Name: Misurazione dellattività enzimatica degli enzimi deubiquitilanti associati a disturbi dello sviluppo neurologico tramite un saggio in vitro di scissione della catena dellubiquitina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Scopri come misurare l'attività degli enzimi deubiquitilanti associati a disturbi dello sviluppo neurologico tramite saggi di scissione della catena dell'ubiquitina. Questo metodo indipendente dal substrato permette di analizzare varianti genetiche.

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Il seguente protocollo può essere adattato per le proteine ricombinanti utilizzando vari tag di affinità espressi in diversi ceppi di cellule competenti. A seconda della proteina espressa, le condizioni di coltura e di espressione notturna possono richiedere l'ottimizzazione dell'OD600 all'induzione dell'espressione, al tempo di espressione, alla temperatura di espressione e alla concentrazione di IPTG. Una panoramica del protocollo è illustrata nella Figura 1. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella tabella dei materiali.
1. Trasformazione di cellule competenti di E. coli di Rosetta 2 con il plasmide ricombinante di espressione GST-USP27X
NOTA: Per mantenere la sterilità della coltura batterica, eseguire i passaggi in cui i contenitori dei terreni sono aperti sotto la fiamma di un bruciatore Bunsen. Per consentire un trasferimento ottimale dell'ossigeno, eseguire l'agitazione della coltura batterica in un agitatore da banco a temperatura controllata con un'orbita da 19 mm a 50 mm e una velocità di 200 giri/min29.
<ol>
	<li>Scongelare 20 μl di cellule di Rosetta 2 coli chimicamente competenti su ghiaccio immediatamente prima dell'uso. Aggiungere 1-10 ng del plasmide di espressione pGEX6P1-USP27X (codificante per USP27X marcato con glutatione-S-transferasi N-terminale (GST)30 e contenente resistenza all'ampicillina) e incubare 5 minuti su ghiaccio.</li>
	<li>Shock termico per 30 s a 42 °C in bagno asciutto. Incubare con ghiaccio per 2 min.</li>
	<li>Aggiungere 80 μl di terreno SOC a temperatura ambiente (RT). Incubare per 60 minuti a 37 °C con rotazione di 200 giri/min in un agitatore da banco con orbita da 19 mm a temperatura controllata.</li>
	<li>Piastra 50 μL di coltura su una piastra di agar LB integrata con 25 μg/L di cloramfenicolo e 50 μg/L di ampicillina. Incubare per 20 ore a 37 °C con il coperchio rivolto verso il basso in un incubatore a temperatura controllata.</li>
</ol>
2. Espressione batterica notturna di proteine ricombinanti da plasmidi di espressione
NOTE: Per mantenere la sterilità della coltura batterica, eseguire i passaggi in cui i contenitori dei terreni sono aperti sotto la fiamma di un bruciatore Bunsen. Per consentire un trasferimento ottimale dell'ossigeno, eseguire l'agitazione della coltura batterica in un agitatore da banco a temperatura controllata con un'orbita da 19 mm a 50 mm e una velocità di 200 giri/min29. Misurare la coltura OD600 utilizzando uno spettrofotometro.
<ol>
	<li>Preparare 1 L di Terrific Broth (TB) aggiungendo 47,6 g di TB Powder a 1 L di acqua ultrapura con glicerolo allo 0,4% in un pallone di coltura da 2 L. Autoclavare a medio per 30 minuti e raffreddare a RT.</li>
	<li>Prelevare una singola colonia di batteri trasformati e aggiungerla a 10 ml di terreno sterile LB integrato con 25 μg/L di cloramfenicolo e 50 μg/L di ampicillina. Incubare per 20 ore a 37 °C con rotazione di 200 giri/min in un agitatore da banco da 19 mm con orbita a temperatura controllata.</li>
