42 gradi Celsius in un bagno asciutto. Quindi incubare le cellule su ghiaccio per due minuti.

Aggiungere 80 microlitri di terreno SOC a temperatura ambiente alle celle. Incubare per 60 minuti a 37 gradi Celsius con rotazione di 200 giri/min in un agitatore da banco da banco a temperatura controllata con orbita da 19 millimetri. Quindi impiattare 50 microlitri di coltura su una piastra di agar LB, integrata con cloramfenicolo e ampicillina.

Incubare per 20 ore a 37 gradi Celsius, con il coperchio rivolto verso il basso, in un'incubatrice a temperatura controllata. Raccogli una singola colonia di batteri trasformati e aggiungila a 10 millilitri di terreno LB sterile integrato con cloramfenicolo e ampicillina. Incubare per 20 ore come mostrato in precedenza.

Quindi aggiungere 10 millilitri di coltura notturna a un litro di terreno tubercolare integrato con cloramfenicolo e ampicillina. Incubare fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge da 0,5 a 0,6. Successivamente, aggiungere 50-micromolare isopropil beta-d-1-tiogalattopiranoside alla coltura per indurre l'espressione.

Dopo aver raffreddato il campione a 16 gradi Celsius, incubare per 20 ore a 16 gradi Celsius con una rotazione di 200 giri/min. Quindi centrifugare le cellule per 20 minuti a 3000 G o superiore a quattro gradi Celsius per pellettare le cellule dalla coltura di espressione. Infine, conservare il pellet a meno 80 gradi Celsius per almeno un'ora.

Per iniziare, fissare la colonna di flusso a gravità vuota in un supporto per storte. Riempire la colonna con due o tre millilitri di resina di glutatione agarosio per purificare un pellet cellulare raccolto da un litro di coltura di espressione. Lavare la colonna con un letto di resina del 20% di etanolo.

Dopo aver lavato la colonna, scongelare il pellet della cella a quattro gradi Celsius. Aggiungere 30 millilitri di tampone MS500 al pellet scongelato e incubare con una leggera rotazione end-over-end. Ora sonicare le cellule lisate in una provetta da centrifuga da 50 millilitri su ghiaccio fino a quando il lisato scorre liberamente quando viene erogato da un puntale di pipetta.

Centrifugare per 30 minuti a quattro gradi Celsius e 20.000 G o superiore per eliminare il surnatante. Quindi decantare il surnatante in un becher e caricare il lisato chiarificato sulla colonna. Far scorrere il lisato attraverso la colonna per gravità mentre si raccoglie il flusso.

Successivamente, lavare la colonna con almeno due volumi di letto di resina di tampone di lavaggio MS500 e raccogliere il flusso di lavaggio in frazioni di cinque millilitri. Quindi, aggiungere un microlitro di ciascuna frazione a 100 microlitri di reagente Bradford per verificare la presenza di proteine. Recuperare la proteina facendo scorrere il tampone di elusione MS500 attraverso la colonna e raccogliendo frazioni di eluizione di cinque millilitri.

Per far precipitare la proteina, aggiungere due volumi di solfato di ammonio a quattro molari all'eluato e capovolgere delicatamente il tubo fino a quando non diventa torbido. Centrifugare per 30 minuti a quattro gradi Celsius e 20.000 g o superiore. Rimuovere il surnatante dopo ogni centrifugazione senza disturbare il pellet proteico.

Quindi risciogliere la proteina nel tampone MS500 integrato con glicerolo al 25% prima di conservarla. Preparare 10 microlitri di USP27X purificato marcato con GST in tampone di attivazione dell'enzima deubiquitinazione per ogni punto temporale per ciascun enzima deubiquitilante. Prima di aggiungere le catene di ubiquitina, aggiungere sette microlitri di tampone di caricamento SDS-PAGE al campione del tempo zero per evitare l'avvio della reazione di deubiquitinazione.

Ad ogni punto temporale per ogni enzima deubiquitilante, aggiungere 375 nanogrammi di catene di di-ubiquitina legate a K63 diluite in 10 microlitri di tampone di attivazione enzimatica. Incubare le provette a 30 gradi Celsius, fermando ogni punto temporale aggiungendo sette microlitri di tampone di caricamento SDS-PAGE. Eseguire SDS-PAGE utilizzando un gel sfumato dal 4 al 12%.

Il tipo selvatico USP27X ha scisso le catene di di-ubiquitina legate a K63 in mono-ubiquitina dopo un'ora di incubazione. La varianza associata a XLID-105 F313V, Y381H e S404N non ha scisso le catene di di-ubiquitina legate a K63 dopo un'ora di incubazione.