	<li>Aggiungere 10 ml di coltura notturna a 1 litro di terreno TB integrato con 25 μg/L di cloramfenicolo e 50 μg/L di ampicillina (rapporto 1:100 tra coltura di partenza e coltura di espressione). Incubare a 37 °C con rotazione di 200 giri/min in un agitatore da banco con orbita di 19 mm a temperatura controllata fino a quando la coltura OD600 è compresa tra 0,5 e 0,6.</li>
	<li>Aggiungere 50 μM di IPTG alla coltura per indurre l'espressione, raffreddare a 16 °C e incubare per 20 ore a 16 °C con una rotazione di 200 giri/min.</li>
	<li>Cellule in pellet provenienti da coltura di espressione mediante centrifugazione per 20 minuti a ≥3.000 x g e 4 °C. Conservare il pellet a -80 °C per almeno 1 ora. NOTA: A questo punto, l'esperimento può essere messo in pausa e riavviato in un secondo momento (preferibilmente la stessa settimana). Il pellet può essere conservato a lungo termine a -80 °C.</li>
</ol>
3. Purificazione delle proteine mediante colonna di affinità gravità-flusso
NOTA: La resina, il legame, il lavaggio, l'eluizione e i tamponi di conservazione appropriati per ogni purificazione dipenderanno dalla proteina ricombinante da purificare. Raccogli campioni dal pellet cellulare, dal surnatante, dal flusso, dalle frazioni di lavaggio e dalle frazioni di eluizione nel tampone SDS-PAGE. Eseguire la colorazione SDS-PAGE e Coomassie per i campioni per valutare il successo della purificazione. Eseguire la purificazione a 4 °C e maneggiare le frazioni con ghiaccio. La scissione delle etichette proteiche può essere eseguita all'interno o all'esterno della colonna utilizzando la proteasi appropriata per colpire il sito di scissione specifico della proteasi pertinente.
<ol>
	<li>Fissare la colonna di flusso a gravità vuota nel supporto della storta e riempirla con resina di glutatione agarosio. Utilizzare 2-3 mL di resina per purificare un pellet cellulare raccolto da 1 L di coltura di espressione.</li>
	<li>Lavare la colonna con un volume di letto di resina al 20% di etanolo. Lavare la colonna 3 volte con un volume di letto di resina di tampone MS500 (20 mM di Tris pH 7,5, 500 mM di NaCl, 0,5 mM di TCEP). Arrestare la colonna in modo che la resina rimanga ricoperta di tampone per evitare che si secchi durante la preparazione del pellet della cella.</li>
	<li>Scongelare il pellet della cella a 4 °C. Aggiungere 30 mL di tampone MS500 (20 mM di Tris pH 7,5, 500 mM di NaCl, 0,5 mM di TCEP, 60 mg di lisozima e una compressa di inibitore della proteasi) al pellet scongelato. Limare per 30 minuti a 4 °C con una leggera rotazione da un capo all'altro.</li>
	<li>Sonicare le cellule lisate in una provetta da centrifuga da 50 mL o in un becher di metallo su ghiaccio fino a quando il lisato scorre liberamente quando viene erogato da un puntale di pipetta. Centrifugare per 30 minuti a 4 °C e ≥20.000 x g per eliminare il surnatante. NOTA: Determinare empiricamente le impostazioni del sonicatore. Impostare il sonicatore in modo tale che 120 s di tempo totale siano sufficienti per ridurre il lisato viscoso a un liquido libero e trasparente.</li>
	<li>Decantare il surnatante in un becher e caricare il lisato chiarito sulla colonna. Far scorrere il lisato attraverso la colonna mediante il flusso per gravità mentre si raccoglie il flusso. Caricare la colonna con il flusso raccolto ed eseguirla attraverso la colonna.</li>
	<li>Lavare la colonna con almeno due volumi di letto di resina di tampone di lavaggio MS500 (20 mM di Tris pH 7,5, 500 mM di NaCl, 0,5 mM di TCEP) 5 volte. Raccogliere il flusso di lavaggio in frazioni di 5 mL. Aggiungere 1 μl di ciascuna frazione a 100 μl di reagente Bradford per verificare visivamente la presenza di proteine. Lavare fino a quando le proteine non legate non sono più presenti nell'ultimo lavaggio, aggiungendo ulteriori fasi di lavaggio se necessario.</li>
	<li>Recuperare la proteina eseguendo il tampone di eluizione MS500 (tampone MS500 integrato con 10 mM di glutatione e 10 mM di NaOH) attraverso la colonna, raccogliendo 5 mL di frazioni di eluizione. Verificare la presenza di proteine aggiungendo 1 μL di eluato a 100 μL di reagente Bradford. Interrompere la raccolta delle frazioni quando il reagente di Bradford non indica più la presenza di proteine.</li>
	<li>Eseguire lo scambio del tampone mediante precipitazione e centrifugazione. Far precipitare le proteine aggiungendo 2 volumi di 4 M di solfato di ammonio all'eluato, invertendo delicatamente fino a quando non diventa torbido, quindi centrifugando per 30 minuti a 4 °C e ≥20.000 x g e di nuovo per altri 5 minuti. Rimuovere il surnatante dopo ogni centrifugazione senza disturbare il pellet proteico.</li>
	<li>Risciogliere e conservare le proteine in MS500 integrato con glicerolo al 25%. Conservare i pellet proteici o le proteine in un tampone di stoccaggio a -80 °C.</li>
</ol>
4. Saggio in vitro di scissione della catena dell'ubiquitina
NOTA: Selezionare la lunghezza della catena dell'ubiquitina e i tipi di legame in base alla specificità del DUB descritta nei rapporti precedenti31 o determinata empiricamente. Se necessario, questo protocollo potrebbe essere utilizzato per testare l'attività del DUB wild-type di interesse su un pannello di catene di ubiquitina disponibili in commercio di lunghezza e tipo di legame definiti. Una quantità di catena di di-ubiquitina di 375-750 ng e una concentrazione di DUB di 1-2 μM possono essere utilizzati come punti di partenza per il test27.
<ol>
	<li>Preparare 10 tamponi di attivazione DUB (500 mM di Tris-HCl pH 7,5, 500 mM di NaCl e 100 mM di TCEP).</li>
	<li>Per ogni punto temporale per ogni DUB, preparare 10 μL totali di 2 μM di GST-USP27X purificato in 1x tampone di attivazione DUB (miscela DUB). Prepara i master mix e dividili in punti temporali.</li>
	<li>Incubare la miscela DUB per 10 minuti a RT.</li>
	<li>Aggiungere 7 μL di tampone di caricamento SDS-PAGE al tempo 0 prima di aggiungere le catene di ubiquitina per evitare l'avvio della reazione di deubiquitinazione.</li>
	<li>Per ogni punto temporale per ogni DUB, aggiungere 375 ng di catene di di-ubiquitina K-63 diluite in 10 μL di tampone di attivazione DUB 1x. Il volume totale è di 20 μl per reazione.</li>
	<li>Incubare le provette a 30 °C, fermando ogni punto temporale con 7 μL di tampone di caricamento SDS-PAGE.</li>
	<li>Eseguire SDS-PAGE con un gel gradiente al 4%-12% e immunoblot 7,32 per ubiquitina e USP27X per analizzare la variazione della presenza di mono-ubiquitina in punti temporali selezionati.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67367/67367fig01v2.jpg"> 
Figura 1: Schema del disegno dello studio. (A) Trasformazione di cellule di E. coli competenti con plasmide di espressione proteica ricombinante. (B) Espressione batterica notturna della proteina deubiquitilasi ricombinante. (C) Purificazione proteica della deubiquitilasi ricombinante utilizzando una colonna di affinità a flusso gravitazionale. (D) Saggio in vitro di scissione della catena dell'ubiquitina per valutare l'attività deubiquitilante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67367/67367fig01largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<meta charset="utf8"></head><body>Valutazione delle varianti DUB nei disturbi del neurosviluppo utilizzando un test di clivaggio

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<li>Ebstein, F., Küry, S., Papendorf, J. J., Krüger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+disorders+%28NDD%29+caused+by+genomic+alterations+of+the+ubiquitin-proteasome+system+%28UPS%29%3A+the+possible+contribution+of+immune+dysregulation+to+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental disorders (NDD) caused by genomic alterations of the ubiquitin-proteasome system (UPS): the possible contribution of immune dysregulation to disease pathogenesis.</a> Front Mol Neurosci. 14, 733012(2021).</li>
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<li>Ritorto, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+DUB+activity+and+specificity+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Screening of DUB activity and specificity by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nat Commun. 5, 4763(2014).</li>
<li>Bustos, F., Bustos, F. Immunoblotting using precast gels. , protocols.io (2024).</li>
<li>Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+purification+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Overview of the purification of recombinant proteins.</a> Curr Protoc Protein Sci. 80, 6.1.1-6.1.35 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Amersham Protran 0.45 NC 200 mm &times; 200 mm 25/PK</td><td>Cytiva</td><td>10600041</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di ammonio</td><td>Fisher</td><td>Scientific AC205872500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760 25</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ubiquitina (monoclonale di topo)</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 646302, RRID:AB_1659269</td><td>(WB: 1:1000)</td></tr><tr><td>Anti-GST (policlonale di pecora)</td><td>Reagenti e servizi MRC-PPU</td><td>Cat# S902A Terzo sanguinamento</td> <td>(WB: 1:1000) https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/</td></tr> <tr><td>Flaconi di coltura defletti 2 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-042-5N</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Bradford</td><td>Millipore Sigma</td><td>B6916-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-105-25</td><td></td></tr><tr><td>Compresse complete per inibitori della proteasi</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td>5056489001</tr><tr><td>Econo-Colonna 1,5 & 5 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>7371507</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer F1.5&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-205</td><td></td></tr><tr><td>Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td>https://www.adobe.com/products/illustrator.html</td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>https://www.licor.com/bio/image-studio/ </td></tr><tr><td>Inkscape</td><td>Inkscape</td><td></td><td>https://inkscape.org/</td></tr> <tr><td>Invitrogen 4-12% NuPAGE 1mm 12 pozzetti gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (Isopropyl-b-D-Thiogalactopyranoside)</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-109</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG Antibody secondario</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>Cat# 926-32214</td><td>(WB: 1:10000)</td></tr><tr><td>IRDye 800CW Asino anti-topo IgG anticorpo secondario</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>Cat# 926-32212</td><td>(WB: 1:10000)</td></tr><tr><td>Isotemp Digital Dry Bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>88860022</td><td></td></tr><tr><td>K63 Di-Ubiquitin</td><td>South Bay Bio LLC</td><td>SBB-UP0072</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-119</td><td></td></tr><tr><td>LB Brodo</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-118</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Gold Biotechnology</td><td>L-040-100</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4000 Agitatore orbitale da banco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SHKE4000-7</td><td></td></tr><tr><td>MES-SDS Tampone di corsa</td><td>Boston Bioproducts Inc</td><td>BP-177</td><td></td></tr><tr><td>Mini Tube Rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-051</td><td></td></tr><tr><td>NuPage LDS Tampone per campioni 4x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Odissea&nbsp; Fc Imager</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>43214</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Plus Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26620</td><td></td></tr><tr><td>pGEX6P1 umano USP27X</td><td>MRC-PPU Reagenti e servizi</td><td>DU21193</td><td>https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/</td></tr> <tr><td>pGEX6P1 umano USP27X F313V</td><td>Addgene</td><td>225715</td><td>Koch et al 2024 (PMID: 38182161)</td></tr><tr><td>pGEX6P1 umano USP27X S404N</td><td>Addgene</td><td>225717</td><td>Koch et at 2024 (PMID: 38182161)</td></tr><tr><td>pGEX6P1 human USP27X Y381H</td><td>Addgene</td><td>225716</td><td>Koch et at 2024 (PMID: 38182161)</td></tr><tr><td>Pierce Glutatione Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16100</td><td></td></tr><tr><td>PMSF (Fenilmetilsulfonilfluoruro)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>P-470-10</td><td></td></tr><tr><td>Polisorbato 20 (Tween 20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC233360010</td><td></td></tr><tr><td>Rosetta 2 Cellule Competenti</td><td>Millipore Sigma</td><td>71402-M</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>SOC medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-216</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier 250</td><td>Branson</td><td>100-132-135</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC 6 Plus Centrifuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>TCEP (Tris-(carbossietil) fosfina cloridrato)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>TCEP10</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Brodo in polvere</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-225</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-146</td><td></td></tr><tr><td>Modulo XCell SureLock Mini-Cell e XCell II Blot&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EI0002</td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione dell'attività enzimatica degli enzimi deubiquitilanti associati a disturbi dello sviluppo neurologico tramite un saggio in vitro di scissione della catena dell'ubiquitina

Measuring Enzymatic Activity of Neurodevelopmental Disorder-Associated Deubiquitylating Enzymes via an In Vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay

Per determinare l'impatto delle varianti associate a XLID105 sull'attività catalitica di USP27X, le proteine USP27X wild-type marcate con GST e le varianti associate a XLID105 F313V, Y381H e S404N USP27X sono state purificate dai batteri. Queste varianti si trovano all'interno del dominio catalitico USP di USP27X (Figura 2A). Poiché in precedenza era stato riportato che USP27X scindeva le catene di ubiquitina K6331, le proteine USP27X wild-type e le varianti associate a XLID105 F313V, Y381H e S404N USP27X sono state incubate con catene di di-ubiquitina legate a K63 per 1 ora. Questi campioni sono stati separati tramite SDS-PAGE32 e le proteine ubiquitina e USP27X sono state analizzate tramite immunoblotting. USP27X wild-type induce la scissione della di-ubiquitina, generando mono-ubiquitina (Figura 2B e Figura 1 supplementare). Le proteine varianti F313V, Y381H e S404N USP27X associate a XLID105 non hanno scisso queste catene. Poiché le varianti F313V, Y381H e S404N interrompono l'attività catalitica di USP27X, l'interruzione funzionale di USP27X sembra essere il principale meccanismo alla base della XLID1057. In precedenza erano stati riportati ulteriori esperimenti di quantificazione e complementari7.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67367/67367fig02v2.jpg"> 
Figura 2: Impatto delle varianti di XLID105 sull'attività deubiquitilante di USP27X. (A) Diagramma della struttura della proteina USP27X umana, che mostra il numero di residui e la posizione delle varianti XLID105 valutate nel dominio USP (viola). (B) Le varianti USP27X e XLID105 wild-type marcate GST (F313V, Y381H e S404N) sono state incubate con catene di di-ubiquitina K63 per i tempi indicati. L'analisi immunoblot è stata eseguita utilizzando anticorpi anti-GST (USP27X) e ubiquitina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67367/67367fig02largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura 1 supplementare: Macchie non ritagliate della Figura 2B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67367/R1%20Koch%202024%20Jove%20supplemental%20Figure.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Misurazione dell'attività enzimatica degli enzimi deubiquitilanti associati a disturbi dello sviluppo neurologico tramite un saggio in vitro di scissione della catena dell'ubiquitina

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. ...

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Ubiquitinazione è una modificazione post-traslazionale chiave svolto da una serie di tre enzimi. Le mutazioni di geni coinvolti in questa modifica sono associati a diverse malattie umane. Qui, descriviamo i protocolli per rilevare ubiquitinazione delle proteine ​​in cellule in...

Rilevamento di proteine ​​Ubiquitinazione

Dettagli Il protocollo attuale un metodo per misurare l'attività degli enzimi funzionalmente omologo deubiquitinating. Sonde specializzate covalentemente modificano l'enzima e consentono il rilevamento. Questo metodo ha il potenziale di identificare nuovi bersagli terapeutici.

Metodo per la misurazione dell&#39;attività di Deubiquitinating enzimi in linee di cellule e tessuti Campioni

L'ubiquitinazione è una modifica post-traduzionale che svolge un ruolo importante nei processi cellulari ed è strettamente coordinata dalla deubiquitinazione. I difetti in entrambe le reazioni sono alla base delle patologie umane. Forniamo protocolli per condurre l'ubiquitinazione e la reazione di deubiquitinazione in vitro utilizzando componenti purificati.

In Vitro Ubiquitination e Deubiquitination Saggi di Istoni Nucleosomici

Questo protocollo è progettato per quantificare in modo efficiente l'attività del sistema upS (Ubiquitin-proteasome System) in diversi compartimenti cellulari del cervello dei roditori. Gli utenti sono in grado di esaminare il funzionamento dell'UPS nelle frazioni nucleari, citoplasmatiche e sinaptiche nello stesso animale, riducendo il tempo e il numero di animali necessari per eseguire queste complesse analisi.

Quantificare l'attività subcellulare ubiquitina-proteasoma nel cervello del roditore

Questo metodo descrive la valutazione dei cambiamenti globali nella topologia della catena di ubiquitina. La valutazione viene eseguita mediante l'applicazione di un approccio di proteomica mirata basato sulla spettrometria di massa.

Analisi della catena Ubiquitin mediante monitoraggio parallelo della reazione

Il presente studio fornisce protocolli dettagliati di test di ubiquitilazione in vitro per l'analisi dell'attività catalitica dell'ubiquitina ligasi E3. Le proteine ricombinanti sono state espresse utilizzando sistemi procariotici come la coltura di Escherichia coli.

In vitro Analisi della funzione E3 Ubiquitina ligasi

È stato sviluppato un metodo semplice e scalabile per valutare il significato funzionale delle varianti missenso in Ube3a, un gene la cui perdita e guadagno di funzione sono legati sia alla sindrome di Angelman che al disturbo dello spettro autistico.

Un metodo scalabile basato su celle per la valutazione funzionale delle varianti Ube3a

L'esperimento qui utilizzato mostra un metodo di docking molecolare combinato con tecnologie di sonda per prevedere e convalidare l'interazione tra piccole molecole della medicina tradizionale cinese e bersagli proteici.

Screening di composti della medicina tradizionale cinese per l'inibizione dell'attività di UCHL3 basati sulla tecnologia delle sonde enzimatiche molecolari e deubiquitinanti

Viene descritto un test ad alto rendimento per lo screening enzimatico. Questo kit di saggi multiplexato e pronto all'uso comprende substrati prescelti diC hromogenic Polymer Hydrogel (CPH) e substrati di C insolubileC iomogenico Biomass (ICB). Gli enzimi bersaglio sono gli endoenzimi che degradano i polisaccaridi e le proteasi.

High-throughput screening degli enzimi carboidrati di degradazione Utilizzando Novel insolubile Chromogenic Substrate Assay Kit

Chinasi cyclin-dipendente 1 (Cdk1) sono attivato nella fase G2 del ciclo cellulare e regola molte vie cellulari. Qui, presentiamo un protocollo per un'analisi in vitro della chinasi con Cdk1, che permette l'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici per stabilire obiettivi cellulari di questa chinasi importante.

Identificazione della chinasi Cyclin-dipendente 1 siti di fosforilazione specifico da una chinasi In Vitro test

Scopri come misurare l'attività degli enzimi deubiquitilanti associati a disturbi dello sviluppo neurologico tramite saggi di scissione della catena dell'ubiquitina. Questo metodo indipendente dal substrato permette di analizzare varianti genetiche.

Misurazione dellattività enzimatica degli enzimi deubiquitilanti associati a disturbi dello sviluppo neurologico tramite un saggio in vitro di scissione della catena dellubiquitina (Video) | JoVE Journal

Misurazione dell'attività enzimatica degli enzimi deubiquitilanti associati a disturbi dello sviluppo neurologico tramite un saggio in vitro di scissione della catena dell'ubiquitina

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